2022年3月16日，上海思路迪生物医学科技有限公司(以下简称“思路迪诊断”)研发生产的“新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）”，通过国家药品监督管理局审核获批上市，新型核酸检测试剂盒30分钟即出结果。

据悉此新品具备扩增时间更短(最短至30分钟)，灵敏度更高(最低检出限200拷贝/mL)，产品效期更长(12个月)等众多优势，对目前正在实施大规模核酸筛查地区及未雨绸缪为应对未来大规模筛查进行检测试剂储备的各级医疗机构均有显著意义。

国家药品监督管理局(NMPA)网查结果

该产品一经上市，思路迪诊断新型核酸检测试剂盒30分钟即出结果陆续得到了人民日报、()、新华社、()、央视新闻、CGTN、光明日报、中新社、中国日报、科技日报、解放日报、东方卫视、文汇报、新民晚报、新闻晨报等中央及地方权威主流媒的报道，在国内疫情反弹的当下，获得了整个社会和广大媒体的普遍关注。

作为医学检验领域的专业媒体之一，我平台亦收到多家医疗机构和经销商来函了解该产品详细情况。为更好的理解此款产品的特点，我们联系到两位在感染诊断领域的资深专家，请他们在百忙之中（他们正奋战在广东和上海两地抗疫一线）拨冗从临床应用以及工作实践的角度出发谈谈他们的看法。

陈伟烈教授，广州医科大学附属市八医院传染病研究所，主任技师，硕士研究生导师，华盛顿大学医学院访问学者。长期从事病毒学、免疫学等相关专业的科研和临床检测工作，在分子诊断方面工作经验丰富。近年来承担国家“十三五”重大科技专项任务级课题、广州市科信局科技惠民专项、广州市科技重点项目及广东省医学科研基金项目等科研课题各1项，参与国家“十一五”重大科技专项，以第一或通讯作者发表专业论著30余篇。

荧光定量PCR作为现阶段应用最为普遍且成本较为合适的分子诊断方法，一直被广泛应用于各类病原体的检测实践中。但实验室数量少、检测时间长，一直是困扰此技术发展的瓶颈。新冠疫情发生后，全国各地建设了一大批PCR实验室，原来实验室数量少的难题在很短时间就得到了解决。

分子诊断虽然灵敏度高，检测时间长却是其最大短板。既往许多公司开发快速的检测试剂盒，想要将检测时间进行压缩，一般都会在检测灵敏度方面进行妥协。所以，目前临床使用的各种新冠核酸检测产品为保证一定的检测灵敏度，均相较于其他病原体检测采用了更多的扩增循环数和更长的稳态停留时间。这就使得新冠核酸检测时间进一步被延长。

我在与该公司研发负责人就该产品快速灵敏的特点以及其他基本性能进行过多轮沟通后加入了临床样本验证项目，结果各项性能指标均达到了实验预期。

作为一名传染病专科医院从事病原体分子诊断的专业技术人员，深知检测报告出具时间对传染病及时诊断的重要性。更快速灵敏的检测产品可以缩短医疗机构就诊患者的报告等待时间，患者有可能在更短的时间内就拿到核酸检测报告。听闻近日该产品获得了国家药监局批准上市，希望思路迪诊断能为更多的医务工作者和患者带来方便。

宋志刚教授，上海市（复旦大学附属）公共卫生临床中心BSL-3实验室主任，中国认可委（CNAS）生物安全评审员，上海海关病原微生物风险评估员、上海市实验动物学会生物安全委员会委员，中国医学生物技术协会生物安全委员会委员，中华预防医学会生物安全与防护装备分会青年委员。主要从事生物安全、肠道病毒病原谱和致病机制研究，参与国家自然基金、国家重大专项、科技部863项目、生物安全科技专项等课题14项，在Nature、Lancet、EID、Journal

众所周知，荧光定量PCR技术是传染性病原体检测领域最为常见的技术之一。此轮上海疫情，为应对新冠奥密克戎较强的传染性以及更长的潜伏期，上海市采取了较大范围的核酸筛查。因此，短期内检测样本量激增，不少单位检测能力面临很大压力。之前我们使用的检测试剂盒通常完成一轮PCR反应需要80分钟甚至更久的时间。在进行思路迪此款新冠核酸检测试剂样本验证的过程中，我们发现使用该试剂30分钟即可完成PCR扩增全过程，同时检测灵敏度可以达到LoD 200 拷贝/mL。具体来讲，灵敏度、特异性以及阳性预测值和阴性预测值均表现出较好水平，总体符合率与临床诊断结果一致性好。

在保证检测性能的前提下，速度的提升带来的是检测能力的提升，以及对于仪器数量依赖性下降。这也正好满足了现阶段上海抗疫大规模核酸筛查的需要。同时核酸检测达到如此快速后，可以考虑在海关、边检等其他一些对检测时间要求较高的使用场景中得到应用。以往我们看到医学检验领域的创新多来自于一些海外巨头性企业，现在本土创新企业也能开发出这样的产品，难能可贵。思路迪诊断新型核酸检测试剂盒30分钟即出结果，希望更多快速灵敏的核酸检测试剂盒可以应用于新冠核酸筛查实践中，为众多医疗机构缓解海量样本带来的检测压力。也希望思路迪能再接再厉，开发出更多具有创新特质的检测产品，助力中国的检测事业实现更好的发展。

（责任编辑：董萍萍 ）

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通过提供客观证据对规定要求已得到满足的认定

通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到

定性：CNAS-GL039 《分子诊断检验程序性能验证指南》

定量：CNAS-GL037 《临床化学定量检验程序性能验证指南》

定性项目检验程序性能验证

CNAS-GL039 《分子诊断检验程序性能验证指南》

现用检测系统要素（仪器、试剂、校准品等） 变更

发生严重影响检测系统分析性能时，受影响部分的性能验证

常规使用期间，定期评审（基于分析系统的稳定性）

根据检测项目的预期用途及生产制造商声明，选择对检测结果质量有重要影响的参数进行验证

不同技术平台、样本类型以及预期用途不同时， 所需验证的性能指标宜有所侧重

PCR 定量：测量正确度、测量精密度（含测量重复性和测量中间精密度）、测量不确定度、分析特异性（含抗干扰能力）、分析灵敏度、检出限和定量限、线性区间（可报告区间）

PCR 定性：方法符某某、检出限、抗干扰能力、交叉反应

Sanger 测序和 NGS ：方法符某某和检出限

FISH：依据样本类型和预期用途，选用适宜的性能指标进行验证

如基于完整细胞的宜选用分析敏感性和特异性

基于组织的宜选用方法符某某

如果检验程序适用血清与血浆，检测时同时使用血清与血浆，应进行血清与血浆结果一致性的验证

肿瘤靶向基因检测，如果检验程序包括除肿瘤组织/细胞以外的样本（如血浆），应进行与肿瘤组织结果一致性的验证

如果检验程序高度依赖人工操作或判断，应进行不 同操作人员间的验证

三、性能验证的判断标准

厂商或研发者在试剂盒或检测系统说明书中声明的性能指标

基质：患者真实样本为佳，尽量与厂家建立性能指标时所用材料一致

质量：涉及病理形态学的样本（如组织、细胞学样本等）需确认符合相应要求

制定验证计划，了解验证方案

实验室设施及环境符合要求

若涉及核酸提取，应使用试剂盒配套或推荐的提取试剂，并确保其提取效率满足要求

实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证

已确认的检验程序：经NMPA批准的体外诊断医疗器械使用说明书中规定的程序，或国际公认标准或指南中规定的程序，或国家、地区法规中规定的程序

注：如果程序中含有与检验程序不适用的仪器、样本类型、检验方法（包括核酸提取方法）或分析软件的，则不属于已确认的检验程序

1.1 验证要求 通过与参比方法进行比较

1.2 参比方法 金某某方法、行业公认方法、经验证性能符合要求满足临床预期用途的方法（如：通过 ISO15189 认可实验室使用的相同检测方法）

“金某某”是指在现有条件下，公认的、可靠的、权威的诊断方法。临床上常用的“金某某”有组织病理学检查、影像学检查、病原体分离培养鉴定、长期随访所得的结论及临床常用的其他确认方法等。

a）样本：阴性样本至少 5 例、阳性样本（宜包含弱阳性/低扩增的样本）不少于 10 例

注 1：罕见或少见病种项目，可酌情减少样本例数

注 2：若弱阳性/低扩增样本不好获取，可用适当稀释阳性样本获得类似的效果

注 3：对于杂交检测技术，若弱阳性/低扩增样本不好获取，可用不同比例的特定细胞系混合获

得类似的效果。阴性样本中应包含与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似

b）验证方法：采用参比方法和候选方法平行检测，计算符某某

1.4 判断标准 厂商或研发者在试剂盒或检测系统说明书中声明的性能指标

指能连续在同一个标本中测到靶核酸的可能性在统计学上概率≥95%

2.1 验证要求 试剂说明书有声明检出限时，检测项目在有标准物质时，应进行检出限的验证

a）样本：定值标准物质（如：国际参考品、国家参考品、厂家参考品）

对于报告具体基因型的方法，选用的标准物质需包括所有的突变类型

― 对于对象同时含有不同比例的不同基因型时，应设置多个梯度，从扩增反应终体系总核酸浓度和突变

序列所占比例两个方面进行评价

b）验证方法：定值标准物质的样本梯度稀释（稀释液可选用厂家提供的稀释液或阴性血清）至厂家声明的检

出限浓度， 重复测定 5 次或不同批内重复测定20 次（如测定 5 天， 每天测定 4 份样本）

5 次重复检测，必须 100%检出靶核酸

20 次检测，必须至少18次检出靶核酸

3.1验证要求 验证与检测对象可能存在交叉反应的核酸物质对检测的影响

对于病原体核酸检测，与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体核酸，宜在病原体感染的医学决定水平进行验证

对于基因型检测，在待测核酸浓度验证其它基因型对待测核酸测定的影响

对于病原体核酸检测，取一定浓度与待测核酸可能存在交叉反应的病原体加入样本保存液或经确认为阴性的样本中，重复检测3次

对于基因型检测，取一定浓度经其它方法确认为其它基因型的样本，重复检测3次

3.3 判断标准 结果应为阴性

4.1 验证要求 干扰物质包括血红蛋白、甘油三酯、胆红素、免疫球蛋白G、类风湿因子和药物等。

方案 1：实验组为在弱阳性样本中加入干扰物质溶液（对照组加入等量的溶剂），终浓度与厂家声明相同，重复测定 3 次

方案 2：高浓度干扰物质且经确认不含被测物的临床样本作为实验组，低浓度干扰物质且经确认不含被测物的临床样本作为对照组。分别在实验组和对照组中加入弱阳性样本（量小于 10%），每组重复检测 3 次

方案 1：弱阳性样本检测仍为弱阳性，则验证通过

方案 2：对照组和实验组结果均为弱阳性，干扰物质对测定无显著影响

对照组结果为弱阳性，实验组结果为阴性，干扰物质对测定有显著影响

例1：新冠病毒核酸检测性能验证

重复性（精密度）：阴性/弱阳性样本。1*2*5*3，Ct值CV≤5%

符某某：15例临床样本（阴性5例、阳性10例），与参比方法比较，计算符某某

检测限：标准品稀释至1000copies/mL附近，重复检测5次，全部检出；或20次19次检出。

样本要求：阳性样本可用质控品代替、应有弱阳性

阴性样本应包含引起交叉反应的病原体

例2：定性项目性能验证-CA16核酸检测

重复性（精密度）：阴性/弱阳性样本。1*2*5*3，Ct值CV≤5%

符某某：15例临床样本（阴性5例、阳性10例），与测序/其他方法/实验室比较，计算符某某

检测限：200copies/ml附近样本，重复检测20次，18次检出

交叉反应：其他病原体感染样本各1例重复3次检测

例3：定性项目性能验证-BRAF基因突变

重复性（精密度）：突变频率弱阳性样本，10次，均能检出。

符某某：15例临床样本（阴性5例、阳性10例），与测序/其他方法/实验室比较，计算符某某。

检测限：用含有BRAF基因野生型的人类基因组DNA梯度稀释已知浓度的标准品，浓度至1%，检测5次，均能检出

交叉反应：10ng野生型人类基因组DNA，重复3次检测

例4：BRCA1/2基因突变检测性能验证

选择临床样本：1例突变阳性（如阳性不易得到，可采用企业参考品）、1例阴性，重复检测3次，检测3天，计算符某某。符某某 ≥ 90 %，则试剂盒重复性验证通过

使用经参考方法确认的已知阳性样本10例，阴性5例（所选择的样本应尽量包含常见的基因或检测类型的突变位点），比较两者结果的符某某，符某某≥ 90 %，则试剂盒准确度验证通过

选择阳性参考品稀释至50ng含有25%突变比例，按照厂家声明的测序深度对该系列浓度样本重复测定5次，5次全部检出，则50 ng DNA样品中含量低至25%的BRCA 1基因或BRCA 2基因突变的检测限验证通过

阳性样本中加入干扰物质溶液，终浓度与厂家声明相同（血红素＜175g/dL、胆红素＜ 1000XXXXXmol/L，甘油三酯＜ 20mmol/L），重复测定 3 次，结果不受影响，则说明抗干扰能力验证通过

参照 CNAS-GL037《临床化学定量检验 程序性能验证指南》

验证方式：偏倚评估、回收试验、与参考方法比对

1.1.1 样本 优先顺序选用

2) 标准物质（RM），如厂商提供的工作标准品

4) 正确度验证室间质评样本 根据测量区间选用至少2个浓度标准物质样本

1,1.2 验证方法 每个浓度标准物质样本每天重复测定 2 次，连续测定 5 天，计算偏倚

(偏倚 = 结果均值 ? 参考值)

1.2.1 样本 临床样本（基础样本）和被测物标准品

1.2.2 样本配制 通过称重法配制标准溶液，在临床基础样本中加入不同体积标准溶液

（标准溶液体积应少于总体积的10%），制备至少 2 个水平的样本（样本终浓度在

1.2.3 验证方法 每个样本重复测定至少 3 次，计算回收率

1.3 与参考方法比对

1.3.1 样本 临床样本，不少于8 份，被测物浓度在测量区间内均匀分布，并关注医学决

1.3.2 参考方法 公认的参考方法，如CNAS 认可的参考实验室使用的参考方法

1.3.3 验证方法 在相同时段内完成对同一样本的两种方法平行检测，每份样本每个检

测方法重复检测 3 次，计算偏倚

无法开展正确度验证时，可通过参加能力验证、比对试验， 证明其测量结果与同类实验室结果的一致性。如与 CNAS 认可的 PTP（或可提供靶值溯源性证明材料的 PTP）提供的 PT 项目结果进行比对，或与 CNAS 认可的实验室使用的经性能验证符合要求的在用检测程序进行比对

2.1 样本 不少于 20 份，被测物浓度在测量区间内均匀分布， 并关注医学决定水平。 使用 PT 样本

2.2 参比系统 经验证分析性能符合预期标准，日常室内质控、室间质评/能力验证合格的检测系统。

优先选用符合以上要求的 CNAS 认可实验室的检测系统

2.3 验证程序 按照 WS/T 492-2016 规定的方法进行验证。实验系统均值与参比系统均值的差异在

可接受范围内。 检测 PT 样本时，每个样本应重复测定不少于 3 次

包括重复性和中间精密度

3.1 样本 新鲜或冻存样本。当样本中待测物不稳定或样本不易得到时，可使用质控品。至

少评估 2 个水平样本，浓度在测量区间内，适宜时，至少有1个在医学决定水平

注 1：对低值有临床意义的检测项目，宜评估有判断价值的低水平样本的不精密度

注 2：如检测结果没有明确的医学决定水平，可在参考区间上限左右选一个浓度，再根据检验项目的

特点在测量区间内选择另一个浓度

注 3：如与厂商或文献报导的不精密度比较，所选样本水平宜与被比较的样本水平接近

3.2.1 试剂和校准品应使用同一批号

3.2.2 验证方法 对样本进行至少 10 次重复测定，计算均值、SD 和 CV

质量控制 当质控结果在控时，数据才可用

数据收集 检查由偶然误差引起的离群值。任何结果与均值的差值（离均差）。超过

4SD 时，可认为是离群值。进行重复性评估实验时，若离群值数量>1，应

怀疑是否为方法不稳定或操作者不熟悉所致，解决问题后再进行新的评估实验

数据分析 依据实验数据计算均值和标准差

3.3 同时验证重复性和中间精密度

3.3.1 验证方法 每天检测 1 个分析批，每批检测 2 个水平的样本，每个样本重复检

3.3.2 数据收集 在进行数据分析前，可参考 WS/T 492-2016，检查数据中由偶然

4.1 样本 基质与临床样本相似，在已知线性区间内选择 5～7 个浓度，应覆盖定量限（低限和高限）

4.2 样本准备 将高浓度样本与低浓度样本按预定比例进行稀释得到系列样本

4.3 验证方法 每个浓度的样本重复测定 3～4 次

4.4 数据分析 分别计算每个样本检测结果的均值，排除离群值

4.5 多项对数据组进行多项回归分析

4.7 判断标准 检测样本的最低值和最高值之间为线性区间应满足厂商声明

包括可报告低限（定量下限）与可报告高限（定量上限XXXXX最大稀释倍数）

5.1 样本 与待测样本基质相同

5.2 样本准备 以血清样本为例

低值样本准备：将待样本用混合人血清 或 5%牛血清白蛋白生理盐水溶液进行稀释，产生接近于测量区间低限（定量下限）浓度样本，通常为 3～5 个浓度，浓度间隔应小于测量区间低限的 20%

高值样本准备：用混合血清或 5%牛血清白蛋白生理盐水溶液或测定方法要求的稀释液对高值待测样本稀释，使其接近于线性范围的上 1/3 区域内，记录稀释倍数。至少选用 3 个浓度样本

5.3 验证方法 每个低值样本重复测定 5～10 次，每个高值样本重复测定 3 次

5.4 数据分析 分别计算每个低值样本的均值、SD、CV 值。 对高值样本，计算乘以稀释倍数后的还原浓

5.5 可报告范围的确定

5.5.1 可报告范围低限（定量下限） 从低值样本结果数据中选取总误差或不确定度

等于或小于预期值的最低浓度水平作为可报告范围低限

5.5.2 可报告范围高限 测量区间的高限 x 最大稀释倍数

还原浓度与理论浓度的偏差（%）等于或小于方法预期偏倚值时的最大稀释倍

数为推荐的最大稀释倍数

6.1 样本 被测量水平不同的 2 个样本为基础样本，可参考医学决定水平或参考区间限值

6.2 干扰物质选择 至少应考虑样本中血红蛋白（溶血）、胆红素（黄疸）、甘油三酯（脂血）

6.3.1 干扰物原液中干扰物的浓度应高于实验浓度 20 倍以上，以减少对基础样本基质的稀释作用

6.6.3.3 重复检测（n≥3)实验样本和对照样本，分别计算 2 组结果均值，和均值间的差值

6.4 判断标准 满足干扰标准时的最高干扰物浓度，应符合检测方法规定的要求

7.分析灵敏度（检测限）

在分子检测领域，分析灵敏度指该分子检测技术能测到生物标本中待测靶核酸分子的最低含量

7.1 样本要求 - 低浓度参考物质

- 已知浓度的样品适当稀释成3-5个低浓度实验样品

7.3 判断标准：95%以上能检出且CV%在在允许范围内

例：定量项目性能验 >>>>>>内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。<<<<<< 以申请注册的验证报告代替性能验证报告

- 验证实验拷贝其他实验室的验证数据

- 验证试验由厂家工程师完成

- 标本浓度：定量未覆盖测量范围、定性缺弱阳性（厂家提供）

- 标本种类：未覆盖将用于临床检测的标本种类、或未采用原始标本而采用DNA

- 标本数量：涉及的标本种类一起验证符某某，导致标本数量未达规定要求

符某某验证时未覆盖试剂所涉及的病原体或突变类型

分子检测方法学性能验证

- 证明检测系统能否满足预期用途？

- 检验程序常规应用前

- 现用检测系统要素（仪器、试剂、校准品等） 变更

- 使用该检测系统的实验室

- 使用该检测系统的实验室的检测人员

- 定量项目：精密度、正确度、线性范围、检出限

- 定性项目：精密度、符某某（方法学比较）、检出限

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