酵母rna的提取及组分鉴定结果分析(浓盐法)中的两次离心保留的是上清还是沉淀,为什么?

由于RNA的来源和种类很多,因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层被酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出,此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA,用这两种方法所提取的核酸均为变性的 RNA,主要用作制备核苷酸的原料,其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液,90℃提取3-4h,迅速冷却,提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解,然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解,从水解液中可用定糖,定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。
苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液:称取6g苔黑酚溶于95%乙醇100mL。
17%硫酸:将17mL浓硫酸(比重1084)缓缓倾入83mL水中;
2.5%鉬酸铵:2.5g鉬酸铵溶于100mL水中;
10%抗坏血酸溶液:10g抗坏血酸溶于100mL 水,棕色并保存溶液;
临用时将三种溶液和水按下列比例混合:
17%硫酸:2.5%鉬酸铵:10%抗坏血酸:水=1:1:1:2(V/V)。
称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶,沸水浴加热30min,冷却,转入离心管。3000转/分,离心15分钟后,将上清慢慢倾入 10mL酸性乙醇,边加边搅动。加毕,静置,待RNA沉淀完全后,3000r/min离心3min。弃去上清液。用95%乙醇洗涤沉淀两次。再用***洗涤沉淀一次后,用***将沉淀转移至布氏漏斗抽滤,沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量,计算:

取2g提取的核酸,加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加热10分钟制成水解液,然后进行组份鉴定。
1.嘌呤碱:取水解液1mL 加入过量浓氨水。然后加入1mL 0.1M硝酸银溶液,观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。
2.核糖:取水解液1mL,三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。
3.磷酸:取水解液1mL,加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。

动物肝脏中DNA的提取和鉴定

1.学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。

2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。

3.学习核酸染色的方法。

为了研究DNA分子在生命代谢中的作用,常常需要从不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物体内的分布及浓度不同,要选择适当的材料提取DNA。动植物中小牛胸腺、动物肝脏、脾脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。微生物中,谷氨酸菌体含7%~10%,面包酵母含4%,啤酒酵母含6%,大肠杆菌9%~10%。

从各种材料中提取DNA方法不同,分离提取的难易程度也不同。对于低等生物,如从病毒中提取DNA比较容易,多数病毒DNA相对分子量较小,提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA难度大些。细菌DNA相对分子质量较大,一般达2×109Da。因此易被机械张力剪短。细菌DNA,除核DNA外,还有质粒DNA等。

生物遗传信息复制的模板和基因转入的模板,是生命遗传繁殖的物质基础,也是个体生命活动的基础;作为DNA分子中的某一区段,有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。

核酸(nucleic acid)是以核苷酸为基本组成的生物大分子。天然存在的核酸有两类,一类为脱氧核苷酸(deoxyribonucleic acid,DNA),另一类为核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)。DNA存在于细胞核和线粒体中,携带遗传信息。RNA存在于细胞质和细胞核内,参与细胞内DNA遗传信息的表达。

天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞核中提取DNA时,先把DNP抽提出来,再把P除去,再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等,从中分离DNA。DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解,如在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低,仅为在水中溶解度的1%,随着盐浓度的增加溶解度也增加,至1mol/L氯化钠中溶解度很大,比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小,在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此在提取时

大肠杆菌和植物基因组DNA提取

1.大肠杆菌DNA提取方案设计

学习并掌握细菌基因组的提取方法

提取大肠杆菌DH5α中的DNA并进行质量检测

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K的溶液中消化***蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

实验材料:大肠杆菌DH5α菌液

实验仪器与用具:微量移液器,低温离心机,水浴锅,eppendorf管,恒温摇床

(1)将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌液5000rpm冷冻离心10分钟弃上清;

目的:分离大肠杆菌与其培养液。

目的:盐析。NaCl降低DNA在水中的溶解度且不破坏其结构,从而提取粗的DNA。在浓氯化钠(1-2M)溶液中, DNP 的溶解度很大, RNP 的溶解度很小;在稀氯化钠(0.14M)溶液中, DNP 的溶解度很小, RNP 的溶解度很大;0.14MNaCl-0.01MEDTA溶解RNP,而使DNP沉淀。

目的:CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀。通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白,多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

实验名称:质粒扩增、提取和鉴定实验

实验目的 通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作,加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。

实验仪器设备:电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液***若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。

实验原理:质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中,通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状DNA在外界环境恢复正常的时候不能够复性 而质粒DNA可以复性,从而可以实现质粒DNA和染色体DNA的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的DNA系列之内或其附近的特异位点上,并切割DNA。当对提取的质粒DNA进行电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

(1)普通LB固体培养基制备:

制备LB培养基,倒入灭菌瓶中高压灭菌,待完全冷却后,保存备用。

(2)将大肠杆菌接种于LB培养基中,37℃振荡培养过夜(200转/分)

二 质粒DNA的提取(碱法)

1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中, 12000rpm离心一分30秒,弃去上清液,以得到较多的细菌沉淀;

2、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上,使离心管底部的液体流尽。

3、 加入100μl用冰预冷的溶液I,剧烈振荡,将沉淀彻底悬浮,然后室温放置5分钟。

4、 加入200μl现配的溶液II,盖紧管口,轻轻快速颠倒离心管(不要振荡,以避免DNA断裂),使混合物混匀,冰浴5~10分钟。

5、 加入150μl预冷的溶液III,盖紧管口,温和颠倒混匀,使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中,冰浴5分钟。

6、 取上部水相,移入新的离心管,加入2倍体积预冷的无水乙醇(也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠),震荡混匀,室温放置10分钟沉淀双链DNA,然后4℃,12000rpm离心10min。

实验六:动物肝脏中DNA的提取及定量测定

1、学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术。

2、了解常见生化组分提取技术。

3、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。

核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在,其中DNA主要存在于细胞核中,RNA主要存在于核仁及胞质中,在制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下(4℃)进行,必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)等可以抑制DNA酶活性,皂土可抑制RNA酶活性,同时SDS或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。

动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液(如1mol/L NaCl),但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度很低,而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液,可利用不同浓度的氯化钠溶液,将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。

将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理,DNA即与蛋白质分开,可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去,而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇,DNA即呈纤维状沉淀出来。

DNA分子中的脱氧核糖基,在酸性溶液中变成w-羟基-r-酮基戊醛,与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物(λmax=595nm)。

在DNA浓度为20~200μg/ml范围内,吸光度与DNA浓度成正比,可用比色法测定。

猪肝,分光光度计(595nm),比色杯,匀浆器,量筒(50ml、10ml),离心机(5000r/min),离心管,试管及试管架,移液管(1.0ml、2.0ml、5.0ml),恒温水浴锅

氯化钠,柠檬酸钠,95%乙醇,SDS,氯仿,异戊醇,二苯胺试剂,DNA标准溶液(200μg/m1),二苯胺试剂等。

课程名称: 生化实验甲 指导老师: 成绩:__________________ 实验名称:植物基因组DNA的提取 实验类型: 生化定性实验 同组学生姓名: 及纯度与含量的测定 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握植物基因组DNA的提取原理和方法; 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作; 3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA结果的初步分析; 4、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法; 5、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量的方法。 二、实验基本原理 植物基因组DNA的提取方法就其提取原理主要有二种:十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠 (SDS)法。十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和

核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物基因组 DNA溶液。

由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导DNA降解,而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题,这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的CTAB-DNA提取法步骤多,较烦琐,DNA产率低,而且由于酚很难完全去除,容易影响以后的酶切等工作的效率。SDS法操作简单,温和,也可提取到较高分子量DNA,但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响DNA的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

注:1、报告内的项目或内容设置,可根据实际情况加以调整和补充。

2、学生提交实验报告时间为实验后10日内。

学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术

核酸和蛋白在生物体中以核蛋白的形式存在,其中DNA主要存在细胞核中,RNA主要存在于核仁和细胞质中,在制备核酸时应防止过酸、过碱及其它引起核酸降解的因素。必要时还要加入DNA酶抑制剂。

动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液(1~2mol/L NaCl),将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理,DNA即与核蛋白分开,可用氯仿—异戊醇将蛋白质沉淀除去,而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇,DNA即成纤维状沉淀出来。

含有脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴***热10分钟后,产生蓝色这是因为DNA嘌呤核苷酸的脱氧核糖遇酸生成酮基戊醛。它再和二苯胺作用产生蓝色物质。

器材:动物肝脏、离心机、试管、离心管、玻璃棒

试剂:0.1mol/L氯化钠—0.05mol/L柠檬酸钠缓冲溶液、氯仿—异戊醇混合液(20:1)、5%SDS、95%乙醇、二苯胺试剂、固体NaCl.

1. 称去肝脏4g,放在培养皿中,用剪刀剪碎,再研磨6次,并分6次加入6ml氯化钠—柠

檬酸缓冲溶液,装在10ml的离心管中。将匀浆物放在4000r/min下离心10min。

2. 把上述沉淀转入20ml大试管中,加入6ml氯化钠—柠檬酸钠缓冲液、3ml氯仿—异戊

醇混合液、0.5mlSDS使其浓度为0.41%,手摇15min,然后缓慢加入NaCl(约0.55g)使其终浓度为1ml/L。慢摇5min,使氯化钠充分溶解。

3. 将上述混合液在4000r/min离心15min,取上清液于50ml烧杯中加入等体积冷95%乙醇,

边加边用玻璃棒慢慢搅动,将缠绕在玻璃棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇,即得DNA粗品。(注意不要让样品过分干燥)用蒸馏水溶解至2ml。

《DNA和RNA提取常见问题分析及对策》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DNA和RNA提取常见问题分析及对策(45页珍藏版)》请在人人文库网上搜索。

DNA和和RNA提取提取常见问题分析及对策常见问题分析及对策第二部分:第二部分:DNA提取常见问题分析及对策提取常见问题分析及对策第一部分:第一部分:DNA提取方法简介提取方法简介DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象。为信息分子,是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达,获得高分子了进行测序、杂交和基因的表达,获得高分子量和高纯度的量和高纯度的DNA是非常重要的前提。是非常重要的前提。q 保证DNA结构的完整性q 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质q 排除有机溶剂和金属离子的污染q 蛋白质、多糖、脂类等降

2、低到最低程度q 排除其他核酸分子的污染q 染色体染色体DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它q 非染色体非染色体DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法qCTAB法原理法原理(植物(植物DNA提取经典方法)提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。物。

3、该复合物在高盐溶液中(该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注:注:CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15。qCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;)提供一个缓冲环境,防止

4、核酸被破坏;EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子,抑制离子,抑制DNase活性;活性;NaCl 提供一个高盐环境,使提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;充分溶解,存在于液相中;CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多

5、酚,减少物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。有效去除多糖。qCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液q SDS法原理法原理SDS是一种阴离子去垢剂,在高温(是一种阴离子去垢剂,在高温(5565)条件下能裂解细)条件下能裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;提高盐提高盐(KAc或或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖浓度并降低温度(

6、冰浴),使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;杂质沉淀,离心后除去沉淀;上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。q SDS SDS法流程图法流程图 (以动物组织为例)(以动物组织为例) 动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液 物理方式物理方式:玻璃珠法、:玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法 化学方式化学方式:异硫氰酸胍法、碱裂解法:异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式生物方式:酶法:酶法q根据细胞裂

7、解方式的不同有:根据细胞裂解方式的不同有:吸附材料结合法:吸附材料结合法:q根据核酸分离纯化方式的不同有:根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸,低盐高值结合核酸,低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸,高盐低值结合核酸,高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物,从而达到分离目的。物,从而达到分离目的。浓盐法浓盐法:有机溶剂抽提法:有机溶剂抽提法:密度梯度离心法:密度梯

8、度离心法:利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离在盐溶液中溶解度不同,将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物q碱裂解法原理碱裂解法原理 染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多,且染色体分子大得多,且染色体DNADNA为为线状分线状分子,而质粒子,而质粒DNADNA为共价闭合环状分子;为共价闭合环状分子; 当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时,线状染色体溶液时,线状染色体DNADNA容易发生变性,共容易发生

9、变性,共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象;时即恢复其天然构象; 变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒淀,而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中,从而可通过离心将两者分开。q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液q

10、煮沸法原理煮沸法原理 染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多,且染色体分子大得多,且染色体DNADNA为为线状分线状分子,而质粒子,而质粒DNADNA为共价闭合环状分子;为共价闭合环状分子; 当加热处理当加热处理DNADNA溶液时,线状染色体溶液时,线状染色体DNADNA容易发生变性,共容易发生变性,共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象;在冷却时即恢复其天然构象; 变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒淀,而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分

11、子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中,从而可通过离心将两者分开。q差速离心法原理差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进行离心,比重大的物质优先沉降,比重小的却处于上层,行离心,比重大的物质优先沉降,比重小的却处于上层,从而得以分离。从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器,自身可编码蛋线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器,自身可编码蛋白,它们的白,它们的比重和大小一定,因而在同一离心场内的沉降速度比重

12、和大小一定,因而在同一离心场内的沉降速度也一定,根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各也一定,根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来。种组分分级分离出来。第一部分:第一部分:DNA提取方法简介提取方法简介内容内容第二部分:第二部分:DNA提取及常见问题分析提取及常见问题分析I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质沉淀或吸附核酸,并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中最好使用新鲜材料,低温保最好使用新鲜材

13、料,低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时,要时,要选择有核细胞(白细胞)选择有核细胞(白细胞)组培细胞培养时间不能过长,组培细胞培养时间不能过长,否则会造成否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少,提取前先富集少,提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体使用处于对数期的新鲜菌体(老化菌体导致开环质粒增加)(老化菌体导致开环质粒增加)培养时应加入筛选压力,否则培养时应加入筛选压力,否则菌体易污染,质粒易丢失菌体易污染,质粒易丢失尽量选择高

14、拷贝的质粒,如为尽量选择高拷贝的质粒,如为低拷贝或大质粒,则应加大菌低拷贝或大质粒,则应加大菌体用量体用量菌株不要频繁转接(质粒丢失)菌株不要频繁转接(质粒丢失)材料应适量,过多会影响裂解,材料应适量,过多会影响裂解,导致导致DNA量少,纯度低量少,纯度低针对不同材料,选择适当的裂针对不同材料,选择适当的裂解预处理方式:解预处理方式:植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时,定时轻柔振荡高温温浴时,定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒D

15、NADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净,同时保证菌培养基去除干净,同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长(变性的时间不要过长(5分钟),分钟),否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长,否则会复性时间也不宜过长,否则会有基因组有基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取,应先菌、酵母质粒的提取,应先用酶法或机械法处理,以破壁用酶法或机械法处理,以破壁采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提时,应提供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系采用有机(酚采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但氯仿)抽提时应充分混匀,但动作

16、要轻柔动作要轻柔离心分离两相时,应保证一定的转速和时间离心分离两相时,应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方法应的去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取q 蛋白质的去除:蛋白质的去除: 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提 使用变性剂变性(使用变性剂变性(SDSSDS、异硫氰酸胍等)、异硫氰酸胍等) 高盐洗涤高盐洗涤 蛋白酶处理蛋白酶处理q 多糖的去除:多糖的去除: 高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5M NaCl5M

17、NaCl,高盐可溶解多糖。,高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积) ),氯苯可,氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 。 用用PEGPEG代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA:在:在500L DNA500L

18、酚类氧化的试剂:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂:如加入易与酚类结合的试剂:如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) ),它,它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNADNA的结合的结合q 盐离子的去除:盐离子的去除: 7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤当沉淀时间有限时,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀,当沉淀时间有限时,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀,沉淀会更充分沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaOAc(pH5.2,3M),有),有

19、利于充分沉淀利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤,以除去盐离子等的乙醇洗涤,以除去盐离子等晾干晾干DNA,让乙醇充分挥发(不要过分干燥),让乙醇充分挥发(不要过分干燥)若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子,抑制离子,抑制DNasepH值为值为8.0,可防止,可防止DNA发生酸解发生酸解 基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取 提取的基因组提取的基因组DNA片段在片段在20kb30kb之间之间高质量的基因组高质量的基因组DNA带型带型 单一无拖尾现象单一无拖尾现象DNA浓度及纯

q问题一:问题一:DNADNA样品不纯,抑制后续酶解和样品不纯,抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质DNADNA在溶解前,有酒在溶解前,有酒精残留,酒精抑制精残留,酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子有有RNARNA的存留的存留 原因原因对对策策重新纯化重新纯化DNADNA,过吸附,过吸附柱去除蛋白、多糖、柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质多酚等杂质重新沉淀重新沉淀DNADNA

21、,让酒精,让酒精充分挥发充分挥发增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数(次数(2-32-3次)次)加入加入RNaseRNase降解降解RNARNAq问题二:问题二:DNADNA降解。降解。材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈,烈,DNADNA被机械打断被机械打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染反复冻融反复冻融 原原因因对对策策尽量取新鲜材料,低温保存材料避尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液在提取内

22、源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNADNA时,可增加裂解液中螯合剂时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔尽量轻柔所有试剂用无菌水配制,耗材经高所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌温灭菌将将DNADNA分装保存于缓冲液中,避免分装保存于缓冲液中,避免反复冻融反复冻融q问题三:问题三:DNADNA提取量少。提取量少。实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全吸附或沉淀不完全洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失 原原因因对对策策尽量选用新鲜(幼嫩)的材尽量选用新鲜(幼嫩)的材料料动植

23、物要匀浆研磨充分;动植物要匀浆研磨充分;G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解或机械方式破壁。高温裂解时,时间适当延长(对于动时,时间适当延长(对于动物细胞、细菌可增加物细胞、细菌可增加PKPK的用的用量)。量)。增加吸附的时间,或低温沉增加吸附的时间,或低温沉淀淀小心操作小心操作第二部分:第二部分:RNA提取及常见问题分析提取及常见问题分析第一部分:第一部分:RNA提取方法简介提取方法简介分析不同发育时期基因的表达状况分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因获得新基因研究基因的拼接研究基因的拼接分析相应的蛋白产物分析相应的蛋白产物

24、糖残基的2和和3位置带有羟基,位置带有羟基,RNA易易于被于被RNA酶切割水解酶切割水解 RNA酶含量丰富,加热后仍能够正确折叠恢复酶含量丰富,加热后仍能够正确折叠恢复活性,不易失活活性,不易失活 经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有RNase,会导致,会导致RNase污染。污染。 使用灭过菌的塑料制品和***头避免交叉污染。使用灭过菌的塑料制品和***头避免交叉污染。 应使用不含应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤烘烤4小时,塑料器皿可在小时,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡中浸泡10分钟,

25、然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。 焦磷酸二乙酯(焦磷酸二乙酯(DEPC):): 与与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的合使蛋白质变性,强烈但不彻底的RNA酶抑制剂酶抑制剂 。 异硫氰酸胍:异硫氰酸胍:目前是最有效的目前是最有效的RNA酶抑制剂,裂解组织的同时也使酶抑制剂,裂解组织的同时也使RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物:氧钒核糖核苷复合

26、物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂(酶的蛋白抑制剂(RNasin):):从大鼠肝或人胎盘中提取得来从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。的酸性糖蛋白。RNasin是是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种多种RNA酶结合,使其失活。酶结合,使其失活。 其它:其它:SDS、尿素、硅藻土等对、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。酶也有一定抑制作用。第二部分:第二部分:RNA提取及常见问题分

27、析提取及常见问题分析第一部分:第一部分:RNA提取方法简介提取方法简介材料的裂解材料的裂解杂质的去除杂质的去除RNA的吸附或沉淀的吸附或沉淀异硫氰酸胍异硫氰酸胍,亚硫氢胍,巯基乙醇,亚硫氢胍,巯基乙醇,N-月桂肌氨酸月桂肌氨酸 等。使细胞及核蛋白复等。使细胞及核蛋白复合物变性,释放合物变性,释放RNA,有效抑制核酸,有效抑制核酸酶。酶。苯酚,氯仿,异戊醇抽提去除杂物,苯酚,氯仿,异戊醇抽提去除杂物,使使DNA及蛋白沉淀到有机相。及蛋白沉淀到有机相。硅质材料的吸附硅质材料的吸附或用异丙醇沉淀浓缩或用异丙醇沉淀浓缩RNA。经经DEPC 处理的水溶解处理的水溶解RNA尽量使用新鲜材料,植物组织选取杂

28、质少生长较快的幼嫩部位,尽量使用新鲜材料,植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位,现取现提。现取现提。组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清,消化系统的组组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清,消化系统的组织选取杂质少的部位织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理。细菌和酵母需要匀浆处理。对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻,或投入对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻,或投入专门的专门的RNA样品储存液中保存。样品储存液中保存。液氮研磨时不要使液氮挥发净,随时补充;加入裂解液并且彻液氮研磨时不要使液氮挥发净,随时补充;加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。底而迅速地匀浆。R

29、NA的提取的提取采用有机(酚采用有机(酚/ /氯仿)抽提时应充分混匀氯仿)抽提时应充分混匀离心分离两相时,应保证一定的转速和时间,使蛋白质、多糖和离心分离两相时,应保证一定的转速和时间,使蛋白质、多糖和DNADNA分布到中间层和有机相中,分布到中间层和有机相中,RNARNA留在水相中留在水相中对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层,可以再次用有机溶对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层,可以再次用有机溶剂抽提剂抽提RNA的提取的提取RNA的沉淀和溶解的沉淀和溶解含含RNARNA的水相过吸附柱,通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖的水相过吸附柱,通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质等杂质或使用异丙醇沉淀或使用异丙醇沉淀RNARNA应充分的混匀并放置应充分的混匀并放置10min10min左右离心收集左右离心收集沉淀,沉淀,7070乙醇洗涤,晾干乙醇洗涤,晾干用经用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA样品收集后或需长期保存时应置于样品收集后或需长期保存时应置于70 或加入或加入RNase抑制剂,抑制剂,分装使用分装使用RNA的提取的提取RNA的检测的检测电泳槽系统的处理电泳槽系统的处理乙二醛化琼脂糖凝胶电泳乙二醛化琼脂糖凝胶电泳含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳RNA纯度及浓度的检测纯度及浓度的检

我要回帖

更多关于 酵母rna的提取及组分鉴定结果分析 的文章

 

随机推荐