扫二维码下载作业帮
1.75亿学生的选择
下载作业帮安装包
扫二维码下载作业帮
1.75亿学生的选择
为什么我的RT-PCR内参跑不出来.目的条带到是跑出来了
fgmwoeu414
扫二维码下载作业帮
1.75亿学生的选择
1、内参没有被扩增出来2、电泳时内参没加loading buffer或染料
为您推荐：
其他类似问题
扫描下载二维码【求助】为什么我WB的目标条带有而内参却一直跑不出来 - 经验共享 - 分析测试百科网 - 分析测试百科网
月度关注热点
【求助】为什么我WB的目标条带有而内参却一直跑不出来
查看完整版本请点击这里：
我是新手哈,向大家请教一下,我最近跑WB的内参非常淡,而目标条带却非常清楚.
用的是RAPI碧云天的裂解液,BCA测蛋白浓度,15%和5%的胶,80V电压30min,100V电压1小时10min左右,湿转NC膜,5%脱脂奶粉封闭过夜,1:1000TBST稀释SantaCruz的actin一抗孵育4小时左右,洗膜3次*5Odyssey荧光二抗孵育1小时.洗膜3次*5min,扫描.
请大家帮我看下,指点一下哈.
谢谢大家! 查看完整版本请点击这里：
+小生怕怕+ ( 12:49:56)
这样啊,谢谢
我的目的条带是16KD的,内参是43KD,用 的是 Whatman的0.2微米的NC膜,转膜是恒流200mA,2小时.
一抗梯度做过了,还是一样的内参仍然很淡.
谢谢大家,继续帮我想想还可能是什么原因吧.
8princess8 ( 12:50:50)
是什么组织？
换其他内参看看
u234 ( 12:51:19)
试试其他内参，比如Tubulin
langlang ( 12:52:03)
我们100v 80min就行了，可以贴两张膜，立春红染，看看是不是过了。
tangxin_80 ( 12:52:31)
有一种可能是actin发强光后在极短的时间内猝灭了（是在做肿瘤方面的课题么，最近我们也在做），你可以尝试下，我们发现有些条带会在发光液孵育完后半分钟内便猝灭消失，原因可能是在极短的时间内发光物质被大量消耗殆尽，尽早压片试试，同时也可以考虑降低二抗浓度（大约降低一半左右即可）
另外建议LZ可以在配胶时将四分之一的水换成50%的甘油，这样可以抑制样品扩散，防止最后显影时影粘连在一起
summerxx ( 12:52:53)
从图来看，actin的带非常弱，既然你用的是荧光二抗扫描，首先你要确定扫描的时候软件使用没有问题。如果能确定这些没有问题，则可推断问题出在如下方面：
1，一抗，santa cruz的一抗有时候会出问题，我曾经用过他们干扰素的抗体，第一次什么都没有，后来换了一支不同货号的就杂出来了。还有可以提高一抗的浓度，santa的抗体有时候1:1000效果非常差，我们有段时间actin的抗体采用1：500稀释。
2，二抗，有可能荧光基团淬灭了或者失效了。
3，可以适当增加上样量。
作者可考虑做点阳性对照验证是否是抗体出了问题，出了问题赶紧找公司换或者退货。
查看完整回复请点击这里：实验内参，即是在检测细胞内分子表达变化时选择的参照物，其在细胞内的表达相对恒定，在处理因素作用条件下不会发生表达改变的基因。内参同样可以校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。1、管家基因最普通的内参是内源性参照基因，也就是管家基因（持家基因，house keeping gene）。管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化并且一直处于活性转录状态的基因，高度保守并且在大多数情况下持续表达。其表达水平受环境因素影响较小，而且是在个体各个生长阶段的大多数，或几乎全部组织中持续表达，或变化很小，因此常存在于生物细胞核的常染色质中。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。管家基因维持细胞最低限度功能所不可少的基因, 如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、线粒体蛋白基因、糖酵解酶的基因等。这类基因在所有类型的细胞中都进行表达，因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。部分人类管家基因列表2、内参基因选择的条件1、不存在假基因，以免基因组DNA的扩增；2、高度或中度表达，避免太高或太低的丰度；3、稳定表达于不同类型的细胞和组织中，表达量无明显差异；4、表达水平与细胞周期、活化等无关；5、不受外源性或内源性因素的影响。3、不同管家基因在选择管家基因作为内参时，首先要按不同类型的分子选择正确的内参。曾看到有人用检测miRNA时选择了GAPDH作为内参呢。a、检测mRNA时的内参通常使用的是GAPDH、beta-actin、tubulinGAPHDGAPDHGAPDH是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。beta-actinβ-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分，具有收缩功能，分布广泛。ACTB另外，不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少，不适合做内参。tubulintubulin（微管蛋白）是球形分子，有两种类型：α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)，这两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基。α亚基由450个氨基酸组成，β亚基是由455个氨基酸组成，它们的分子量约55 kDa。tubulin由于β-Tubulin的检测分子量大约在55kD，因此该内参抗体不是很适合用于检测50kD-60kD大小目标蛋白的WB实验中。b、检测蛋白时的内参检测蛋白时，常用蛋白内参有GAPDH、β-Actin、β-tubulin。选择的内参要跟目标蛋白分子量差5KD以上，所以需要根据目标蛋白的分子量来进行内参的选择。c、检测miRNA时的内参small nuclear RNA (snRNA)和small nucleolar RNA (snoRNA)长度与miRNA相近，200bp左右，在多种组织细胞中高表达，不涉及miRNA的调节途径，且与miRNA探针设计方法相同，所以snoRNA是很好的内参选择。常用内参简单介绍一下常用的内参U6：U6是一类snRNA，它是由RNA聚合酶III转录。主要形成小核核糖核蛋白颗粒，定位与细胞核内，表达稳定。d、检测lncRNA时的内参检测lncRNA时，内参选择和mRNA一样，可以选择GAPDH、beta-actin等。GAPDH虽然在很多细胞实验中都很稳定,但是因为它是个糖代谢相关酶,在很多糖代谢变化的实验中都会剧烈变化,比如缺氧、缺血、糖尿病以及某些肿瘤细胞中。因此内参不是绝对的。同样，beta-actin也不是绝对的，如果涉及到细胞骨架重排，解聚，重组的实验，beta-actin一样不可靠。如果不确定，可以多选几个内参候选，找一个变化量小的。最后，18S rRNA也可以作为lncRNA检测时的内参。当然，还有其他的内参可以作为lncRNA检测的内参，如：RPL13Ae、检测circRNA时的内参检测circRNA时可以用18S rRNA作为内参。18S rRNA是一类核糖体RNA，所常用来进行生物分类的依据。由于18SrRNA在生物中的表达比较保守，所以目前也用来作为内参。用18s RNA作为RT-PCR的内参，应该和β-actin是一个道理，半定量的目的是要看总RNA中的目的基因mRNA的表达量，内参的目的是去除一些系统误差。有文献做过比较，之所以18s RNA比β-actin好是因为它含量丰富，且任何情况下稳定存在，所以受外界调控影响小，半定量时背景更加稳定。但是不同的是18s是rRNA，没有A尾巴，所以选它作内参时，理论上总RNA转录时不能用OligodT作反转录引物，用随机引物或6聚体引物,OligodT转录出来的可都是mRNA啊！如果选β-actin就不存在这个问题，因为它mRNA，有A尾巴。 & &That's all. Thank you!请长按二维码识别关注“小张聊科研”。关注后获取《科研修炼手册》1.0、2.0、3.0、基金篇精华合集。小张聊科研(xzlky2015)　
　文章为作者独立观点，不代表大不六文章网立场
xzlky2015聊聊跟科研有关的感想心得，如基金，文章和实验。热门文章最新文章xzlky2015聊聊跟科研有关的感想心得，如基金，文章和实验。&&&&违法和不良信息举报电话：183-
举报邮箱：
Copyright(C)2016 大不六文章网
京公网安备78导读：可不顺的时候也很令人心烦DD做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗，特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，导致结果出现问题时无法分析结果DD即便有结果也可能影响结果的分析，我也同意剪开,但是别忘记一个问题.，请教一个问题:目的蛋白的一抗和内参的一抗能同时混合孵育PVDF膜吗?两个二抗是否，混合孵育从技术上是没问题的，我做的WB中检测两个目的基因，一个是90
我做的WB中检测两个目的基因，一个是90kd，一个是42kd，内参是36kd，请问一下我这个怎么做才有可比性，后面一个目的蛋白和内参大小差不了多少，如果是一块胶的话，剪膜也不能剪。谢谢大家！
这个很容易做，跑两个膜，每张膜上分别Blot两个目的基因，只要保证两个膜使用的都是同样来源的样品就好。然后在分别strip掉blot内参基因。如果你非要在一张膜上做的话，取决于你的前两个目的基因使用多抗还是单抗，使用抗兔的二抗的话，你可以先加一个基因的一抗，再加另一个基因的一抗，然后用抗兔的二抗一次将两个基因同时Blot出来。一般内参基因都是单抗，所以将blot过的膜很轻微的strip一下，去除掉抗兔的二抗即可进一步blot内参，这样两个的结果都没有互相的干扰。
但是你一定要记得，不管你怎么做，内参一定要最后才能blot，如果你先blot了内参，由于内参蛋白在膜上的量实在太大，导致化学发光很强，你在后来无论如何strip还是blot你的目的基因，都没办法拿到很好的结果。
1． 为什么一定需要内参？内参的重要性。
2。常用的几种内参。
3。不同的情况如何选择不同的内参。
1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上说，内参事必须做的。
2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)， 被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。
3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！
内参的重要性，必要性：
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦DD做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果DD即便有结果也可能影响结果的分析。
内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白
(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
我想问一下,内参和目的蛋白相差15kD能不能将膜上他门的位置(用预染)分别剪下来,孵育啊?还是必须得跑两张膜一个内参一个目的蛋白啊?洗膜的时候可以放在一起洗么?如果他们是同源的二抗可以放在一起孵育么?
完全可以剪开分别加一抗孵育，我就是这么做的；洗膜时最好分开洗涤，放在一起的话两张膜可能重叠在一起，影响洗膜效果；如果不剪膜，你两个一抗来源相同而且特异性很好（单抗）的话，可以一起孵育，不过应该注意可能存在的交叉反应，你可以尝试一下看看结果再定。
在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。我们实验室使用最多的是***工程有限公司与国外实验室合作开发的GAPDH，100μl一支，浓度为100μg/100μl，价格为988元人民币。虽然公司网上称稀释比达1：10000以上，至少可做100次Western mini-blots，但我们一般按照1：稀释，不过效果确实非常好，荧光条带非常亮，而且抗体使用3～4次也没太大改变。
我们也使用过博奥森的beta-actin，200ul 480元，稀释比1：200～500。因为稀释比不高，所以价格并不便宜。更可气的是，我PC 12细胞居然有两条条带，小鼠也是两条
我也同意剪开,但是别忘记一个问题.
你 要确保你剪开的部位没有蛋白.
我想请问一下如果内参和目的蛋白的差距很大，比如我的目的蛋白是一百多ＫＤ，可是常用的内参都是３０～５０ＫＤ，是不是一定要分块胶来跑呢？
请教一个问题:目的蛋白的一抗和内参的一抗能同时混合孵育PVDF膜吗?两个二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么问题?谢谢!
会担心有影响。
保险一点，还是分别孵育。
你的目的蛋白 和内参 分子量相差多少呢，如果相差比较大，你可以把2者剪开，分别孵育一抗。 如果分子量太相近了，还是先孵育目的蛋白一抗，重新封闭，再孵育内参一抗。
也是新手，不过个人为只要目的蛋白和内参的分子量差距足够大当ECL显色时两条带就不会相互干扰，可以同时孵育，一抗二抗均可同时孵育。因为我们用的都是特异性抗体，混合孵育从技术上是没问题的。也有很多人在这样做，也有很好的结果。
从经济的角度考虑，剪膜、分开孵育，一抗4度过夜，这样一抗可以重复利用有时可重复2-3个月。
包含总结汇报、党团工作、外语学习、文档下载、教学研究、考试资料、教学教材、办公文档、资格考试、IT计算机、工作范文、专业文献以及免疫印迹中的问题等内容。
相关内容搜索