基因表达是可逆的吗？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2023-11-03 02:30 标签： 过表达基因
为了研究某个基因的作用，或者其他目的（如标记特定时段的印记神经元），科学家需要在某一特定时间打开或关闭某个基因的表达。这就需要一个灵敏基因开关。常用的开关有两个，其一是基于四环素的TetTag系统，四环素的存在可启动或阻止位于四环素操纵子后的基因表达。而另一个常见的基因开关是CreERT系统。CreERT由三个关键字Cre、ER、T组合而成，分别对应于CreERT系统中的三个关键物质：Cre重组酶、雌激素受体（ER，estrogen receptor）和药物他莫昔芬（T，Tamoxifen）。CreERT系统可被药物他莫昔芬诱导开启。我们一一来拆解CreERT名字里的关键因素。Cre-Loxp重组酶系统Cre是一种识别特异位点的基因重组酶，Cre酶的基因序列来源于P1噬菌体的环化重组酶（cyclization recombinase），Cre的名字也源于此。Cre酶可识别一段名为Loxp的特定基因序列。 Loxp序列长34个碱基，包括中间8碱基的不对称序列，以及两侧反向回文的13碱基序列。Loxp序列由不对称的中间8bp和回文对称的两侧13bp组成，N碱基表示该位置可以是任何碱基中间的8碱基决定了Loxp序列的方向，而Loxp序列的方向决定了Cre酶的剪切方式。通常，Loxp序列会成对出现。如果两个Loxp的方向相同，那么，当Cre酶结合两个Loxp位点后，会删除两个Loxp之间的基因序列，以及一个Loxp序列。如果两个Loxp序列方向相同，则Cre重组酶删除两个loxp之间的基因序列利用这一特性，科学家设计了一个基因开关。在目标基因（如下图中的绿色荧光蛋白GFP）之前，构建一段包含两个同向的Loxp的基因序列，两个Loxp之间是一个阻止基因转录的STOP序列。由于STOP序列的存在，绿色荧光蛋白是无法被转录翻译的。当Cre酶出现时，Cre酶会切除同向Loxp之间的STOP序列。之后，绿色荧光蛋白便会顺利表达。这一过程是可逆的。Cre酶切除同向Loxp之间的STOP序列，使GFP能够转录翻译如果两个Loxp序列方向相反，Cre重组酶则会将两个Loxp之间的基因序列反转、左右颠倒。如果两个Loxp序列方向相反，则Cre重组酶会使两个loxp之间的基因序列反转但这种Cre酶的重组反应也是处于动态平衡中的，因为反转后两个loxp仍然是反向的，Cre酶可以接着将之反转回去。为了克服Cre酶重组过程可逆的弱点，科学家设计了另外一种常用的基因开关序列，DIO序列（double-floxed inverted open reading frame）。DIO序列中包含两种类型的Cre酶识别位点，一种是Loxp，野生型的。另一种是基因突变后的Loxp，如Lox2722。Cre酶的重组反应只发生在同种Loxp位点之间，即只重组两个Loxp之间的基因序列，或只重组两个Lox2722之间的基因序列。重组不会在一个Loxp和Lox2722之间发生。两个Loxp和两个Lox2722的方向都相反，并间隔分布（如下图）。两种loxp之间的序列是目标基因，目标基因的序列是反向的，无法表达出有意义的蛋白质。当Cre酶出现时，Cre酶的连续重组作用最终会将反向目标基因变为正向，之后目标基因便可正常表达。Cre酶的重组过程分为两步。第一步是反转。在Cre酶作用下，两个方向相反的LoxP之间的序列，会被反转。反转可能发生在两个LoxP之间，也可能发生在两个Lox2722之间。这两个反转无论谁发生，都不会影响最后结果。这一步的重组反应是可逆回去的。第一步，Loxp对之间或Lox2272对之间基因的反转，过程可逆反转发生后，下一步是Cre酶引发的重组删除。LoxP引发的反转会让两个原本反向的Lox2722变为同向，反之亦然。同向的两个LoxP或Lox2722位点会引发Cre酶的剪切功能。Cre酶会剪切掉一个Lox2722和一个LoxP。最后剩下的一个LoxP和Lox2722之间不会再发生Cre酶的重组，也不会再逆反回去。它是稳定的状态。第二步，Cre酶将基因片段剪切成稳定状态，这一反应过程不可逆以上两种方法是常用的依赖于Cre酶的基因开启方式。但要想实现特定时间的基因启动，科学家还需借助其他基因工具。这一工具是雌激素受体。雌激素受体ER和Cre酶的融合，实现了目标基因的定时开启雌激素受体（ER，estrogen receptor）是雌酮、雌二醇等女性荷尔蒙的细胞内蛋白受体，分为核雌激素受体和膜雌激素受体。雌激素受体蛋白结构在没有雌激素的情况下，核雌激素受体跟热休克蛋白90（HSP90，heat shock protein 90）结合在一起。由于热休克蛋白的阻挡，雌激素受体无法进入细胞核，只能游荡于细胞质内。雌激素出现后，雌激素会跟核雌激素受体结合，并将热休克蛋白90从雌激素受体上排挤走。热休克蛋白90消失后，雌激素受体便可大摇大摆进入细胞核，调控位于核内的基因的表达。雌激素受体跟雌激素结合后，可进入细胞核调控基因表达科学家通过基因编辑，将雌激素受体的配体结合域和Cre酶融合在一起。这样一来，没有雌激素时，Cre酶、雌激素受体配体结合域和热休克蛋白绑定在一起，在细胞质内飘散。Cre酶无法进入细胞核启动目标基因表达。当雌激素出现时，热休克蛋白被排挤掉，Cre酶和雌激素受体的结合体蛋白便可进入细胞核，Cre酶也就可以发挥作用。他莫昔芬（Tamoxifen）的出现可使Cre酶进入细胞核，调控基因表达。ER：雌激素受体。Hsp90：热休克蛋白90科学家为了排除内源雌激素的影响，突变了雌激素受体。突变后的雌激素受体不再结合体内的雌激素，只对他莫昔芬这种外源药物有亲和力。也就是说，只有当他莫昔芬出现时，Cre酶才能入核调控基因表达。同时，由于与Cre酶融合的只是雌激素受体的配体结合域，因此不会触发雌激素受体相应的基因调控。总结当科学家需要开启Cre酶介导的目标基因表达时，只需将外源药物他莫昔芬可通过口服或注射进入动物体内即可。CreERT系统实现了基因表达的时间控制，在时间要求精准的科学研究中大放异彩。例如，在记忆的研究中，CreERT系统（或TetTag系统），和即刻早期基因一起，经常作为基因表达的时间开关，特异地标记出只参与某一段记忆的神经元。欢迎关注我的微信公众号：生物流BioStream（生物流系头条号签约作者）
慢病毒是一类改造自人免疫缺陷病毒的病毒载体，基因组是RNA，可将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，借助慢病毒载体可以进行编码基因和非编码基因的过表达、干扰、敲除和内源性激活等操作，满足不同的基因操作需求。慢病毒的宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等特点，使其能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，此外，借助慢病毒载体改造T 细胞用于CAR-T细胞治疗。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸，不具有蛋白编码能力的线性RNA分子，基因组DNA转录生成lncRNA后，一些lncRNA在细胞核内发挥功能，另外一些lncRNA被转运到细胞质，在细胞质中lncRNA可以调控mRNA稳定性、翻译效率和干扰蛋白翻译后修饰。LncRNA分类LncRNA根据其相对位置在调控靶编码基因中发挥重要作用，根据其在基因组上与编码基因相对位置的不同，可以将lncRNA分为以下几类（见图1）：1.启动子区（来自启动子区域的转录本）；2.内含子间（主要产生于编码基因的内含子区）；3.双向（与蛋白质编码基因共享相同的启动子，但转录方向相反）；4.正义链（转录方向与蛋白质编码基因方向相同，存在于同一编码基因正义链，具有重叠的外显子）；5.反义链（转录方向与蛋白质编码基因方向相反，存在于反义链，至少有一个外显子重叠）；6.3’UTR区（来自3’UTR区域的转录本）；7.基因间（来自于两个蛋白质编码基因之间的DNA序列）。与mRNA类似，lncRNA也可以存在于细胞核或细胞质中，但主要位于细胞核。图1 长链非编码RNA分类。来源：Xiaomei Huang et al., Canner Lett. 2018LncRNA对基因表达的调控由于lncRNA的复杂性和多样性，不能简单地根据其结构或序列来描述其功能，但lncRNA的一个重要作用是调节邻近蛋白编码基因的表达。LncRNA在不同水平上调节基因表达：表观遗传修饰表观遗传修饰是指在细胞核DNA序列不发生变化的情况下，基因表达发生可逆和可遗传的变化，这种修饰包括染色质重塑、DNA甲基化和组蛋白修饰。1.组蛋白乙酰化：组蛋白乙酰化的过程促进了基因表达、蛋白质活性或生理过程。2.染色质修饰复合物的招募：lncRNA将染色质修饰复合物招募到特定的位点，介导相关基因的表达或沉默。3.DNA甲基化：通过改变染色质结构、DNA构象、DNA稳定性以及DNA与蛋白质的相互作用来控制基因的表达。转录调控4.转录调节：LncRNA可抑制靶基因转录因子活性，抑制其基因表达。如lncRNA的转录干扰临近基因的表达；lncRNA通过封阻启动子区域干扰基因表达；lncRNA与RNA结合蛋白作用，定位到基因启动子区调控基因表达；lncRNA能调节转录因子活性，调控基因表达。转录后调控5.可变剪接：LncRNA可以促进pre-mRNA和可变剪接因子的结合，有助于产生成熟mRNA。6.竞争性RNA：LncRNA可以作为miR海绵，竞争miRNA，然后解除对靶基因的抑制。7.蛋白去磷酸化：LncRNA参与蛋白去磷酸化。8.抑制蛋白降解：LncRNA与蛋白质相互作用并抑制其泛素化降解。图2 LncRNA在不同水平上调节基因。表达来源：Xiaomei Huang et al., Canner Lett. 2018LncRNA虽然不能编码蛋白质，但可以向下游传递信息，调控基因表达，表明lncRNA可能作为基于RNA的信息库，具有与蛋白质组学竞争的能力，在疾病诊断和靶向治疗中甚至比蛋白质更加敏感和特异。因此lncRNA的研究越来越广泛。慢病毒包装系统缺陷但是，目前lncRNA慢病毒包装系统普遍存在一些问题：1.慢病毒是RNA病毒，lncRNA的转录终止需要polyA，而polyA会导致慢病毒包装过程中，慢病毒基因组的表达提前终止，导致慢病毒包装不成功；2.常规慢病毒载体表达lncRNA，由于不能及时终止，会带有WPRE等无关序列，从而影响lncRNA的高级结构, 而高级结构是lncRNA发挥功能的决定性因素, 这些多余的序列势必对lncRNA的功能造成不可预料的影响；3.有些lncRNA会发生自切割，包装时，慢病毒基因组也可能因为lncRNA的自切割而发生断裂，导致出毒失败。针对以上这些问题，和元生物推出新升级慢病毒系统一次性解决以上问题，让lncRNA精确表达。新升级慢病毒系统优势1.LncRNA精准表达。2.载体上荧光表达更亮。3.改善由于基因引起的不出毒，出毒更稳定。验证结果：PCR验证表达精确：
感染效果图：和元研发团队专注于病毒载体及包装系统进行研发，对慢病毒主要元件进行改进和优化，并获得相关授权专利。别人只追求滴度时，我们还追求更有效；别人只追求纯度时，我们还追求更安全；别人只追求承诺时，我们还追求更真实；别人只追求周期时，我们还追求更稳定。 在看不见的地方努力，只为给您提供稳定的高品质产品！和元生物制备的每一支病毒，在分装之前，都要经过十几道纯化工艺，才能保证病毒纯度！和元生物用心做科研，让基因递送触手可及业务咨询想要lncRNA基因表达更准确，更稳定吗？快来扫描下方二维码联系我们吧参考文献[1] Xiaomei Huang,Xi Zhou., et al. Advances in esophageal cancer: A new perspective on pathogenesis associated with long non-coding RNAs.Cancer Lett.2018 Jan 28;413:94-101.doi: 10.1016/j.canlet.2017.10.046.
撰文： LX制版：则 光遗传学（Optogenetics）是指以光为调控介质，光响应元件为受体来调控细胞发育过程的遗传学方法。相比于化学试剂诱导调控，光遗传学手段对于细胞信号转导、代谢过程的调控更有时空特异性并且更容易定量和可逆。遗传编码的光响应元件在哺乳动物研究中广泛应用，比如调节神经传递，基因表达，表观遗传，蛋白活性及亚细胞定位等【1】。相比于动物中的研究，光遗传学在植物研究中的应用滞后很多，一个主要原因在于植物的正常生长需要具有广泛光谱的自然环境白光，白光里的成分会诱导光响应元件错误的激活，从而影响对于光响应元件精准及定量的调控【2】。为了避免环境光源对于光响应元件的错误激活，德国杜塞尔多夫大学Matias D. Zurbriggen教授团队，研发出一套新型光遗传学调控系统，该系统只有在单一的红光下才激活，而在白光、蓝光及黑暗条件下均处于关闭状态，该系统不仅可以在原生质体及叶片中瞬时调控基因表达，还能以稳定遗传的方式在整个植株中起作用。相关研究以Optogenetic control of gene expression in plants in the presence of ambient white light为题发表于期刊Nature Methods 上。研究者将其开发的光遗传学系统命名为plant usable light-switch elements (PULSE)，PULSE有两个光响应子系统，一个是蓝光抑制基因表达组件，简称Boff；另一个是红光激活基因表达组件，简称Ron. Boff包含来自于细菌Erythrobacter litoralis的蓝光受体EL222，蓝光照射下EL222组成活性二聚体并结合DNA序列C120【3】，并且EL222上融合了一段转录抑制结构域SRDX. Ron则包含PhyB-VP16和E-PIF6，融合蛋白E-PIF6通过DNA结构域E结合DNA etr元件，红光照射下，红光受体PhyB-VP16通过PhyB与PIF6结合，而转录激活结构域VP16可以招募转录起始复合物来起始转录【4】。除了两个光响应子系统Ron和Boff， PULSE还含有一个人工合成的启动子POpto， POpto由Boff和Ron所能结合的(C120)5和 (etr)8元件，人巨细胞病毒启动子hCMV及其所驱动的目标基因组成。当只存在红光时Ron激活Boff失活，Ron结合POpto诱导目的基因转录，而当存在蓝光或者多种光谱构成的白光时Ron和Boff都被激活，二者都结合到POpto，净结果是目的基因无法诱导。而在黑暗及远红光时，Ron和Boff均失活，目的基因也无法表达。图1：光遗传学调控系统PULSE在不同光照条件下的状态模型.研究者首先在拟南芥原生质体中验证了PULSE的可行性，当只把Ron及POpto转入拟南芥原生质体时，可以观察到在红光、蓝光、白光照射下报告基因均被诱导，这与前人报道的紫外和蓝光可以激活PhyB的结论相一致【5】。而当Ron和Boff及POpto一同转入拟南芥原生质体时，只有在红光条件下，报告基因才被显著诱导，达到黑暗条件下表达量的396.5倍。研究者还开发了一个定量的模型来描述和预测PULSE活性，从而对其更加准确有效的利用。为了实现PULSE对特定基因表达量的诱导，研究者设计了两种方法，一是利用PULSE诱导核酸酶失活同时偶联了转录激活结构域的Cas9蛋白（dCas9-TV），二是利用PULSE诱导特定的內源转录因子，dCas9-TV和內源转录因子可以进一步激活下游靶基因。结果表明，在拟南芥原生质体中这两种方法均实现了对于下游靶基因的激活。接着研究者利用农杆菌转化法将PULSE转入烟草叶片中，使PULSE在植物体内瞬时发挥功能，实现了植物在体的诱导靶基因的表达。当感染病原菌时，拟南芥EF-Tu受体EFR会识别细菌分泌的小肽elf18，促进活性氧ROS的产生，帮助植物对病原菌的抵御【6】，而烟草中缺乏EFR受体，无法识别elf18。研究者利用PULSE诱导EFR-GFP在烟草叶片中表达，并且当外源添加elf18后ROS的产量迅速增加，因此增强了对于病原菌的免疫能力。研究者还检验了PULSE诱导纳米抗体（nanobodies），追踪受体蛋白定位的可行性。首先在烟草叶片中组成型表达融合蛋白EFR-GFP，然后用PULSE诱导 anti-GFP纳米抗体与mCherry的融合蛋白(GFP-binding protein (GBP-mCherry)). 当烟草叶片中不含有EFR-GFP时，mCherry信号存在于细胞质中，而当存在EFR-GFP时GBP与GFP结合，mCherry信号完全位于细胞膜上与GFP信号融合，表明成功地应用PULSE诱导的纳米抗体靶定到了细胞膜受体蛋白。研究者进一步将PULSE系统稳定转化到了拟南芥中，在T3代植株中，挑选两个独立株系检测PULSE对报告基因的诱导，在红光照射下报告基因表达量提高了10到21倍，并且这种诱导是可逆可控的，表明PULSE可以在整个植株中稳定的发挥作用。图2：PULSE在拟南芥植株中的基因调控功能综上所述，该研究成功开发了对于环境白光不敏感的光遗传调控系统，该系统可在原生质体，叶片，整株植物中发挥作用，利用该系统可以激活基因表达，增强植物免疫力，追踪蛋白定位等等，为精确可逆的调控植物信号转导，细胞代谢等过程提供了强有利的生物化学工具。参考文献：[1] Shin, Y. et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell 168, 159-171.e14 (2017).[2] Müller, K. et al. A red light-controlled synthetic gene expression switch for plant systems. Mol. Biosyst. 10, 1679-1688 (2014).[3] Motta-Mena, L. B. et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat. Chem. Biol. 10, 196-202 (2014).[4] Ochoa-Fernandez, R. et al. in Optogenetics: Methods and Protocols (ed. Kianianmomeni, A.) 125-139 (Humana Press, 2016).[5] Müller, K. et al. Multi-chromatic control of mammalian gene expression and signaling. Nucleic Acids Res. 41, e124 (2013).[6] Zipfel, C. et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the receptor EFR restricts Agrobacterium-mediated transformation. Cell 125, 749-760 (2006).论文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-020-0868-y

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