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抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶1.1.5 抗氧化物质：还原性谷胱甘肽1.2 人体试食试验1.2.1 脂质氧化产物：丙二醛或血清 8-表氢氧异前列腺素( 8-Isoprostane)1.2.2 超氧化物歧化酶1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶2 试验原则2
2、.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3 结果判定3.1 动物实验： 脂质氧化产物、
蛋白质氧化产物、 抗氧化酶、 抗氧化物质四项指标中三项阳 性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。3.2 人体试食试验： 脂质氧化产物、 超氧化物歧化酶、 谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项 阳性，且对机体健康无
只。1.3.4.1.1.2剂量分组及受试样品给予时间1.3.4.1.1.3实验方法1.3.4.1.2.3.1老龄动物选用 10 月龄以上大鼠或 8 月龄以上小鼠，按血中 MDA 水平分组，随机分为 1 个溶剂 对照组和 3个受试样品剂量组。 3 个剂量组给予不同浓度受试样品， 对照组给予同体积溶剂， 实验结束时处死动物测脂质氧化产
4、物含量、 蛋白质羰基含量、 还原性谷胱甘肽含量、 抗氧化 酶活力。1.3.4.1.2.3.2D 半乳糖氧化损伤模型1.3.4.1.2.3.3原理D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的 平衡状态，引起过氧化效应。1.3.2.2 造模方法选 25-30g 健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖 40mg 1.2g/kg
BW颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日 1 次，连续造模 6 周，取血测MDA ，按 MDA 水平分组。 随机分为 1 个模型对照组和 3 个受试样品剂量组， 3 个剂量组经 口给予不同浓度受试样品， 模
5、型对照组给予同体积溶剂， 在给受试样品的同时， 模型对照组 和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.4.1.2.3.3乙醇氧化损伤模型1.3.4.3.1原理乙醇大量摄入，激活氧分子产生自由基，导致组织细胞过氧化效应及体还原性谷胱甘 肽的耗竭。选用 10 月龄以上老龄大鼠或
8 月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10 倍（小鼠）或 5 倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30 倍，必要时设阳性对照
6、组、空白对照组。受试样品给予时间30 天，必要时可延长至 45 天。实用标准文档大全1.3.4.3.2造模方法选 2530g 健康成年小鼠（ 180220g 大鼠），随机分为 4 个组， 1 个模型对照组和 3 个受试样品剂量组，必要时可增设 1 个空白对照组。 3 个剂量组给予不同浓度受试样品，模 型对照组给予同体积溶剂，连续灌胃30 天，末次灌胃后，模型组对照组和 3
个剂量组禁食16 小时（过夜），然后 1 次性灌胃给予 50%乙醇 12ml/kgBW ，6 小时后取材（空白对照组不 作处理，不禁食取材） ，测血清或肝组织脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱 甘肽含量、抗氧化酶活
7、力。1.3.4.1.2.3.4脂质氧化产物测定1.342.1 血中过氧化脂质降解产物丙二醛（ MDA ）含量测定 血中过氧化脂质降解产物丙二醛（ MDA ）含量可采用荧光法和比色法测定，方法任选 其一。1.3.5.1.1 荧光法1.3.5.3.2荧光法原理MDA （ malondiadehycle ）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂 质过氧化的程度。 1
个丙二醛（ MDA ）分子与 2 个硫代巴比妥酸（ TBA ）分子在酸性条件 下共热，形成粉红色复合物。以波长536nm 为激发光，在 550nm 有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。1.3.5.3.3仪器与试剂 仪器
8、：荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管试剂：10mmol/L 四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶 4C保存 12 个月），临用前用纯水稀释成1nmol/mL29mmol/L 硫代巴比妥酸工作液硫代巴比妥酸0.209gEDTA.2H2025mg谷胱甘肽（还原型）用 0.02mol/L NaOH1mg50 mL 溶解（微温助溶，棕色瓶 4C保存 2
9、馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂（选 AR 级）最好用双蒸水配制。1.341.1.3 实验步骤1.341.131 样品制备全血上清液：取血 50 卩 I 加入 0.5mL 生理盐水，2000r/min 离心 10min，取上清液待测。实用标准文档大全血清样品：取血 0.5mL 室温静置 10min，2000r/min 离心 10min，取上清液待测。1.341.132 标准曲线制作将
10、浴 60min 宀流水 冷却至室温T3mL正丁醇振荡抽提 1min 宀 3000r/min 离心 5min 宀取上清液（正丁醇层）测 荧光强度（入射狭缝 1.5nm，出射狭缝 5nm,激发波长 536nm,发射波长 550nm）以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。1.341.133 样品测定试剂空白管样本管标准管10mL 具塞离心管0.1mL 蒸馏水0.1mL
）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1 个丙二醛（MDA ）分子与 2 个硫代巴比妥酸（TBA ）分子在酸性条件 下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm 有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。1.3.4.1.2.2 仪器与试剂仪器：可见光分
13、光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、 具塞离心管。试剂：0.2M 乙酸盐缓冲液 pH3.50.2M 乙酸溶液185mL0.2M 乙酸钠溶液15mL1mmol/L 四乙氧基丙烷（贮备液，4C保存 3 个月），临用前用水稀释成 40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸钠 SDS0.8%硫代巴比妥酸 TBA0.2M 磷酸盐缓冲液 pH7.40.2M
比色注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。A：空白管吸光度B :样品吸光度F:四乙氧基丙烷吸光度C:四乙氧基丙烷浓度(40nmol/mL )K :稀释倍数1.342 组织中过氧化脂质降解产物丙二醛( MDA )含量测定1.3.6.2.4.2原理见 1.3.4
16、.1.2.11.3.4.2.2 仪器与试剂仪器：可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器试齐 U :见 1.3.4.1.2.21.3.4.2.3 实验步骤1.3.4.2.3.1 样品制备组织匀浆样品：取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入 0.2M 磷酸盐缓冲液，以20000r/min 匀浆
计算8-表氢氧-异前列腺素(8-lsoprostane)是体脂质氧化应激反应稳定而具有特异性的标志 物，其含量能间接反应因机体自由基的产生而导致组织细胞的脂质过氧化程度。1.343.2 仪器与试剂仪器：酶标仪、生化培养箱、微量振荡器、微量加样器、洗板机实用标准文档大全试剂
样品制备小鼠眼眦静脉丛取血，3000r/min 离心 10min。取上清液，用 EIA 缓冲液稀释 15 倍备用。1.3.4.3.3.2 样品测定按试剂盒说明操作。8-表氢氧异前列腺素标准孔浓度分别为：500 pg/mL
L2.培养用封板膜盖好酶标板，并在4C避光条件下培养 18 小时3.清洗清洗所有反应孔五次4加试剂AChE 示踪物-5 卩 L-Ellman 200 卩 L200 卩 L200 卩 L200 卩 L200 卩 L5.培养用封板膜盖好酶标板，并在常温避光条件下培养45
20、-90 分钟6.读数在波长 412nm 处测量各孔吸光度(B。在 0.3-1.0 A.U 围)标准或样品孔吸光度一 NSB 孔吸光度%B/B0=-X100B0孔吸光度一 NSB 孔吸光度以标准物的浓度的对数(log)为横坐标，B/B为纵坐标绘制标准曲线， 亦可将数据 转换成 logit(B/B0)或 lnB/B0/(1-B/B0)做为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。将样品
的B/B。值，代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中的8-表氢氧异前列腺素浓度。1.3.5 蛋白质氧化产物测定H2O2或 02一自由基对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。羟自由基也可直接作用于肽
21、链，使肽链断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰基。羰基化蛋白极易相互交联、聚集为大分子从而降低或失去原有蛋白质的功能，蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质损伤的程度。蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标 志，它随着年龄的增长而增加。实用标准文档大全135.1 血清中蛋白质羰基测定1.3.7.1.1 原理被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2，
4-二硝基苯肼反应生成2， 4-二硝基苯腙，2, 4二硝基苯腙为红棕色的沉淀，将沉淀用盐酸胍溶解后即可在分光光度计上读取370 nm 下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。1.3.5.1.2 仪器与试剂仪器：紫外分光光度计、
22、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、低温高速 离心机、混旋器、2ml 离心管。试剂：10 mmol/L 2, 4-二硝基苯肼（DNPH）99 毫克 2, 4-二硝基苯肼用 50ml 2 mol/L HCL 溶解，4C避光保存。2 mol/L HCL200 g/L 三氯乙酸（TCA ）6 mol/L 盐酸胍无水乙醇乙酸乙酯混合应用液将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1: 1
值。用双缩脲法测定血清（或血浆）蛋白质含量。注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.5.1.4 计算公式测定管 0D-对照管 0D实用标准文档大全蛋白质羰基含量 =-x125X105（nmol/mgprot）22x比色光径（cm）x样本蛋白浓度（ mg/L）1.3
25、.5.2 组织中蛋白质羰基测定1.3.521 原理见 1.3.5.1.11.3.522 仪器与试剂仪器：紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、天平、匀浆器、低温高速离心机、混旋器、2ml 离心管。试剂：10 mmol/L HEPES 缓冲液 pH7.42.38 克 N-2-羟乙基哌嗪-2 乙磺酸（HEPES）溶入 1000ml 双蒸馏水，用 IN NaOH
26、 mol/L HCL 溶解，4C避光保存。2 mol/L HCL200 g/L 三氯乙酸（TCA ）6 mol/L 盐酸胍无水乙醇乙酸乙酯混合应用液将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1 : 1 的比例配置成混合溶液，现用现配。1.3.5.2.3 实验步骤1.3.5.2.3.1 样品处理取 0.1g 组织，在冰的生理盐水中漂洗， 以去掉表面的血迹。加人 0.9ml 的冰的 10
4C下，以 12000r/min 离心 10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.0ml1.0ml涡旋混匀 1 分钟，以 4C下，以 12000r/min 离心 10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合
29、 盐 酸胍试剂调零，测定 OD 值。用双缩脲法测定匀浆上清液蛋白质含量。注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.523.3 计算公式测定管 OD-对照管 OD蛋白质羰基含量 =-x125X105（nmol/mgprot）22x比色光径（cm）x样本蛋白浓度（ mg/L） 1.3.5.3 注意事项1.3.5.3.1
加入硫酸链霉素：在匀浆上清液中加人硫酸链霉素溶液的作用是沉淀核酸。核酸中的一些碱基如鸟嘌呤、胞嘧啶、 尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基， 如不去除核酸，这些碱基 就会与DNP 结合，并反应生成有色物质， 这些物质会增加最后溶液的吸光度， 使结果偏大。1.3.7.1.3.1DHP
30、 啲溶解：DNP 不溶于水，只能溶于稀酸和稀碱等溶液，因此， 用 2 mol / L HC1 来溶解 DNPH 设对照管是为了避免 HC 与反应液中一些物质反应生成对比色有影响的物质。1.3.5.3.3 反应体系应避光：当蛋白质溶液中加人DNP 进行反应时，反应体系需置于黑暗中，因为 DNP 不稳定，见光会分解。如果反应体系遇到光，DNP 分解，体系中会有剩余的没有变
成蛋白质腙衍生物，对反应比色有影响。1.3.5.3.4 去除未与蛋白质结合的 DNPH 由于 DNPI 在 370nm 左右有强烈的光吸收，因而用乙醇 和乙酸乙脂混合物反复洗涤沉淀，去掉未与蛋白质结合的DNPH 否则，会增加吸光
31、值。1.3.6 抗氧化酶活力测定SOD 催化超氧阴离子自由基（O2一）生成 H2O2,再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX ）和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除。2-对细胞的毒害作用。SOD、GSH-Px 在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化，酶活性与生物年龄 的增长成反比。消除自由基的能力与酶活性成正比。1.361
血或组织中超氧化物歧化酶（SOD ）活力测定1.4.1原理O2一氧化羟胺的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红 色，在波长530nm 处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD 消除。2-后形成的亚硝酸盐减少。1.3
混合器抽提 1min ,4000r/min 离心 3min，分层，上层为 SOD 抽提液，中层为血红蛋白沉淀 物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。组织匀浆的制备：剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪
34、碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min 匀浆 10s,间歇 30s，反复进行三次，制成1%组织匀浆，（最好用超声波发生器处理30s）,使线粒体振破，以中性红-詹钠氏绿B 染色证明线粒体已振碎。以 4000r/min 离心 5min，取上清液 201待测。SOD 标准抑制曲线 将 SOD 标准品用磷酸盐缓冲液配制成 750U/mL 的溶液，再稀释 到 50 倍，即SOD
量为 15U/mL （1.5 卩 g/mL ,用本法测定不同量的 SOD 标准液的百分抑制 率，以百分抑制率为纵坐标，以 SOD 活力单位 U/mL 为横坐标绘制标准曲线。对照管 OD 测定管 ODSOD 百分抑制
35、率=-X100%对照管 OD计算每 mL 反应液中 SOD 抑制率达 50%时所对应的 SOD 量为一个单位。（对照管 OD-测定管 OD）X100%乘以稀释倍数（1mL/取样量）。SOD 活力（U/mL ）=对照管 OD50%反应液总量X-取液量6mL）X 样品稀释倍数也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD 标准曲线查出相应的 SOD U/mL
,实用标准文档大全若样品为组织匀浆液，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为 U/g 组织或 U/mg蛋白。若样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/g Hb。实用标准文档大全样品测定步骤:试剂测定管对照管1/15mol/L 磷
以蒸馏水调零，530nm 处比色测定 OD 值。* A 所用样品的量红细胞抽提液10gl血清（或血浆）2030gl（溶血样品剔除）1%组织匀浆1040gl注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.6.2 血或
37、组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）活力测定1.4.2.1原理谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH 氧化的反应速度，及单位时间 GSH 减少的量来表示，GSH 和 5,5二硫对硝基苯甲酸 （DTNB ）反应在 GSH-Px 催化下可生成黄色的 5-硫代
2-硝基苯甲酸阴离子，于 423nm 波长有最大吸收峰，测定该离 子浓度，即可计算出GSH 减少的量，由于 GSH 能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH 减少。1.3.6.2.2 试剂和仪器仪器：可
40、中，充分振摇，使之全部溶血 1:100 待测，4h测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20C冻存，3d 测定，若 4C存放，28h必须测完。测前取出样品室温自然解冻。组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器， 放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M 磷酸缓冲液，以 20000r/min 匀浆
10s，间歇 30s,反复 3 次制成 5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以 12500Xg 离心 10min （低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线 粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否
43、min 之读数准确。*样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。* 溶血液 0.1 - 0.4mL组织上清液1:20 稀释，取稀释液 0.4mL注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.6.2.3.4 计算鼠全血 GSH-Px 活力单位 规定每 1mL 全血， 每分钟， 扣除非酶反应的 logGSH降低 后， 使 logGSH降低 1 为一个酶活力单位。非酶管
44、Px 比活力单位规定每毫克蛋白质，每分钟，扣除非酶反应，使GSH 浓度降低 1 卩 mol/L 为一个酶活力单位。（非酶管 0D 样品管 OD）xA*x5组织 GSH-Px 比活力单位（U/mg 蛋白） =-3minx样品蛋白质的 mg 数* Folin 法或双缩脲法测样品蛋白质含量标准 GSH 浓度（卩 mol/L）* A=-即标准曲线斜率。标准 GSH
光密度（OD）1.3.6.2.4 注意事项1.3.6.2.4.1 由于 H2O2易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮 备液 3mL，测定 1cm 光径的 240nm 处 OD 值。OD实用标准文档大全浓度（mmol/
45、L ）=-0.036 （消光系数）若 OD 值为 0.45，则表明 H2O2浓度为 12.5mmol/L。2.2.15-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关， 还 受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系 pH 为 6.5 时， 11min 开始显色，此时比色 5min 读数准确。1.3.7 抗氧化物质还原型谷胱甘肽（ GSH
）测定谷胱甘肽是一种低分子清除剂，它可清除O2-、H2O2、LOOH 。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，是 GSH-PX 和 GST 两种酶类的底物，为这两种酶分解氢过氧化物所必需，它能稳
46、定含巯基的酶，和防止 血红蛋白及其它辅助因子受氧化损伤，缺乏或耗竭 GSH 会促使许多化学物质或环境因素产 生中毒作用， GSH 量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。1.3.7.1 血或组织中还原型谷胱甘肽（ GSH ）测定方法2.5.1.1原理GSH-和 5, 5-二硫对硝基甲酸（DTNB ）反应在 GSH-Px 催化下可生成黄色的 5-硫代 2-硝基甲酸阴离子，于
420nm 波长有最吸收峰，测定该离子浓度，即可计算 GSH 的含量。2.5.1.2仪器和试剂仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器试剂： 0.9生理盐水4磺基水酸溶液0.1mol
48、3.2样品制备：溶血液上清液：取 0.1mL 抗凝全血加双蒸水 0.9mL（1： 9 溶血液） ，充分混匀，直至透 亮为止。取溶血液 0.5mL 加 4%磺基水酸 0.5mL 混匀，室温下 3500rpm 离心 10 分钟，取上 清液备用。实用标准文档大全血清上清液： 取 0.1mL 血清加 4%磺基水酸 0.1mL 混匀， 室温下 3500rpm 离心 10 分钟，
取上清液备用。组织上清液：取组织 0.5g 加生理盐水 4.5mL 充分研磨成细浆（10%肝匀浆），混匀后取实用标准文档大全浆液 0.5mL 加 4%磺基水酸 0.5mL 混匀，室温下 3500rpm 离心 10 分钟，取上清液
处测定吸光度。注：该指标检测，需新鲜样品取材后当天完成。用双缩脲法测定血清（或溶血液）、 组织匀浆蛋白质含量。如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.7.1.3.3 标准曲线取 1mmol/L GSH 标准溶液 0、10、20、50、100、150、200
52、 gprot/L实用标准文档大全1.4 数据处理与结果判定2.7.3.4数据处理一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值 FO.O5，结论：各组均数间差异无显著性；F 值FO.O5,PW0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换， 待满足正态或方差齐要求后，
用转换后的数据进行统计； 若变量转换后仍未达到正态或方差 齐的目的，改用秩和检验进行统计。2.7.3.5指标判定2.7.3.5.2 脂质氧化产物 受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，过氧化脂质（丙二醛或8-表氢氧异前列腺素）含量
53、降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，该项指标结果阳性。2.7.3.5.3 蛋白质氧化产物受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，蛋白质羰基含量降低有统计学意义，判定该 受试样品有降低蛋白质过氧化作用，该项指标结果阳性。2.7.3.5.4 抗氧化酶活力受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，抗氧化酶（ SOD 或 GSH-PX ）活力升高有
统计学意义，判定该受试样品有升高抗氧化酶活力作用，该项指标结果阳性。2.7.3.5.5 抗氧化物质 GSH受试样品组与模型（或老龄）对照组比较， GSH 含量升高有统计学意义，判定该受试 样品有升高抗氧化物质 GSH 作用，该项指标结果阳性。1
54、.4.3 结果判定过氧化脂质含量、 蛋白质羰基、 抗氧化酶活性、 还原性谷胱甘肽四项指标中三项指标阳 性，可判定该受试样品抗氧化动物实验结果阳性。2 人体试食试验受试者纳入标准选年龄在 18 65 岁，身体健康状况良好，无明显脑、心、肝、肺、肾、血液疾患，无
长期服药史，志愿受试保证配合的人群。排除受试者标准妊娠或哺乳期妇女，对保健食品过敏者。合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病患者。短期服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。实用标准文档大全不符合纳入标准，未按规定食用受试样品，无法判定功效或资料不全影响功效或安全性判断者。2.3 受试者分组对受试者按 MDA、SOD、GSH-Px
55、水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结 果的主要因素如年龄、性别、生活饮食习惯等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每 组受试者不少于 50 例。2.4 试验方法采用自身和组间两种对照设计。试验组按推荐服用方法、 服用量每日服用受试产品， 对照组可服用安慰剂或采用阴性对照。受试样品给予时间 3 个月，必要时可延长至 6 个月。试验期间对照组和试食组原生活、饮食不变。2.5
观察指标各项指标在试验开始及结束时各检测1 次。2.5.1 安全性指标般状况包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等2.5.1.2 血、尿、便常规检查2.5.1.3 肝、肾功能检查2.5.1.4 胸透、心电图、腹部 B
57、SOD 升高百分率=100%试验前 SOD2.5.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶观察试验前后 GSH PX 的变化及 GSH PX 升高百分率。（测定方法见 2.7）实用标准文档大全试验前 GSH PX 试验后 GSH PXGSH PX 升高百分率=X100%试验前 GSH PX2.6 数据处理和结果判定凡自身对照资料可以采用配对t 检验，两组均数比较采用成组 t
检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后， 用转换的数据进行 t 检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t 检验或秩和检验；但变异系数太大（如 CV50 %）的资料应用秩和
58、检验。在试验前组间比较差异无显著性的 前提下，可进行试验后组间比较。各功效观察指标试验前后自身比较和试食后组间比较均有统计学意义，方可判定该指标阳性。过氧化脂质含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项实验中任二项实验结果阳 性，可判定该受试样品具有抗氧化功能作用。2.7 血中谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH Px）活力测定2.7.1
原理谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的 系统。对防止体自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH 氧化的反应速度，及单位时间 GSH 减少的量来表示，GSH 和 5, 5-二硫对硝基苯甲酸（DTNB ）反应在
59、GSH-Px 催化下可生成黄色的 5-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子，于 423nm 波长有最大吸收峰，测定该离 子浓度，即可计算出GSH 减少的量，由于 GSH 能进行非酶反应氧化， 所以最后计算酶活力 时，必须扣除非酶反应所引起的GSH 减少。2.7.2
