本申请涉及一种基于hiv-1的vpu和rev-rre元件的t7rna聚合酶(t7rnap)和t7启动子表达系统，该表达系统可用于在真核细胞中持续稳定高效地表达蛋白。

t7表达系统已被广泛地应用于蛋白质的表达，其中在原核生物中的应用最为普遍(参见，专利文献1)。最典型的代表是novagen公司研发的pet系列质粒，这类质粒目前已被广泛地应用在大肠杆菌中高效地表达蛋白质。

对于真核生物，有研究者利用酵母菌株开展了t7表达系统的研究，但却没有得到积极的结果，只检测到t7rnap的表达，没有检测到t7启动子控制的目的蛋白的合成(参见，非专利文献1和2)。

还有研究者在哺乳动物细胞中以病毒(如牛痘病毒)作为载体构建存在于细胞质中的t7表达系统，存在于细胞质中的牛痘病毒载体会随着细胞分裂而丢失；同时，大量复制的牛痘病毒最终也会杀死宿主细胞。因此，该t7表达系统只能实现蛋白质在细胞质中的瞬时表达，难以实现持续稳定地表达目标蛋白(参见，非专利文献1和3)。

为实现真核细胞内持续稳定地表达蛋白质，关键点在于将细胞核内转录后再加工的真核mrna通过核膜成功转运至细胞质，然后才能实现mrna在细胞质内翻译成蛋白质。但是，由于细胞核内t7rnap转录出的mrna没有5′帽子结构和3′poly(a)尾巴，不能被运输出细胞核，因此影响了细胞质内蛋白质的翻译合成，不能高效表达蛋白质。

对于t7rnap转录的缺乏5′cap结构的mrna，有研究发现，在细胞质内利用ires结构可以帮助缺乏5′cap结构的真核生物mrna翻译合成蛋白质(参见，非专利文献4)，但是，该研究并未涉及细胞核内的t7rnap转录的缺乏5′cap结构的mrna运输到细胞质的问题。同样，还有研究表明，在t7启动子启动的转录单元中添加真核生物终止子序列可以帮助t7rnap转录产物产生3′poly(a)尾巴(参见，非专利文献5)，但是该研究也未解决如何将缺乏5′cap结构的mrna从细胞核运输到细胞质的问题。

本发明主要解决真核生物中t7表达系统转录的无5′cap结构的mrna跨核膜运输到细胞质，连续稳定高效地表达重组蛋白的问题。

本发明人发现，人类免疫缺陷病毒(hiv-1)逆转录病毒基因组上存在编码rev蛋白的基因，与rev蛋白特异性结合的rna称为rev响应元件(rev-responsiveelement，rre)。rev蛋白可以结合rre，通过与剪接因子、剪接体相互作用抑制剪接，同时与核孔蛋白相互作用，将带有rre的不完全剪接mrna从细胞核运至细胞质。

hiv-1逆转录病毒还编码小的调节蛋白，其中vpu蛋白是由81个氨基酸寡聚形成的膜蛋白，折叠成两个不同的结构域，即n端跨膜疏水性结构域和c端细胞质结构域。由于具有该结构，vpu蛋白以寡聚体形式穿入细胞膜形成通道，能够改善细胞膜的通透性。

核定位信号(nuclearlocalizationsingal,nls)通常为短的氨基酸序列，它能辅助目标蛋白进入细胞核，核定位信号的引入可以使蛋白进入细胞核。当在膜蛋白上游添加nls，膜蛋白会定位在细胞核核膜上。

本发明人基于以上事实，为解决t7表达系统转录mrna跨核膜转运到细胞质的问题，提出如下两种设计方案：

1)在t7表达系统中引入hiv-1逆转录病毒中的rev-rre调控元件，rev蛋白可以特异性结合rre序列，将带有rre序列的缺乏5`cap结构t7rnap转录的mrna从细胞核运输至细胞质；

2)在t7表达系统中引入带有核定位序列的vpu基因，使其蛋白定位在细胞核核膜上，从而改变核膜的通透性，使t7rnap转录的产物通过渗透扩散进入细胞质。

上述设计方案对于所适用的真核生物不进行特别限制，只要能实现t7rnap转录的缺乏5′cap结构的mrna跨核膜运输到细胞质即可。优选地，适用于酵母、哺乳动物、昆虫。更优选地，适用于酿酒酵母(sachromycescerevisiae)、毕赤酵母(pichiapastoris)、马克斯鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)、仓鼠、人肾细胞、人hela细胞、cho、cos、bhk、sp2/0、nih3t3、蚕、果蝇。最优选地，适用于酿酒酵母(sachromycescerevisiae)和人hela细胞。

优选地，针对不同的真核生物可使用如下两种表达系统：

(一)对于酵母，构建基于hiv-1的vpu的t7表达系统。

(二)对于哺乳动物，构建基于hiv-1的vpu或rev-rre元件的t7表达系统。

为验证上述t7表达系统在真核生物中是否表达目标蛋白，本发明使用了潮霉素抗性蛋白(hph)、nanoluc萤光素酶(nluc)或增强型绿色荧光蛋白(egfp)，将其构建于t7启动子启动的转录单元。

验证实验证明了上述两种设计方案的合理性，两种t7表达系统均实现了预期的效果。结果表明，vpu蛋白起到了改变核膜通透性的作用，帮助t7rnap转录的mrna出核，完成了翻译过程；携带rre的mrna也与rev蛋白结合，帮助t7rnap转录的mrna出核，完成了翻译过程。

具体地，本发明的技术方案包括如下：

[1]、一种t7rna聚合酶和t7启动子的表达系统，其中，所述表达系统包含hiv-1逆转录病毒中的vpu蛋白和/或rev-rre调控元件。

[2]、根据[1]所述的表达系统，其中，所述t7rna聚合酶由seqidno：1所表示的序列编码。

[3]、根据[1]或[2]所述的表达系统，其中，所述t7rna聚合酶的基因还含有核定位序列。

[4]、一种使用t7rna聚合酶和t7启动子的表达系统在真核生物中表达蛋白质的方法，其中，所述表达系统包含hiv-1逆转录病毒中的vpu蛋白和/或rev-rre调控元件。

[5]、根据[4]所述的方法，其中，所述方法包括：

1)合成所述带有核定位序列的t7rna聚合酶基因序列，所述t7rna聚合酶由seqidno：1所表示的序列编码，将所述带有核定位序列的t7rna聚合酶基因插入到整合型载体中；

2)将所述整合型载体线性化，回收线性化片段，转化到真核菌株中，通过抗性筛选得到基因组上整合了带有核定位序列的t7rna聚合酶基因的真核重组菌株；

3)构建具有携带核定位序列的vpu基因的载体，以含有目标蛋白基因的质粒为模板扩增包含有t7启动子的目标蛋白dna片段，回收所述包含有t7启动子的目标蛋白片段，将其插入具有前述携带核定位序列的vpu基因的载体中，得到含有所述vpu基因和目标蛋白基因的载体；和

4)将3)得到的所述载体转化到2)中的真核重组菌株中，构建基于hiv-1逆转录病毒中的vpu蛋白的t7rna聚合酶的表达系统。

[6]、根据[4]所述的方法，其中，所述方法包括：

1)构建表达t7rna聚合酶和rev的载体，所述t7rna聚合酶由seqidno：1所表示的序列编码；

2)将含有t7启动子、t7终止子、ires、rre和目标蛋白基因的dna片段转移至所述载体，构建能够表达t7rna聚合酶、rev和目标蛋白的载体；

3)用2)中构建的载体进行转染，完成慢病毒包装；和

4)用所述慢病毒感染目标真核细胞，通过抗性筛选得到目标转化子，通过验证目标蛋白确定所述表达系统。

[7]、根据[4]所述的方法，其中，所述方法包括：

1)构建表达t7rna聚合酶和vpu的载体，所述t7rna聚合酶由seqidno：1所表示的序列编码；

2)将含有t7启动子、t7终止子、ires和目标蛋白基因的dna片段转移至所述载体，构建能够表达t7rna聚合酶、vpu、目标蛋白的载体；

3)用2)中构建的载体进行转染，完成慢病毒包装；和

4)用所述慢病毒感染目标真核细胞，通过抗性筛选得到目标转化子，通过验证目标蛋白确定所述表达系统。

[8]、根据[6]所述的方法，其中，在所述步骤1)中，选取哺乳动物的启动子作为表达t7rna聚合酶和rev的启动子，构建含有2a或者ires的真核多顺反子结构，得到同时表达t7rna聚合酶和rev的载体。

[9]、根据[7]所述的方法，其中，在所述步骤1)中，选取哺乳动物的启动子作为表达t7rna聚合酶和vpu的启动子，构建含有2a或者ires的真核多顺反子结构，得到同时表达t7rna聚合酶和vpu蛋白的载体。

[10]、根据[4]～[9]任一项所述的方法，其中，使用潮霉素抗性蛋白、nanoluc萤光素酶或增强型绿色荧光蛋白验证所述表达系统表达的目标蛋白。

[12]、根据[1]～[11]任一项所述的方法，其中，所述真核生物为酵母、哺乳动物或昆虫。

本发明通过构建基于hiv-1的vpu和/或rev-rre元件的t7表达系统，显著改善了t7rnap转录的缺乏5′cap结构的mrna从细胞核跨膜向细胞质的运输，促进其翻译合成蛋白质，实现了基于t7表达系统的重组蛋白在真核细胞内的持续稳定高效地表达。

图1为ps-t7rnap质粒构建的示意图。

图3为ps-hph质粒构建的示意图。

图4为ps-vpu质粒构建的示意图。

以下结合实施例进一步解释本发明，需要说明的是，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的保护范围不限于此。

细胞株：293t细胞，购自北京北纳创联生物技术研究院；hela细胞，购自北京北纳创联生物技术研究院。

培养基：ypd培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；sd-ura培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；deme培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；opti-mem减血清培养基购自北京索莱宝科技有限公司。

试剂：胎牛血清(fbs)，购自北京全式金生物技术有限公司；10×pbs缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司；luciferaseassaysystem试剂盒，购自普洛麦格北京生物技术有限公司；无缝克隆试剂盒(infusion)，购自中美泰和生物技术(北京)有限公司；fugene9，购自北京索莱宝科技有限公司；山梨醇，购自北京索莱宝科技有限公司；潮霉素b，购自北京索莱宝科技有限公司；嘌呤霉素，购自北京索莱宝科技有限公司。

<质粒和载体的构建以及蛋白的表达方法>

需要说明的是，本申请中涉及的常规的质粒和载体的构建、蛋白的表达方法以及慢病毒包装等方法，可参照本领域公知的分子生物学及遗传学方法，例如，可参照“本领域的常规生物学方法”、“最新分子生物学实验方法汇编(currentprotocolsinmolecularbiology，wiley出版)”、“分子克隆实验指南(molecularcloning：alaboratorymanual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。

<实施例1>基于hiv-1vpu蛋白的t7表达系统在酿酒酵母中的构建和表达

将质粒ps-t7rnap使用sfiⅰ核酸内切酶线性化。回收线性化质粒片段，电转入酿酒酵母菌株by4741，通过遗传霉素g418抗性筛选得到整合了t7rnap基因的酿酒酵母重组菌株by4741(ho::nls-t7rnap)。为了确保是阳性转化子，提取该酿酒酵母重组菌株和空白菌株的基因组并用特定引物ho3验证t7rnap基因是否正确插入到酿酒酵母基因组ho区域上，验证结果如图2。

ho3的核苷酸序列如下：

对照组扩增出来的大小为2947bp的片段，表明没有插入片段，而实验组扩出了7672bp的片段，说明所述t7rnap基因成功插入到了酿酒酵母by4741染色体上。

根据提供的基因序列合成pt7-ires-hph片段，pt7序列为seqidno：6所示的序列，hph的序列为seqidno：7所示的序列，tt7序列为seqidno：8所示的序列，将此片段通过无缝克隆的方法插入到载体pesc-ura中，完成质粒ps-hph的构建，构建流程如图3。同时，将携带核定位序列(nls)的vpu基因(如seqidno：9所示)插入载体pesc-ura中gal双向启动子的下游，构建质粒ps-vpu，构建流程如图4。

最后将回收的pt7-ires-hph片段同样采用无缝克隆的方法插入质粒载体ps-vpu，构建质粒ps-vpu/hph，载体构建过程如图5。

酿酒酵母感受态的制备过程如下所示：

(1)从平板上挑单一酵母菌落于5ml的ypd液体培养基中，30℃下培养12h。再从中吸取500μl培养液至50ml的ypd液体培养基，继续30℃培养18-24h至od600＝2左右即可。

(2)菌液转至灭菌的50ml离心管，5000rpm离心5min后去上清，然后用30ml的预冷灭菌水重悬菌体，然后5000rpm离心5min去上清。

(3)用20ml预冷灭菌的1m山梨醇重悬菌体，去上清。最后再使用200μl-500μl的1m山梨醇重悬细胞转移至1.5ml离心管，即得到酿酒酵母感受态细胞。每次做酵母转化时都需制备新鲜的感受态以保证高转化率。

酿酒酵母电转转化步骤如下：

(1)取3～5μl的线性质粒或质粒(浓度≥300ng/μl)和40μl的酿酒酵母感受态细胞于预冷过的1.5ml离心管混合均匀，并转移至2mm的电转杯中，冰上预冷5min。

(2)用纸擦净电转杯上的水滴，采用电转仪在1500v的电击强度下电击。

(3)在电转杯中加入1ml的ypd培养基，轻轻悬浮转移至灭菌的1.5ml离心管，30℃下静置复苏2h。待复苏后，用灭菌水清洗3遍，涂适量的细胞于相应的平板上。30℃下培养2-3天直至出现单菌落。

5.所构建的t7表达系统在酿酒酵母中表达重组蛋白效果的检测

控制t7rnap基因表达的是gal启动子，该启动子需要在以半乳糖为碳源的诱导条件下所表达，所以酿酒酵母重组菌株可首先在sd-ura中培养24h后再用sg-ura诱导培养48h，否则t7rna聚合酶不会参与t7表达系统发挥自身的功能。

潮霉素抗性蛋白(hph)报告基因在酿酒酵母重组菌株中的表达检测

<菌落大小和生长状态>

nanoluc^tm萤光素酶(nluc)报告基因在重组酿酒酵母菌株中的表达检测

将上述三株菌株分别进行如下操作：在sd-ura液体培养基中培养24h后，按1％的接菌量转接到sg-ura液体培养基中培养至一定浓度后，离心收集菌体，用过滤除菌的pbs洗涤3次，重悬于无菌的pbs。

检测方法：将nano-glo^tm底物与试剂盒提供的裂解缓冲液以1:50稀释，并与酵母细胞以1:10混合，转移200μl样品到白色96孔板中，立即使用多功能酶标仪的luminescence模式测定生物发光强度，200μl样品转移到96孔透明板用于测定od600。为了比较不同菌之间的差异，实验中的平均生物发光强度用生物发光强度除以od600。样品在测定之前要稀释到合适的浓度(od600＝0.3～0.8)，结果如图8所示。

图8中可以看出，不含萤光素酶基因的对照菌株(以control表示)基本没有检测到生物发光信号，携带vpu基因的菌株by4741(ho::nls-t7rnap，ps-vpu/nluc)(以yvpu-nluc表示)生物发光强度是不携带vpu基因的菌株by4741(ho::nls-t7rnap,ps-nluc)(以ynluc表示)的2.0倍。该结果表明vpu蛋白提高了细胞核核膜的通透性，从而促进t7rnap转录的mrna跨膜运输到细胞质中，因此比未携带vpu蛋白的t7表达系统合成更多的蛋白质，实现了高效表达重组蛋白的目的。

增强型绿色荧光蛋白(egfp)报告基因在重组酿酒酵母菌株中的表达检测

对上述三株菌株分别进行如下操作：在sd-ura液体培养基中培养24h后，按1％的接菌量转接到sg-ura液体培养基中培养至一定浓度后，离心收集菌体，用无菌水洗涤3次，重悬于无菌水，通过多功能酶标仪检测荧光基因表达，结果如表1和图9所示。

表1不同酿酒酵母重组菌株的平均荧光强度

<实施例2>基于hiv-1rev-rre调控元件的t7表达系统在哺乳动物细胞中的构建和表达

2.293t细胞包装慢病毒，感染人hela细胞

将上述所构建载体pmscvpuro-t7rnap-nluc-rre和pmscvpuro-t7rnap-rev-nluc-rre转染293t细胞，完成慢病毒包装。通过嘌呤霉素筛选成功转化的转化子。具体操作参照以下293t细胞包装慢病毒及慢病毒感染目的细胞的步骤。

293t细胞包装慢病毒过程如下所示：

(1)当细胞生长至九成满时，弃去细胞培养基，用无菌pbs轻柔润洗一次，加入1ml0.25％胰酶消化。在显微镜下观察到细胞被消化变圆后，弃去胰酶，加入10％fbs的dmem培养基重悬293t细胞，计数5×10⁵个细胞分至6孔细胞培养板的每个孔。

b：准备目标质粒和包装载体质粒：

c：将上述准备的质粒混合液滴加到opti-mem与fugene9的混合液中，室温静置20min；在接种有细胞、含100μl培养基的6孔板的每个孔中加入2–10μl上述混合物。吹吸或使用振荡器振荡10～30s进行混匀，将细胞放回培养箱继续培养。

d：6～8h后对293t细胞换液，注意加液时，不要吹起细胞(沿着皿壁，轻轻地加新培养液)，置37℃细胞培养箱中继续培养48h。

(3)目的细胞的铺板：

目的细胞需要提前一天铺板至六孔细胞培养板中(细胞接种个数是2×10⁵～3×10⁵个)，以保证感染时的密度为30～40％；同时准备一个不感染病毒的对照组。第二天弃上清液，加入含有病毒的培养基进行感染。

(4)慢病毒液的收集：

转染48h后(此时长满293t细胞)，收集上清液于15ml离心管中，3000rpm离心20min，将上清液用0.45μm滤头过滤。再向六孔板加适量培养液，24h之后，可以再次收集上清液，按照每次用量分装，保存于-80℃冰箱中。

慢病毒感染目的细胞(人hela细胞)的步骤如下：

(1)配置3ml培养基1640(10％fbs)，然后加入3ml病毒上清液(剩余的病毒上清液放-80℃冰箱中保存)，24h之后补加4ml1640培养液，保证细胞处于良好状态；

(2)细胞培养板置于细胞培养箱中再培养24h；

(3)48h后，弃上清，更换新鲜培养基6～8ml，并加入相应浓度的嘌呤霉素筛选，杀死未转入dna的细胞；

(4)72h后，选择阴性对照组全部死亡且转染dna组有适量存活的细胞进行单克隆培养，将孔内细胞用有限稀释法分单个细胞到细胞培养用96孔板继续培养。

(5)培养10d左右，挑选细胞单克隆，进行检测。

3.所构建的t7表达系统在哺乳动物细胞中表达重组蛋白效果的检测。

nluc报告基因在人hela细胞株中的表达检测

野生人hela细胞株作为对照，用胰蛋白酶消化野生hela细胞和感染慢病毒的细胞至悬浮，用无菌pbs洗涤3次，并将细胞重悬于无菌pbs。

检测方法：将底物与试剂盒提供的裂解缓冲液以1:50稀释，并按1:10的比例与细胞混合，转移200μl样品到白色96孔板中，立即使用多功能酶标仪的luciferase模式测定生物发光，结果如图12所示。

从图12中可以看出，野生人hela细胞株(以w表示)基本没有检测到生物发光信号。携带rev-rre元件的人hela细胞株(以w-rev-t7rp表示)生物发光强度是不携带rev-rre元件的人hela细胞株(以w-t7rp表示)生物发光强度的4.3倍，说明携带rre元件的mrna可以与rev蛋白结合，促进t7rnap转录的mrna出核，完成翻译过程，连续稳定地表达目标蛋白。

<实施例3>基于hiv-1vpu蛋白的t7表达系统在哺乳动物细胞中的构建和表达

选取人源磷酸甘油酸激酶基因的启动子pgk1作为表达t7rnap和vpu的启动子，t7rnap和vpu蛋白的表达通过2a或者ires连接来实现，最终构建得到pmscvpuro-t7rnap-vpu。以2a连接为例，构建流程如图13所示。

2.293t细胞包装慢病毒，感染人hela细胞

将上述所构建载体pmscvpuro-t7rnap-nluc和pmscvpuro-t7rnap-vpu-nluc转染293t细胞，完成慢病毒包装。通过嘌呤霉素筛选成功转化的转化子，具体操作参照实施例2中293t细胞包装慢病毒及慢病毒感染目的细胞的步骤。

3.所构建的t7表达系统在哺乳动物细胞中表达重组蛋白效果的检测。

nluc报告基因在人hela细胞中的表达检测

野生人hela细胞株作为对照，用胰酶消化野生人hela细胞和感染慢病毒的细胞至悬浮，用无菌pbs洗涤3次，并将细胞重悬于无菌pbs。

检测方法：将底物与试剂盒提供的裂解缓冲液以1:50稀释，并按1:10的比例与细胞混合，转移200μl样品到白色96孔板中，立即使用多功能酶标仪的luminescene模式测定生物发光，结果如图15所示。

从图15可以看出，野生人hela细胞株(以w表示)基本没有检测到生物发光信号。携带vpu蛋白的人hela细胞株(以w-vpu-t7rp表示)生物发光强度是不携带vpu蛋白的人hela细胞株(以w-t7rp表示)生物发光强度的4.5倍，说明vpu蛋白可以提高细胞核核膜通透性，帮助t7rnap转录的mrna出核，完成翻译过程，实现连续稳定高效地表达目标蛋白。

<实施例4>基于rev-rre的t7表达系统在酿酒酵母与人hela细胞中表达蛋白的差异

参照实施例1构建适用于酿酒酵母的基于rev-rre的t7表达系统，首先将rev基因片段(参见，序列表中的seqidno：3)插入载体pesc-uragal双向启动子的下游，构建质粒载体ps-rev。合成pt7-ires-egfp-rre片段，用无缝克隆的方法将前述片段插入质载体ps-rev，构建质粒ps-rev/egfp/rre，载体构建过程如图16所示。参照实施例1中4的方法构建酿酒酵母菌株by4741(ho::nls-t7rnap,ps-rev/egfp/rre)。参照实施例2以egfp为报告基因，构建适用于人hela细胞的基于rev-rre的t7表达载体pmscvpuro-t7rnap-rev-egfp-rre，构建过程如图17所示。以增强型绿色荧光蛋白(egfp)为报告基因按照实施例1的方法进行测定，比较基于rev-rre调控元件的t7表达系统在酿酒酵母和人hela细胞中表达重组蛋白的作用，结果如表2所示。

表2酿酒酵母与人hela细胞的平均荧光强度

从表2可以看出，基于rev-rre调控元件的t7表达系统，在酿酒酵母中control1和yrev-rre-egfp间荧光强度差异不大，说明yrev-rre-egfp基本没有绿色荧光蛋白的表达。在人hela细胞中，w-t7rp-rev-egfp-rre的荧光强度是control2的21.3倍，说明基于rev-rre元件的t7表达系统在哺乳动物细胞的蛋白表达优于酿酒酵母。

本申请开发了一种用于真核生物生产蛋白质的表达系统，通过hiv-1vpu膜蛋白和rev-rre调控元件帮助t7rnap转录的缺乏5′cap结构的mrna运输到细胞质，从而实现在真核细胞中持续稳定高效地表达重组蛋白。

<120>一种t7rna聚合酶和t7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法

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