（一）BCECF测定pH值1. 储存液配制 BCECF-AM溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分装后，－20℃避光保存。2. 染色步骤将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入BCECF-AM（终浓度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。（二）SNARF-1定量比率测定pH值1． 储存液配制　SNARF溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分装后，－20℃避光保存。2．染色步骤　将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入SNARF-1-AM（终浓度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。（三）Indo-1测定细胞内Ca2+1． 储存液配制　Indo-1（分子量为840），活细胞标记常选用Indo-1AM，分子量为1010，呈干粉状，将其溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分装后，避光冷藏保存。2． 染色步骤　将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入Indo-1AM（终浓度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。也可用弱的去垢剂Pluronic F-127助染。可将PluronicF-127溶于DMSO配成20%（W/V）的溶液，终浓度1%～2%。（四）Fluo-3测定细胞内Ca2+1. 储存液配制　Fluo-3（分子量为855），活细胞标记常选用Fluo-3AM，分子量为1130，呈橙色粉状，避光冷藏保存或将其溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分装后，避光冷藏。2. 染色步骤 将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入Fluo-3AM（终浓度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。可用Pluronic F-127助染。方法同上。（五）CFDA测定细胞间通讯1．储存液配制CFDA即5-（6）-羧基荧光黄乙酰乙酸盐（5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate，5(6)-CFDA），分子量为460.40，用乙醇或DMSO配成10mg/ml溶液，等份分装后，避光冷藏。2． 染色步骤将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入CFDA溶液（终浓度10-20ug/ml），37℃孵育10～15min。用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。（六）DiBAC4测定细胞膜电位染色步骤1． 培养细胞用DiBAC4孵育，37℃，10～20min，终浓度2～5μmol/L。2．激光扫描共聚焦显微镜观察，实验中注意将细胞内外的DiBAC4浓度保持一致。如果细胞去极化，如增加溶液的KCl浓度10～15μmol/L，DiBAC4荧光强度增强。（七）Rhodamine 123标记活细胞线粒体染色步骤培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍加入Rhodamine123溶液（终浓度1μg/ml），37℃孵育10～30min用PBS冲洗2遍激光扫描共聚焦显微镜观察。（八）AO显示RNA和DNA染色步骤培养细胞用95%酒精固定10～15min，干燥。1%醋酸酸化30s。0.01%AO染色5～10min。PBS（pH4.8）洗1min。0.1mol/L CaCl2分化30s或用水洗数分钟。激光扫描共聚焦显微镜观察。（九）PI显示DNA染色步骤培养细胞用PBS洗2遍，离心。弃上清液留0.5ml，用PBS将细胞密度调整为1×106/ml。加入浓度为5mg/50ml的RNAase 0.5ml，37℃消化30min。取出放入冰浴中，加入浓度为5mg/100ml的PI 1.5ml ， 染色至少30min。300目尼龙网过滤。共聚焦显微镜观察。来源网络，仅供参考。[转载]细胞凋亡检测和细胞周期检测
细胞凋亡分析总体原则是什么？
（1）因为细胞凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；所以需进行多指标同时检测；
由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；而每个指征维持有一个时间段，所以需要在不同时间点进行采样，以保证检测结果的准确性；
实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现假阳性或者假阴性.
Annexin VTUNEL、
DNA LadderCaspase 3
Annexin VDNA
JC-1、Caspase3/ 9
Caspase3/ 8Bap31
ARFNFκB JNKARK
检测凋亡之前,
为什么要确定细胞凋亡发生的时间?
由于细胞凋亡不同时间出现的分子事件不同,所以需要在不同的时间点进行采样，取样过早凋亡事件尚未发生,出现假阴性,取样过迟,凋亡完成也检测不出对应的分子变化事件,因此需预试验确定凋亡发生的时间,以保证检测结果的准确性；
4. 凋亡主要包括几条信号通路？代表分子是什么？如何检测？
凋亡信号通路主要包括外源死亡受体通路、内源线粒体通路和内质网通路。
l 外源死亡受体通路
代表分子： TNF、FAS、FASL（CD95L）、TRAIL
及其受体； TRADD、Caspase3、
Caspase 8、NF-κB等
l 内源线粒体通路
代表分子： Bcl-2家族（抗凋亡Bcl-2、Bcl-Xl、Bax
等；诱导凋亡Bid等）、细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9
l 内源内质网通路
代表分子： caspase-12、GADD153/CHOP, ALG-2, VCP
l 信号分子均可通过蛋白免疫印迹杂交（Western Blotting）、免疫组化检测。
5. Annexin V
有几种荧光标记的？分别是什么？
Annexin V有多种荧光标记的，主要包括：
绿色荧光EGFP/FITC标记，橙红色P E标记，蓝色APC标记。
客户可根椐自已的样本选择如下产品：
Annexin V-EGFP/PI
或Annexin V-FITC/PI，膜绿核红
双染试剂盒
Annexin V-PE/7-AAD 膜橙核红
双染试剂盒
Annexin V-APC/PI膜蓝核红
双染试剂盒
Annexin V-FITC/PI
6. Annexin V/PI试剂盒中是否含有钙离子？为什么？浓度？
Annexin V试剂盒中Binding Buffer含有钙离子，原因：因为Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力，试剂盒中Binding Buffer含有钙离子，可以促进Annexin V与PS的结合。Binding Buffer中钙离子浓度为：5mM。
7. 为什么用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞?
Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，
EDTA会络合Ca2+离子，影响Annexin V与PS的结合，因此建议不用含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。如必须使用含EDTA的胰酶，建议在收集细胞，PBS洗涤细胞后，增加一步用Binding Buffer洗涤细胞。
为什么做Annexin
V-FITC/EGFP检测，细胞不能固定?
细胞固定后可能导致荧光的淬灭，所以不要固定样品。
为什么胰酶消化后的细胞建议保存在2％的BSA中?
细胞经过胰酶消化后可能导致胰酶对细胞的进一步作用从而致使细胞进一步凋亡，建议胰酶消化后的细胞保存在2％的BSA中。
Anexin V EGFP与FITC有什么区别？
EGFP是一种绿色荧光蛋白，GFP是一种来自水母的生物发光物质,
在紫外光激发下可发绿色荧光. EGFP是GFP的突变体,
其荧光强度比GFP强4 ~35
倍，EGFP分子量(27 kD).
而且无细胞毒性, Annexin V-EGFP是融合的重组蛋白，其绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点, EGFP与PS的结合比例保证为1：1，还可用来定量细胞膜上PS分子数目。而FITC是一种小分子的荧光素，分子量只有389.38，后标记于Annexin V分子上，性质不如Annexin V-EGFP稳定，荧光信号不如Annexin V-EGFP强，荧光易淬灭。
新鲜组织怎样制备成细胞悬液?
小组织块加入1～2mL的冷裂解液，置冰上，用小解剖剪尽量剪切碎；冰上静置5分钟，移液枪小心吸取上清（细胞悬液），弃沉淀（组织残渣）；上清离心转/分，细胞沉淀用冷PBS（不含EDTA）洗涤重悬，得细胞悬液。
12. Annexin
V，细胞周期和凋亡检测试剂盒是否可以用于检测组织样本？如何做？
Annexin V，细胞周期和凋亡检测试剂盒可以用于检测组织样本。先要把组织制备成细胞悬液后才能进行凋亡检测。
l MTTXTTWST-1
CCK-8CFSEBrduSRB
PCNA Ki67NIFK
NuMA p8 CDT2ECT2Mitotic
CellsMTMR8
CCK-8MTTXTT?
G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
S期，指DNA复制的时期，只有在这一时期H3-TDR才能掺入新合成的DNA中；
G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；
M期又称D期(mitosis or
division)，细胞分裂开始到结束。
G0期为细胞休眠期,暂不分裂
细胞凋亡时，正常G0/G1细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰（sub-G1）
细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，是造成细胞周期差异的主要原因。
细胞周期检测可使用七海复泰生物细胞周期检测试剂盒。
16.细胞周期试剂盒、七海复泰生物PI染液，
Anexin V/PI双染试剂盒中的PI三者有何不同？是否可以相互替代混用？
? 三者中PI的浓度不同；
? 细胞凋亡PI染色试剂盒RNase A客户需要自备，而细胞周期试到剂盒中配有
? 细胞凋亡PI染色试剂盒用荧光显微镜观察和流式细胞仪分析，细胞周期检测试
剂盒用流式细胞仪分析；
? 三者不能相互替代混用。
17.在细胞周期检测结果中出现峰宽情况是什么原因造成的?
? 流式细胞仪的流速太快，建议调整流式细胞仪的流速；
? 样品中有气泡，检查样品中是否有气泡；
? 样品中有坏死细胞，建议更换样品。
18.在细胞周期检测结果中出现无样品峰是什么原因造成的?
可能样品中无细胞核，坏死细胞过多，细胞碎片过多。建议显微镜观察样品或更换样品；
19.七海复泰生物有哪些荧光染料产品，各种染料的作用？激发和发射波长？
细胞荧光染料是生命科学研究中重要的标记物、示踪剂和指示剂，可用于抗体标记、细胞定位、细胞增殖指示、凋亡特征指示、Ca2+离子示踪等作用。
七海复泰生物主要提供或代购细胞核荧光染料（吖啶橙AO、溴化乙锭EB、Hoechst、碘化丙啶PI、DAPI、7-AAD等）；线粒体指示剂（罗丹明123、
JC-1）；内质网指示剂（DiOC6(3)
、FM 1 4 3）；抗体或蛋白标记荧光探针（EGFP、FITC、PE、Cy系列）；活细胞示踪CFSE
；PH指示剂（BCECF-AM、Carboxy SNARF-1）等荧光染料产品。
20.染色时无法区分正常细胞和凋亡细胞原因?
无凋亡细胞或凋亡细胞数量很少，诱导凋亡细胞的方法不正确。延长诱导细胞凋亡的时间，或选择其他的方法诱导细胞凋亡。
21. 流式实验有哪些注意事项？对样本的有何要求？
建议送检细胞一定要足够量，一般要求1&106个细胞。不要过少。因为，如细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果也不可信。细胞量也不宜过多，因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也由此受影响。
整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
操作时注意避光，反应完毕后尽快检测。
对照组的设置：在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。
在实验过程中，在保证实验的科学性和准确性的基础上，应尽量减少实验工序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长，如再加之操作的不熟练，细胞更容易丢失和受损，而造成实验结果的误差。
样品的制备：
流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号，因此，细胞必须做成单个细胞悬浮状态，不能聚集，也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异（如特异单抗），而且不允许渗透至载液中。标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系，要经Ficoll
分离，作单细胞分离处理，但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等)，化学法（EDTA、EGTA
和柠檬酸盐）消化分散液或洗液,最好用无钙、镁PBS，柠檬酸盐的浓度为40μmol/L，并同时采用机械分散法，将经消化处理的膨松组织，用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可，用PBS
次后重悬，最好过一下尼龙或不锈钢网筛孔径100μm
和20μm。细胞浓度要保证在1-2&106/mL
22.看不懂流式图，是否能帮老师进行结果分析？（如细胞周期、Annexin/ PI双染等）
七海复泰生物技术支持可以帮老师进行流式结果分析，将流式图发送至说明情况即可。
23.流式抗体如何选择？
现在有各种荧光标记的抗体，进行选择时首先要满足的就是所选择的抗体必须在流式上能够检测，选择时有以下几个原则：
流式检测时首推荧光物质直接标记的抗体，如果没有直接标记的抗体，用间接法，
即二抗上标记荧光分子同样可以。不过这增加了处理的难度，处理步骤增多，往往
会不同程度影响检测结果。
有一些抗体明确写明适合流式检测，而另一些则表明适合免疫组化、Western
Blotting等，首选前者，可以保质保量，但是后者并不是不可以用，一般来说如果
没有明确的表明适合流式检测的抗体，采用后者也是可以的，不过要注意其检测结
果不一定非常理想。
标记的荧光要根据实验方案确定，尽量使几个检测标记在不同的通路。
绿色荧光蛋白等本身有荧光的物质在检测时会占据一个荧光通道，它和FITC是一
个荧光通道，不能一起检测。可选用PE等其它荧光标记的抗体。
如果是检测淋巴细胞这类细胞，经常用到多种抗体同时标记，选择时切勿选错。一般倾向于选择多重标记，因为这样可以减少抗体和细胞用量，特别是对于小鼠的血标本，经常采到的血量微少，采用多重标记更有利。当然这要求流式操作者有较高的水平，注意调节流式仪的各种参数。
单抗和多抗均可应用。
上海七海复泰生物科技有限公司
以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。BCECF,AM-PH荧光探针
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　　CAS#：-7
　　中文名：2',7'-二-(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素乙酰甲酯
　　英文名：2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester
　　结构式：
　　分子式：C39H36O19
　　分子量：808.69
　　性质：
　　1. 外观：白色粉末
　　2. 纯度：≥90% (HPLC)
　　3. 产品描述：
　　BCECF, AM是一种可以穿透细胞膜检测细胞内pH的荧光染料。BCECF, AM没有荧光，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。最大激发波长和发射波长因pH的不同而有所不同，最大激发波长在503nm左右，最大发射波长在520nm左右，实际检测时推荐使用的激发波长为488nm，发射波长为535nm。
　　BCECF, AM不仅被广泛用于哺乳动物细胞的研究，也有报道用于动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的细胞内pH水平检测。在有细胞内pH变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中BCECF, AM被广泛应用。
　　用于细胞内pH检测时，常用的BCECF, AM的浓度为1～10μM。
　　4. 操作说明 (for Human Neutrophil)*
　　(1) 试剂
　　1 mM的BCECF, AM/DMSO
　　HEPES 缓冲液(20 mM HEPES, 153 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM glucose, pH 7.4)
　　(2) 操作
　　①. 用HEPES制备细胞悬液，细胞浓度为4×107个/mL。
　　②. 将1mM的BCECF, AM/DMSO溶液加入细胞悬液中(细胞悬液的1/300体积)，BCECF, AM终浓度为3&M。
　　③. 在37 &C培养30分钟。
　　④. 用HEPES缓冲液清洗细胞3次，制成3×106个/mL的细胞悬液。
　　⑤. 使用荧光显微镜或带有图像分析系统的激光共聚显微镜检测细胞的荧光强度。
　　*标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定最佳条件。以上方法仅供参考。
　　储存条件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。
　　注意事项：
　　BCECF, AM可能对人体有害，请注意适当防护。
　　荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
　　为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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