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我爱加倍游 V2.4 官方最新版 / 网吧奖励软件
网友评分：5分
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&【回复此贴，奖励加倍】关于DCFH-DA探针检测细胞内ROS实验，急求帮助，非常感谢！
【回复此贴，奖励加倍】关于DCFH-DA探针检测细胞内ROS实验，急求帮助，非常感谢！
作者 阿飞1990乖乖
本人最近在做细胞内活性氧ROS检测实验，细胞为HEK-293细胞，采用96孔板，实验分组为control对照组（只加细胞）、损伤组（加细胞，然后用双氧水损伤）、实验组（加细胞，后加样品处理，最后加双氧水损伤）。实验结束时吸弃培养液，加入浓度为10uM的DCFH-DA荧光探针溶液，在37℃细胞培养箱内孵育20分钟，后用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。最后用多功能酶标仪检测荧光强度，或用激光共聚焦显微镜观察细胞荧光强度。现主要有以下三个问题，求教有此实验经验的同学和老师，希望能和大家交流下，非常感谢！
1、做柱状图时，纵坐标为荧光或相对荧光强度。荧光强度是以对照组的荧光强度为基准来计算吗？看了好多文献，数值范围差的很多。想请教您是如何计算这个数值的？
2、按照说明书，最后一步用无血清细胞培养液洗涤细胞三次去除残余荧光探针后，是直接上酶标仪测或者上激光共聚焦显微镜观察。孔板里面一点培养液都不要的话，这样细胞不受影响吗？
3、由于HEK-293细胞贴壁能力一般，虽然操作很温柔，但在最后润洗中还是会不可避免的吸掉一小部分细胞，尤其经过损伤的细胞，死细胞都被润洗掉了，这样会导致control组比损伤组的ROS含量还要高，这不符合实验预期结果呀！而且在激光共聚焦显微镜下观察，会发现细胞数量很少！请问大家是怎样处理的呢？有什么固定细胞的方法吗？
背景：本人购买的是sigma公司的DCFH-DA荧光探针粉末（2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate），DMSO配成10mM储备液，-20℃保存，实验时稀释1000倍至浓度为10uM使用。DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)是非标记性的氧化敏感的荧光探针，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光以判定细胞内活性氧的水平。
[ Last edited by silicare on
at 08:09 ]
呵，我也不懂
楼主的培养基是无酚红的么？据我查资料，貌似酚红对DCFH-DA荧光探针是有影响的。问题1，我看的荧光值范围也特别大，有的文献是直接用倍数表示的，我认为这个值不成问题，重要是结果的趋势是不是想要的。问题2，据我了解，应该需要加一点液体覆盖的，覆盖就好。96孔板的话，加50ul绰绰有余了。问题3，我也遇到过楼主说的洗涤细胞会掉的情况，我的作法是降低了DCFH-DA的浓度（前提是我的实验在10uM的荧光很强，降低浓度并不影响我的结果趋势），当然适当的延长了孵育时间（25min），洗涤2次。另外，因为细胞铺板状况本身孔与孔之间就有差异，再加上洗涤细胞脱落的情况，导致孔之间本身就存在差异，我用多功能酶标仪读取的荧光值并不理想，最终选用in cell analyzer 这个仪器，效果很好。个人认为荧光酶标仪对铺板和洗涤的技术要求较高。
希望可以多多交流，增长经验。
引用回帖:: Originally posted by fanny428x at
呵，我也不懂 谢谢帮顶！
引用回帖:: Originally posted by daisykang at
楼主的培养基是无酚红的么？据我查资料，貌似酚红对DCFH-DA荧光探针是有影响的。问题1，我看的荧光值范围也特别大，有的文献是直接用倍数表示的，我认为这个值不成问题，重要是结果的趋势是不是想要的。问题2，据我 ... 多谢热心应助！
培养基用的是酚红培养基，下次换成无酚红的试试。
问题1，以前几次实验在润洗细胞后，细胞损失非常少，但还是会出现对照组比损伤组和实验组荧光强度高的现象。我是这样理解的：损伤组和实验组都加过双氧水，虽单个细胞荧光强度高，但由于细胞存活率下降，活细胞减少，导致总荧光强度低。所以处理数据方法是：做ROS实验时，同时用另一个96孔板做样品对过氧化氢损伤细胞的保护作用，铺板方案同ROS实验，测得每孔细胞的存活率。由于存活率和活细胞数成正比，可把存活率数据看做相对的活细胞数。然后用ROS实验测得每孔的荧光值，除以相应孔的细胞存活率数值，这样得到每孔的单个细胞相对荧光强度，最后用此数据做柱状图，这样得到了与预期相符的趋势。请问这样处理数据对吗？
问题2，后来跟实验室一个老师交流了下，她说当然需要液体覆盖，要不孔板里干巴巴的细胞都会死掉。下次检测前我用培养液覆盖一下。
问题3，我们这边没in cell analyzer 这台仪器。下次减少洗涤次数，洗涤要更小心了，但不太明白降低DCFH-DA浓度如何理解？这样可以避免把细胞洗涤掉吗？
问题较多，期待您的回答，
引用回帖:: Originally posted by daisykang at
楼主的培养基是无酚红的么？据我查资料，貌似酚红对DCFH-DA荧光探针是有影响的。问题1，我看的荧光值范围也特别大，有的文献是直接用倍数表示的，我认为这个值不成问题，重要是结果的趋势是不是想要的。问题2，据我 ... 问题3，刚想了下，降低DCFH-DA浓度是为了减少洗涤次数吧，哎，瞧我这这智商，基本上告别科研了。刚开始做，有点蒙圈了。
真心想帮楼主一下，不过我们学的完全不同，确实是心有余而力不足啊，希望能早点解决问题！
引用回帖:: Originally posted by RanqiLeo at
真心想帮楼主一下，不过我们学的完全不同，确实是心有余而力不足啊，希望能早点解决问题！ 谢谢
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与700万科研达人随时交流已奖励 〓烤鸭同盟〓【雅思词汇 follow me】第三百五十四期（万圣节参与奖励加倍）
雅思考试由于没有词汇大纲类，所以词汇是所有烤鸭们最为头疼的部分，让我们一起努力掌握住雅思的核心词汇，相信雅思必能被我们拿下！^^
节目形式如下：
1.每期出2个核心词汇，供大家记忆。并给出单词或词组的例句，给大家加深印象。
2.本节目为每周两期。
3.每期题目，主持人出汉语意思，大家听例句的音频，写出缺少的英语单词，并拼写出来，例如：
题目：聚会，集会
答案：party，p-a-r-t-y
4.有条件的筒子们可以将自己读出的单词和句子音频放上来，更加加深印象噢！有额外奖励哒~O(∩_∩)O
5.奖励方式：听写单词奖励100HY，拼写单词奖励100HY，上传音频奖励150HY
本期词汇：
<font color=#. n.
障碍，困难
妨碍，使不利
eg: The bad weather severely ______ their performance in the race.
恶劣的天气极大地妨碍了他们的比赛成绩。
使疲乏，骚扰，不断攻击（敌人）
eg: The judge accepted the defendant 's undertaking not to ______ the plaintiff.
法官接受了被告不骚扰原告的承诺。
本期题目：
1. n.
障碍，困难
妨碍，使不利
使疲乏，骚扰，不断攻击（敌人）
今天是西方的万圣节~乃是肿么度过的捏？认真参与节目均奖励500HY
小贴士：100个句子记忆7000雅思词汇
13. Essentially, a theory is an abstract, symbolic representation of what is conceived to be reality.
理论在本质上是对认识了的现实的一种抽象和符号化的表达。
-----------以下内容回复可见-----------
《雅思核心词汇参考书籍》：
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雅思词汇测试：
最后编辑于： 22:51
本帖来源社刊
第二季我们选用的是AWL词汇表作为我们的学习内容。
本社刊汇集的是雅思核心词汇，运用背诵的方法，帮助大家记忆词汇！
雅思考试由于没有词汇大纲类，所以词汇是所有烤鸭们最为头疼的部分，让我们一起努力掌握住雅思的核心词汇，相信雅思必能被我们拿下！
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五一期间，来无机物化版有效应助奖励加倍，无机物化版团队祝大家五一快乐~
凡是五一期间（国定假期内）来无机物化版应助发帖奖励全部加倍~\(^o^)/~
祝大家五一快乐，旅游的高高兴兴，回家的开开心心，搞科研的顺顺利利~\(^o^)/~
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