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Bcl_,2_下调APE1活性抑制NNK诱导DNA损伤后AP位点的修复_NoRestriction
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Bcl_,2_下调APE1活性抑制NNK诱导DNA损伤后AP位点的修
关注微信公众号上传用户：hzytaanetq资料价格：5财富值&&『』文档下载 ：『』&&『』学位专业：&关 键 词 ：&&&&&权力声明：若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请点击。摘要:（摘要内容经过系统自动伪原创处理以避免复制，下载原文正常，内容请直接查看目录。）目标脱嘌呤/脱嘧啶位点（AP site）是DNA毁伤最多见的情势,平日由碱基切除修复门路修复,而APE1是该修复门路的一个主要成份;Bcl2是细胞内一主要的肿瘤卵白,它的致癌活性因克制多种DNA修复门路惹起,包含碱基切除修复门路,Bcl2能克制NNK引诱剂的DNA毁伤后发生AP位点的修复,但其机理仍不清晰,为了摸索Bcl2克制DNA毁伤AP位点的修复的份子机理,停止Bcl2与APE1能否直接互相感化的研讨。办法Western Blotting检测Bcl2、APE1和XRCC1卵白的表达情形,单细胞电泳、定量检测AP位点来不雅察DNA毁伤水平,免疫沉淀检测Bcl2卵白和APE1卵白,APE1卵白和XRCC1卵白互相感化,免疫荧光染色检测Bcl2、APE1卵白的细胞散布情形及其变更,亚细胞构造分别提取卵白不雅察Bcl2卵白在细胞核及线粒体中表达程度及其变更,APE1核酸内切酶活性测定不雅察Bcl2对APE1核酸内切酶活性的影响及其Bcl2的BH联合域的关系。Bcl2SiRNA搅扰技巧不雅察Bcl2内源性表达被克制后对APE1核酸内切酶活性的影响。粒的H1299细胞中AP位点数目也鄙人降,但比前一组慢,仍保持在较高程度,解释去失落NNK后未转染Bcl2质粒的H1299细胞中DNA毁伤在慢慢修复,而转染野生型Bcl2质粒的H1299细胞中DNA毁伤后AP位点的修复遭到克制。NNK处置1小时后两组H1299细胞的细胞核均有拖尾景象,解释NNK可使H1299细胞中DNA产生毁伤;去失落NNK引诱剂后24小时不雅察产生未转染H1299细胞中DNA的细胞核未有拖尾景象景象,解释DNA毁伤已获得修复,但另外一组细胞中仍有部门细胞核有拖尾,解释DNA毁伤仍有部门未获得修复,再次解释Bcl2卵白对NNK引诱的DNA毁伤后的修复有克制感化。用H2O2和NNK引诱DNA毁伤后,免疫沉淀可以检测到Bcl2卵白,解释Bcl2卵白和APE1卵白可以直接互相感化;免疫荧光染色可以看到白色的Bcl2卵白和绿色的APE1卵白在细胞核中积累,叠加今后细胞核中涌现橙色雀斑,解释Bcl2和APE1卵白在细胞核中直接互相感化。NNK处置1小时后,H460细胞的细胞核中Bcl2卵白开端增长,3小时后到达最高,而线粒体中Bcl2卵白没有变更,解释Bcl2卵白在DNA毁伤引诱下在H460细胞核积累,核中Bcl2卵白的增长其实不是从线粒体直达移过去的。APE1卵白在一切肺癌细胞中均有较好表达,但内源性Bcl2卵白仅在H69和H460肺癌细胞中表达。同位素法检测一切肺癌细胞中APE1的活性,发明H69和H460细胞中APE1活性显著比其它肺癌细胞中APE1活性低,解释有内源性Bcl2卵白表达能克制APE1的活性。用转染野生型Bcl2和缺掉渐变型△BH1、△BH2、△BH3、△BH4质粒的H1299细胞作免疫共沉淀发明仅野生型Bcl2组能检测到Bcl2卵白,而其它缺掉渐变型组未能检测到Bcl2卵白,解释Bcl2卵白和APE1卵白直接互相感化与Bcl2的四个联合域BH1、BH2、BH3和BH4都有关。对转染野生型Bcl2和缺掉渐变型Bcl2质粒的H1299细胞中APE1核酸内切酶活性定量检测,发明野生型组APE1核酸内切酶活性低,而缺掉渐变型各组APE1核酸内切酶活性高;可以揣摸野生型Bcl2对APE1卵白核酸内切酶活性有克制感化,这类克制感化与野生型Bcl2卵白的四个联合域都有关,Bcl2卵白的BH联合域的任一缺掉都邑招致Bcl2对APE1卵白核酸内切酶活性和AP位点修复的克制才能消逝。各组APE1核酸内切酶活性定量检测成果野生型组APE1核酸内切酶活性显著低于缺掉渐变型各组。将纯化的野生型Bcl2和BH缺掉型△BH1、△BH2、△BH3、△BH4卵白停止体外实验,发明成果与体内实验成果分歧。将Bcl2siRNA转染到H460细胞组中发明Bcl2卵白表达很低,而对比组Bcl2卵白的表达程度未有转变;同位素法检测APE1核酸内切酶活性成果发明Bcl2siRNA三组APE1核酸内切酶活性降低,从而可以揣摸Bcl2卵白可以克制APE1核酸内切酶活性。H1299肺癌细胞和转染野生型Bcl2质粒的H1299肺癌细胞中APE1和XRCC1两种DNA毁伤修复卵白均有比拟高程度的表达,而Bcl2卵白仅在转染野生型Bcl2质粒的H1299细胞中涌现;DNA毁伤引诱剂NNK处置后,免疫共沉淀实验发明未转染的H1299细胞组中检测XRCC1卵白,而且NNK处置后XRCC1增多,转染野生型Bcl2质粒的H1299细胞组中固然也能检测到XRCC1,而且NNK处置后XRCC1也增多,但显著比前两组少许多,解释Bcl2卵白可以搅扰APE1和XRCC1DNA修复复合物的构成。将分歧浓度的纯化Bcl2卵白停止体外实验,发明跟着纯化Bcl2卵白浓度的降低,检测到的XRCC1愈来愈少,解释纯化的野生型Bcl2卵白体外可以或许克制APE1/XRCC1的修复复合物的构成,从而克制DNA毁伤后AP位点的修复。结论1.Bcl2可以或许克制NNK和H2O2引诱的DNA毁伤后发生AP位点的修复。2.当NNK引诱DNA毁伤时细胞核中Bel2表达程度增长,但不是从线粒体直达移过去的。3.Bcl2经由过程它的联合域与APE1直接互相感化下调APE1活性,有助于延缓DNA修复,形成遗传不稳固和肿瘤产生。4.Bcl2卵白能在体表里离解DNA修复复合物APE1/XRCC1,从而克制DNA毁伤后AP位点的修复。Abstract:Target off apurinic / apyrimidinic sites (AP site) is a kind of DNA damage is the most common situation, daily by the base excision repair roads repair and APE1 is a key element BCL2 is cells within a tumor protein, its carcinogenic activity due to the restraint of various DNA repair roads cause, contains base excision repair roads, BCL2 was able to restraint of NNK attractant in DNA damage repair of AP sites, but the mechanism is still not clear, in order to explore the molecular mechanism of repair of BCL2 restrain DNA damage of AP sites, stop BCL2 and APE1 can directly affect to each other seminars. Way western blotting to detect the BCL2, APE1, XRCC1 protein expression, single cell electrophoresis and quantitative detection AP sites to indecent observes the DNA damage level, immunoprecipitation to detect the BCL2 protein and APE1 protein, APE1 protein and XRCC1 protein affects mutually, immunofluorescence staining to detect the BCL2, APE1 protein cells spread and change, subcellular structures were extracted protein observations of BCL2 protein in nuclei and mitochondria in the expression level and the alteration, APE1 endonuclease activity determination not Yacha BCL2 of APE1 endonuclease activity influence and BCL2 BH domain. The Bcl2SiRNA expression of Bcl2 was not disturbed by the technique of endogenous effects on APE1 endonuclease activity after restraint. Particle H1299 cells number of AP sites are falling, but more than a group of slow remained in higher level, to explain the loss of NNK not BCL2 plasmid transfected H1299 cells in DNA damage in slowly repaired, and wild-type Bcl-2 plasmid H1299 cells after DNA damage repair of AP sites was restrained. NNK disposal after 1 hour of H1299 cells of two groups of nuclei were trailing scene, explain NNK can enable H1299 cells DNA to lost NNK lure agent after 24 hours of observations have not transfected H1299 cells DNA nucleus no trailing scene scene, explain the DNA damage has been repaired, but also a group of cells still Department nucleus tailing, explaining there is still department did not receive the repair of DNA damage, once again explain BCL2 protein on the NNK induce DNA damage repair the restraining effect. H2O2 and NNK induce DNA damage and immunoprecipitation can be detected the expression of BCL2 protein, explain the BCL2 protein and APE1 protein can directly
immunofluorescence staining can see white BCL2 protein and green of APE1 protein accumulation in the nucleus, the emergence of orange freckles superposition in the nucleus and explain BCL2 and APE1 protein in the nucleus directly affects mutually. NNK treatment 1 hour after, H460 cell nuclei of BCL2 protein begin to increase, after 3 hours reach highest, and mitochondrial Bcl-2 protein did not change, the interpretation of BCL2 protein in DNA damage under the lure in H460 cell nuclear accumulation, growth of nucleus of BCL2 protein actually not from mitochondria direct moved in. APE1 protein in all lung cancer cells have better expression of endogenous Bcl2 protein expression, but only in H69 and H460 in lung cancer cells. Isotope method for the detection of all lung cancer cell in APE1 activity, invention of APE1 activity in H69 and H460 cells significantly than other cells of lung cancer in APE1 activity low interpretation of endogenous Bcl-2 protein expression of restraint of APE1 activity. Transfection of wild-type BCL2 and missing graded] bh1,] BH2,] BH3,] BH4 plasmid H1299 cells for immune coprecipitation method of the invention only wild-type Bcl-2 group can detect Bcl-2 protein, while the other missing graded group failed to detect Bcl-2 protein, bcl-2 protein and APE1 protein directly mutual action with BCL2 four federated domains bh1, BH2 and BH3 and BH4 are related. The transfection of wild-type BCL2 and missing graded BCL2 plasmid H1299 cells APE1 endonuclease activity in the quantitative detection, invention wild-type APE1 endonuclease activity was low and missing high gradient type groups of APE1 e can fathom wild-type BCL2 of APE1 protein endonuclease activity restraint effect, is related to both the restraint effect with wild-type BCL2 protein of four joint domain, BCL2 protein BH domain of any missing cities incur BCL2 of APE1 protein endonuclease activity and AP site repair restraint to die. Each APE1 endonuclease activity quantitative detection results of wild type group APE1 endonuclease activity was significantly lower than that of the missing graded group. The purified wild-type BCL2 and BH missing type] bh1,] BH2,] BH3,] BH4 albumen in vitro, inventions and in vivo results differences. Will Bcl2siRNA transfected into H460 cell group invention of BCL2 protein expression level is very low, and contrast group of BCL2 protein expressio isotope detection of APE1 endonuclease activity results invention Bcl2siRNA three groups of APE1 endonuclease activity decreased, which can fathom BCL2 egg white to restraint of APE1 endonuclease activity. Repair XRCC1DNA XRCC1 to Bcl-2 plasmid XRCC1 protein emerging in the Bcl-2 plasmid transfected Bcl-2 plasmid and H1299 lung cancer cells transfected with wild-type H1299 lung cancer cells in APE1, XRCC1 two DNA damage repair egg white were relatively high degree of expression and BCL2 protein only in wild-type H1299 DNA damage attractant NNK treatment, immuno co precipitation experiments invention non transfected H1299 cells were detected in XRCC1 and NNK treatment increased transfection of wild-type H1299 cells group, of course, can detect XRCC1 and NNK treatment also increased, but significantly better than the first two groups with a lot less, explain the BCL2 protein can disturb APE1 and complex. The different concentrations of purified BCL2 protein in vitro and invention followed by purification of BCL2 protein concentration decreased, detect XRCC1 getting fewer and fewer, interpretation of purified wild type of BCL2 protein in vitro can perhaps repair complexes of restraint APE1/XRCC1 so as to repair of AP sites in restraint of the DNA damage. Conclusion 1.Bcl2 can repair DNA damage of NNK and H2O2 to restraint occurred after the AP site. 2 when the degree of increase of Bel2 expression of NNK DNA in the nuclei of damage when tempted, but not to move from mitochondria. Through the process of 3.Bcl2 domain and APE1 combined with its direct interaction contributes to the down-regulation of APE1 activity, delay DNA repair, genetic instability and tumor formation. 4.Bcl2 protein in skin in the dissociation of DNA repair complexes APE1/XRCC1, AP and DNA sites of repair after damage control.目录:中文摘要3-7英文摘要7-10缩略词表12-13前言13-15第一章 Bcl2对NNK诱导的DNA损伤AP位点修复的抑制作用15-24&&&&1.1 实验材料15&&&&1.2 实验方法15-21&&&&1.3 结果21-24第二章 Bcl2蛋白和APE1蛋白相互作用的研究24-29&&&&2.1 实验材料24&&&&2.2 实验方法24-26&&&&2.3 结果26-29第三章 Bcl2抑制APE1活性的分子机理研究29-38&&&&3.1 实验材料29&&&&3.2 实验方法29-31&&&&3.3 结果31-38第四章 Bcl2对DNA修复复合物APE1-XRCC1的分离作用38-44&&&&4.1 实验材料38&&&&4.2 实验方法38-41&&&&4.3 结果41-44讨论44-48结论48-49参考文献49-52脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrinidinic endonuclease,APE1)/氧化还原效应因子-1(redox effector factor-1,Ref-1)的研究进展52-86致谢86-87攻读学位期间主要的研究成果87分享到：相关文献|生物素标记EMSA探针－AP2(0.2μM)
生物素标记EMSA探针－AP2(0.2μM)
&产品编号: GS012B
&产品包装: 200μl
&产品价格: 612.00元
产品简介：
&&&&生物素标记EMSA探针－AP2是用于EMSA(也称gel&shift)研究的并经生物素(Biotin)标记的AP2
consensus oligonucleotide。这个生物素标记的双链寡核苷酸含有公认的AP2结合位点，可以用作EMSA研究时的探针。
&&&&AP2 consensus oligo的序列如下：
&&&&5′-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3′
&&&&3′-CTA GCT TGA CTG GCG GGC GCC GGG CA-5′
&&&&本生物素标记EMSA探针已经过纯化，可以直接用于EMSA结合反应。
&&&&本生物素标记EMSA探针可以和碧云天的配套使用。
&&&&一个包装的生物素标记探针可以进行约200-400个样品的EMSA检测。
包装清单：
生物素标记EMSA探针－AP2(0.2μM)
保存条件：
&&&&-20℃保存，一年有效。
注意事项：
&&&&避免加热到40℃以上，温度过高会导致双链DNA探针解聚成单链。而单链无法用于EMSA研究。
&&&&对于基于生物素标记的EMSA检测的详细操作可以参考碧云天的的使用说明。
&&&&为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. 本生物素标记EMSA探针用于EMSA结合反应时，参考如下步骤进行：
A. 如下设置EMSA结合反应：
阴性对照反应：
Nuclease-Free Water
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X)
细胞核蛋白或纯化的转录因子
生物素标记探针
样品反应：
Nuclease-Free Water
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X)
细胞核蛋白或纯化的转录因子
生物素标记探针
探针冷竞争反应：
Nuclease-Free Water
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X)
细胞核蛋白或纯化的转录因子
未标记的探针
生物素标记探针
突变探针的冷竞争反应：
Nuclease-Free Water
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X)
细胞核蛋白或纯化的转录因子
未标记的突变探针
生物素标记探针
Super-shift反应：
Nuclease-Free Water
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X)
细胞核蛋白或纯化的转录因子
目的蛋白特异抗体
生物素标记探针
&&&注：生物素标记EMSA探针的推荐用量为每个反应0.5微升，如果检测出来的目的蛋白的EMSA条
&&&带偏弱，可以适当加大生物素标记EMSA探针的用量至0.75微升或1微升。
&&&注2：对于冷竞争时使用的未标记的探针或未标记的突变探针，使用量可以根据实际情况调整使用
&&&的体积。推荐的用于冷竞争的未标记的探针或突变探针的用量为生物素标记探针的50-100倍。
B. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，
&&&从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，
&&&混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
C. 加入1μl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响
&&&蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液
&&&在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察
&&&到蓝颜色即可。
2. 对于基于生物素标记的EMSA检测的更多详细操作可以参考碧云天的的
&&&使用说明。
& 相关产品请点击如下按钮：　　报道& 来自复旦大学、匹兹堡大学等机构的研究人员证实，在轻度中风损伤后APE1/Ref-1可促进灰质与白质及神经系统功能的恢复。这一研究发现发布在6月6日的《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。
任职于复旦大学和匹兹堡大学的陈俊（Jun Chen）教授，与美国科学院院士Michael V.L. Bennett教授是这篇论文的共同通讯作者。陈俊教授长期研究脑缺血、脑外伤和帕金森病的细胞死亡分子生物学机制，已发表论文130余篇。
血脑屏障受到破坏是大脑缺血再灌注（I/R）损伤的重要病理学基础。今年早些时候，陈俊教授与首都医科大学宣武医院的吉训明副院长合作领导研究团队对这种损伤进行深入研究，揭示了早期血脑屏障破裂的分子机制及其长期影响。这项研究发表在1月27日的Nature Communications杂志上（ ）。
在这篇新文章中，作者们指出诱导无嘌呤/无嘧啶(AP)位点及DNA链断裂是中风后DNA氧化损伤的一个主要标志。为了减轻DNA氧化损伤后的细胞损失，缺血细胞会快速招募碱基切除修复蛋白如APE1/Ref-1。尽管已知强迫过表达APE1可预防氧化应激诱导的神经退行性变，当前尚没有确凿的证据证实内源性APE1在缺血性损伤后灰质与白质的长期恢复中起作用。
为了弥补这一空白，研究人员构建出了在它莫西芬（tamoxifen）依赖性Cre重组酶控制下的第一个APE1条件性基因敲除(cKO)小鼠品系。利用已得到确认的短暂局灶性脑缺血(tFCI)模型，他们证实诱导删除APE1可显著扩大梗死体积，损害感觉运动与认知障碍恢复。
APE1条件性基因敲除增进了缺血后神经元与少突胶质细胞退化，证实内源性APE1在短暂局灶性脑缺血后保护了灰质和白质。由于白质修复有助于中风后的行为恢复，研究人员还探究了APE1条件性基因敲除对脱髓鞘和轴突传导的影响，发现在短暂局灶性脑缺血后APE1条件性基因敲除加剧了髓鞘丧失，损害了神经元通讯。此外，在短暂局灶性脑缺血后APE1条件性基因敲除提高了AP位点并激活了促死亡信号蛋白PUMA和PARP1。
这些研究结果提供了证据证实，内源性APE1预防了灰质和白质中的缺血性梗死，促进了轻度中风后的中枢神经系统功能恢复。
中风是世界上第二大致死疾病，每年都有数百万人因为中风而死亡，还有更多的人因为中风永久性残疾。这种毁灭性的疾病常常毫无征兆地发生，令患者突然丧失独立生活的能力。Weill Cornell医学院的研究人员最近发现，特定肠道菌能利用免疫系统减轻中风的严重性。这项研究发表在2016年3月的Nature Medicine杂志上()。
弗吉尼亚大学医学院的研究人员确定了，一个科学教条坚持认为在成年期失活的基因，实际上在防止大多数心脏病发作和中风的潜在原因中起着至关重要的作用。这一研究发现为对抗这些致命的疾病开辟了一条新途径，并提出了医生可以利用这些基因来预防或延迟至少部分衰老效应这一诱人的前景。这项研究发表在2016年5月的Nature Medicine杂志上( )。
结合4000多名患者的临床研究及动物模型研究，克利夫兰诊所(Cleveland Clinic)的研究人员第一次证实，肠道细菌可以改变血小板功能，及心脏病发作和中风一类血栓相关疾病的风险。研究论文发表在日的Cell杂志上()。
（：何嫱）
推荐原文摘要：
APE1/Ref-1 facilitates recovery of gray and white matter and neurological function after mild stroke injury
A major hallmark of oxidative DNA damage after stroke is the induction of apurinic/apyrimidinic (AP) sites and strand breaks. To mitigate cell loss after oxidative DNA damage, ischemic cells rapidly engage the base excision-repair proteins, such as the AP site-repairing enzyme AP endonuclease-1 (APE1), also named redox effector factor-1 (Ref-1). Although forced overexpression of APE1 is known to protect against oxidative stress-induced neurodegeneration……
作者简介：
1962年生，1982年获上海医科大学临床医学学士学位，1990年获北京神经外科研究所博士学位， 在美国加洲大学（UCSF）神经外科系进行博士后研究工作，年先后任美国匹兹堡大学医学院神经病学系助理教授,任美国匹兹堡大学医学院神经病学系副教授（with Tenure），2005年晋升为正教授（Tenured），2003年起任复旦大学“脑损伤研究海外创新团队”首席教授，2009年中国教育部长江学者奖励计划讲座教授、&研究方向：长期研究脑缺血、脑外伤和帕金森病的细胞死亡分子生物学机制。目前主要从事脑卒中和脑外伤后脑功能重塑的医学转化研究，尤其是大动物和临床脑卒中的超早期干预治疗。已在《Annals of Neurology》、《PNAS》、《J Neurosci》、《Stroke》等杂志上发表论文130余篇，主编专著3部，综述30余篇。论文发表总引用数8000余次，H指数为49。应邀在国际专业大会和知名高校作专题报告百余次，并担任“Brain2013”国际大会主席。先后承担美国NIH、VA、DoD以及中国自然科学基金40余项。现担任J Neurosci、CNS Neurosic & Therapeutics、Translational Stroke Research杂志副主编；JCBFM、Neurobio Dis、 Stroke、Prog Neurobio杂志的常务编委；Prog Neurobio和CNS & Neurological Disorders-Drug Targets杂志特约主编；国际脑血流与代谢协会财务总监；美国AHA研究基金评审委员会主席。此外，担任美国NIH、美国陆军和荣誉军人医学研究基金会、中国自然科学基金、科技部、教育部等多个基金会专业评审专家。
&(/)版权所有，未经书面许可，不得转载
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