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麻杏石甘粉防治人工感染鸡传染性支气管炎的试验研究
分类号： 密级：Ｓ璺墨墨：Ｚ垒单位代码： 学号：ｉＱＱ墨鱼 ２ＱＱ鱼垒鱼垒公珏麻杏石甘粉防治人工感染鸡传染性 支气管炎的试验研究Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｍａｘｉｎｇ Ｓｈｉｇａｎ ＰｏｗｄｅｒｏｎＡｖｉａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｉｎ Ｃｈｉｃｋｅｎｓ学位申请人：刘鹏飞 指导教师：钟秀会教授学科专业：临床兽医学学位类别：农学硕士 授予单位：河北农业大学 答辩日期：二Ｏ一一年五月十四日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇堡盔些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：到娥鸟似签字日期：如ｃｒｌ年ｆ月砂扫学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑兰堡盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑兰堡盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：毒，低呜托签字日期：≯ｌ ｆ年／月２日导师签名：斜刍念石月ａ日学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编：㈣删㈣ｆＪＪＩ『㈣朋摘要Ｙ１８９歹岑ｄ：ｊ｜｜『’本试验主要研究麻杏石甘粉对人工感染传染性支气管炎病毒（ＩＢｖ）雏鸡的 保护作用，并初步探讨其可能的作用机制，为研究和开发中药防治动物疾病提供 新的思路和方法。 方法：ＩＢＶ－Ｍ４１标准毒株经ＳＰＦ鸡胚复壮传代５次后测定其半数感染量， 以１００ＥＩＤｓｏ为参照值，通过滴鼻、点眼的方法对１５日龄雏鸡进行人工感染试验。 接毒２４ｈ后，观察鸡的临床表现并进行实验室诊断。然后将２４０只１５日龄雏鸡 随机分为８组：正常组、模型组、麻杏石甘粉高、中、低剂量组及麻杏石甘散高、 中、低剂量组。除健康组外其余７组接种ＩＢＶ尿囊液。两种药物治疗组于攻毒 ４８ｈ后分别以０．５％、１％、１．５％的麻杏石甘粉和０．１２％、０．２４％、０．３６％的麻杏石 甘散药物浓度进行干预，连续给药３ｄ，于雏鸡１８、２１、２４、２７、３０日龄时，每 组随机取６只鸡，无菌心脏采血，分离血清。ＥＬＩＳＡ方法测定血清中ＩＢＶ抗体 滴度，然后将雏鸡处死，取肺、支气管等组织做病理切片，免疫组织化学方法测 支气管单位面积ｌｅａ分泌细胞的变化；计算脾脏、法氏囊的器官指数。为评价麻 杏石甘粉的毒性，以半数致死量（ＬＤ５０）作为评价急性毒性强度的指标将４０只 小白鼠随机分为４组，每组１０只，并且保证雌雄各半，给药途径为口服，试验 期为７ｄ，观察动物临床表现和死亡情况。 结果：（１）给每只供试雏鸡滴鼻０．２ｍＬｌ００ ＥＩＤ５０供试毒液，同时对雏鸡进行 冷刺激（频繁室内洒水，关闭鸡舍内的取暖设施），从攻毒后的鸡只临床症状、 死亡鸡只的剖检病变症状说明，本试验成功建立了鸡传染性支气管炎模型；（２） 麻杏石甘可溶性粉治疗ＩＢ总有效率达９０％．９３．３％，治愈率为８６．７％．９０％，证实雏 鸡群应用麻杏石甘粉治疗此病效果显著高于麻杏石甘散，饮服本药的最适治疗浓 度为０．１％一０．１５％；（３）与模型组相比，麻杏石甘粉组通过促进机体细胞活化，导 致组织迅速再生，改善ＩＢＶ模型肺与支气管组织的病理学变化并且效果优于麻杏 石甘散组；（４）抗体测定结果显示给ＩＢＶ感染雏鸡药物干预后，血清ＩＢＶ抗体的 滴度升高明显，麻杏石甘粉高、中剂量组均为抗体阳性表现，显著高于麻杏石甘 散组； （５）攻毒后３ｄ，在ＩＢＶ的刺激下，各组ＩｇＡ分泌细胞的数量较正常组都有不同程度的增多，但到攻毒后９ｄ，模型组及麻杏石甘散组ＩｇＡ分泌细胞的增加幅 度已不是很明显，而麻杏石甘粉组仍然保持着较好的上升趋势，尤其在机体的康 复期仍能高水平的分泌抗体，提高了雏鸡抵御强毒攻击的能力； （６）急性毒性试验结果表明，ＬＤｓｏ＞６００００ｍｇ／ｋｇ，说明麻杏石甘可溶性粉无毒，可安全服用。 结论：麻杏石甘粉对ＩＢＶ感染的雏鸡具有良好的保护作用，对ＩＢＶ模型的 气管及肺组织的病理损伤有修复作用，并能调节机体免疫功能，促进雏鸡产生抗 ＩＢＶ抗体，提高机体的细胞免疫和体液免疫，从而杀灭侵入机体的病原微生物并 提高雏鸡抗病能力，达到抗病毒的作用；并且有效增强鸡体的黏膜免疫功能，提 高了雏鸡抵御强毒攻击的能力。以上效果均显著高于传统的散剂剂型并且无毒副 作用，能有效治疗雏鸡的传染性支气管炎。关键词：麻杏石甘粉；新剂型；雏鸡；传染性支气管炎；ＩｇＡ分泌细胞
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｍａｘｉｎｇ Ｓｈｉｇａｎ ＰｏｗｄｅｒＣｈｉｃｋｅｎｓｏｎ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｉｎＡｕｔｈｏｒ：Ｌｉｕ，ＰｅｎｇｆｅｉＭａｊｏｒ：ＣｌｉｎｉｃａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖｉｓｏｒ：Ｚｈｏｎｇ，Ｘｉｕｈｕｉ，ＰｈＤ，ＰｒｏｆｅｓｓｏｒＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＭａｘｉｎｇＳｈｉｇａｎ ｐｏｗｄｅｒ ｏｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＢｒｏｎｃｈｉｔｉｓＶｉｒｕｓ（ＩＢＶ）ｔｈｒｏｕｇｈ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ，ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｄｉｓｃｕｓｓ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｔ１１ｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔＩｌｄｙ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅｔｏａｎｏｖｅｌ ｔｈｏｕｇｈｔ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒｐｒｅｖｅｎｔａｎｄｔｒｅａｔ Ａｎｉｍａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅａｔ ５ｔｈｅ ＥＩＤ５０ ｏｆ ＩＢＶ二Ｍ４ｌ ｓｔｒａｉｎ ａｆｔｅｒｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎｏｎｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅｎ １ ５－ｄａｙ－ｏｌｄ ｃｈｉｃｋｓ ｗｅｒｅｔｏ １ ００ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ｈｕｎｄｒｅｄｗｉｔｈ ＩＢＶ二Ｍ４ ｌｒｅｆｅｒＥＩＤ５０，ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｙｍｐｔｏｍ ｗｅｒｅａｔｃｈｉｃｋｓ ｗｅｒｅｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｂｙｅｍｐｉｒｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ２４ｈ ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｗｏａｎｄ ｆｏｒｔｙ １ ５－ｄａｙ－ｏｌｄ ｃｈｉｃｋｓｇｒｏｕｐ，ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏｅｉｇｈｔ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ３０ ｅａｃｈ：ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌ１０Ｗ，ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄｃｏａｌ怎ｅｈｉｇｈｄｏｓｅ ｏｆ Ｍａｘｉｎｇｓｈｉｇａｎ 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ＩＢＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｏｎｐａｔｈｏｌｏｇｙｉｎｊｕｒｙｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＩＢＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｓｅＴＢｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＩＢＶ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ ｗｏｕｌｄ ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ ｋｉｌｌ ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄｓｐｅｅｄｕｐ ｔｈｅｃｈｉｃｋ’Ｓ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｍＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ｉｔ ａｌｓｏ ｈａｄ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｃｏｓａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ’ｓａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔｉｎｇｔｈｅ ｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓ ａｂｏｖｅｄｃｏａｒｓｅｏｆＭａｘｉｎｇｓｈｉｇａｎ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｐｏｗｄｅｒ，ｍｏｒｅｏｖｅｒ ｉｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｏｘｉｃ ａｎｄ ｓｉｄｅ－ｅｆｆｅｃｔ，ｔｈｅｒｅｂｙ ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｗｉｔｈ ＩＢＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍａｘｉｎｇｓｈｉｇａｎ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒ；，ｎｅｗ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｓ；ｃｈｉｃｋｅｎ；Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ；Ｉｇａ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ缩写词表缩写词ＩＢ英文全称Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｅｍｂｒｙｏ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｏｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ?Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎＴ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ中文全称 鸡传染性支气管炎 传染性支气管炎病毒 鸡胚、｝数感染量酶联免疫吸附试验．ＩＢＶＥＩＤｓｏ ＥＬＩＳＡ ＰＣＲＴｈ聚合酶链式反应 辅助型Ｔ淋巴细胞 巨噬细胞 细胞介导免疫 分化群 分泌型免疫球蛋白Ａ 过氧化氢 琼脂扩散试验 免疫荧光法 核糖核酸． 无特定病原体 苏木素一伊红染色法Ｍ①Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＣＭＩＣＤ ＳＩｇＡ Ｈ２０２ ＡＧＰ ＩＦＡ ＲＮＡ ＳＰＦ ＨＥＳｅｃｒｅｔｅｄｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａｈｙｄｒｏｇｅｎ ｄｉｏｘｉｄｅａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｉｍｍｕｍｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎｅ
目录ｌ弓Ｉ言……………………………………………………………………………………………………………………………．１ １．１鸡传染性支气管炎概述…………………………………………………………………１１．２ＩＢ的病原分子生物学研究………………………………………………………………３１．３传染性支气管炎免疫机制………………………………………………………………．３ １．４家禽黏膜免疫研究进展…………………………………………………………………５ １．４．１家禽黏膜免疫系统的组成………………………………………………………．５ １．４．２黏膜免疫系统的功能………………………………………………………………６ １．４．３家禽黏膜免疫系统的特点………………………………………………………．６ １．５家禽黏膜免疫主要效应因子ＳＩｇＡ………………………………………………………．６１．５．１ １．５．２ＳＩｇＡ的结构………………………………………………………………………６ ＳＩｇＡ在黏膜免疫应答中的作用…………………………………………………７１．６中药防治病毒性疾病的研究进展………………………………………………………７ １．６．１中兽医在防治病毒性疾病的理论基础…………………………………………．．８ １．６．２中药对鸡传染性支气管炎的防治现状…………………………………………．８ １．７中兽药剂型的改革与创新………………………………………………………………９ １．８本项目研究的目的意义…………………………………………………………………９ ２材料与方法……………………………………………………………………………………．１０ ２．１试验材料………………………………………………………………………………。ｌＯ ２．１．１药物………………………………………………………………………………………………………．１０ ２．１．２病毒………………………………………………………………………………………………………．．１０ ２．１．３雏鸡和ＳＰＦ种蛋…………………………………………………………………１０ ２．１．４主要仪器设备…………………………………………………………………一ｌＯ ２．１．５主要试剂………………………………………………………………………。ｌＯ ２．２试验方法………………………………………………………………………………。１ｌ２．２．１ＩＢＶ种毒复壮与半数鸡胚感染量（ＥＩＤ５０）的测定…………………………．１ｌ２．２．２人工感染鸡传染性支气管炎病毒模型的建立………………………………。１２ ２．２．３麻杏石甘粉对人工感染ＩＢＶ雏鸡的疗效试验………………………………。１２ ２．２．４样品的采集与处理……………………………………………………………．．１３ ２．２．５病理组织学检查…………………………………………………………………１３ ２．２．６免疫器官指数的测定……………………………………………………………１３２．２．７ ２．２．８ＥＬＩＳＡ测定血清中抗体的相对水平……………………………………………．１３ ＳＰ染色法检测ＩｇＡ分泌细胞……………………………………………………１４２．２．９急性毒性试验……………………………………………………………………１４ ２．３统计学处理……………………………………………………………………………．１４ ３结果…………………………………………………………………………………………………………………………。１５３．１ｍＶ的ＥＩＤ５０的测定……………………………………………………………………１５３．２人工诱发雏鸡支气管炎试验结果……………………………………………………．．１５ ３．３疗效试验结果…………………………………………………………………………．．１５ ３．４组织病理学观察结果…………………………………………………………………．．１７ ３．５免疫器官指数的动态变化……………………………………………………………．１８ ３．５．１对脾指数的影响………………………………………………………………．．１８ ３．５．２对法氏囊指数的影响…………………………………………………………。１８３．６ ３．７ＩＢＶ抗体测定结果………………………………………………………………………１９ ＩｇＡ分泌细胞的分布特点及数量变化…………………．．．……………………………２０３．８急性毒性试验结果………………………………………………………………………２３ ４讨论…………………………………………………………………………………………………………………………．．：｝４４．１ＩＢＶ人工感染模型的建立……………………………………………………………。２４４．２中药方剂分析…………………………………………………………………………．２４ ４．３麻杏石甘粉对人工感染ＩＢＶ雏鸡的疗效试验………………………………………．２５ ４．４对ＩＢＶ雏鸡组织结构病理损伤的影响………………………………………………２６ ４．５麻杏石甘粉对雏鸡免疫器官指数的影响……………………………………………。２７ ４．６对体液免疫的作用………………………………………………………………………２７ ４．７麻杏石甘粉对ＩＢＶ雏鸡黏膜免疫功能的影响………………………………………。２７ ５结论…………………………………………………………………………………………………………………………一２９ 参考文献…………………………………………………………………………………………３０聪秉～…～～～～～～～…～～～～………～～．．．～～～……～～～………～…～．．．一～～～～～～……～…～…ｊｓｔ?在读期间发表学术论文…………………………………………………………………………４０ 作者简介…………………………………………………………………………………………．．４ｌ ｊｌ｜【谢…………………………………………………………………………………………………………………………．．ｚｌ：！支气管炎的试验研究深入，中药在防治畜禽病毒性疾病中必将发挥更大的作用。１．１鸡传染性支气管炎概述鸡传染性支气管炎（ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＢｒｏｎｃｈｉｔｉｓｍ）是由冠状病毒科（Ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｉｄａｅ）冠状病毒属Ｖｉｒｕｓ（Ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ）的传染性支气管炎病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓｍｖ）弓ｌ起的一种急性高度接触性传染病【ｌ捌，是集约化养鸡场的重要疫病之一。ＩＢＶ对环境的抵抗力强，能持久的存在于周围 的环境中，一旦感染，很难根除。其特征是病鸡咳嗽、喷嚏和气管发生哆音。在雏鸡还可以出 现流涕，产蛋鸡产蛋减少和质量变劣。该病具有高度的传染性，因病原具有多血清型，而使免 疫接种复杂化。感染鸡生长受阻，耗料增加、产蛋和蛋质下降、死淘率增加，给养鸡业造成巨 大经济损失。 １９３０年在美国北达科他州首先发现传染性支气管炎。１９３１年Ｓｃｈａｌｋ和Ｈａｗｎ首次报道了 美国北达科他州发现一种引起小鸡死亡的呼吸道疾病【３１。１９３６年Ｂｅａｃｈ和Ｓｃｈａｌｍ证明了其病 原微传染性支气管炎病毒，之后，世界各地陆续都有该病的报道【４Ｊ，并分离到许多不同血清型的 毒株垆Ｊ。１９３７年Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ和Ｈｕｄｓｏｎ首次在发育鸡胚中培养ＩＢＶ；１９５６年ＪＩｌＩｌｇｌｌｅｒｒ与其同事 报告了１９５１年分离的康狄格（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）株和１９４１年分离的马萨诸塞（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｍａｓｓ）株，可引起类似的疾病，但不能交叉保护或交叉中和，从而证明ＩＢＶ不只是一个血清型６１。在美国，除了最早鉴定出的ＩＢＶ Ｍａｓｓ型外，从２０世纪５０年代开始，又陆续鉴定出其他几个ＩＢＶ血清 型【６＇刀，目前，非洲【８１、澳大利亚［９１和欧洲【１０，１１１都已分离到许多血清型明显不同于北美分离株的 ＩＢＶ毒株；我国１９７２年由邝荣禄首次报道在广东发现该病。１９８８年分离出肾型ＩＢＶ，目前肾 型传支在我国２０多个省市流行，腺胃型已在ｌＯ多个省市流行【１２】。 鸡是传染性支气管炎病毒的唯一自然宿主，不同品系和不同日龄的鸡敏感性不同。ＩＢＶ主 要侵害雏鸡的呼吸道、消化道、生殖系统及肾，各种日龄的鸡均可感染，其中以１．４周龄的雏 鸡发病最为严重，并能引起死亡。ＩＢＶ往往引起复合感染（如新城疫、慢性呼吸道病等），并可 继发细菌性疾病如大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重了鸡群的危害。随着日龄的增长，鸡河北农业大学硕士学位（毕业）论文 只对致。肾炎、输卵管病变和死亡的抵抗力增加。ＩＢＶ自然感染通常在４８ｈ内出现症状。人工接 种后，从第２４ｈ到第７天始终可以从鸡气管、肾、法氏囊中分离出病毒。雏鸡感染后症状严重， 死亡率主要取决于病毒株的毒力及鸡群抵抗力，呼吸型的传支多发于幼雏，发病率高，死亡率 ２５％左右；日龄稍大或成年鸡死亡率较低。以肾脏病变为主的肾型传支多见于鸡的育雏阶段， 死亡率可达１０－４０％：腺胃肠道型的传支多发于３０．９０日龄，病程相当长，发病率高，死亡率较 低［１３，１４１。炎热、寒冷、拥挤、通风不良及维生素、矿物质、微量元素的缺乏都可促使本病的发 生。ＩＢＶ主要是通过呼吸道传播的，传播速度快，距离远，往往整栋鸡舍同时发病。此外，ＩＢＶ 还可通过泄殖腔传播。ＩＢＶ感染的持续性很难确定，有报道证明人员和设备污染也是鸡群间歇 传播的潜在威胁【”】。本病主要通过呼吸道传播，经空气飞沫传给易感鸡只【１６１。此外ＩＢＶ也可通 过被污染的饲料、饮水、用具等经消化道使易感鸡感染发病【１７．１８】。病鸡康复后仍能排毒长达１４０ 天之久。本病一年四季均可发生，在寒冷，高热季节发病率更高。 呼吸型的传支多发于３５日龄以内的雏鸡，除衰弱，精神不振等一般症状外，鸡雏往往突然 出现呼吸道症状，并很快波及全群，病鸡的主要临床症状为畏寒、喘息、咳嗽、打喷嚏、气管 罗音和流鼻涕，病鸡多因呼吸困难窒息而死或继发感染而死亡【ｌ ９１。日龄稍大的（４２日龄以上）患 病鸡呼吸道症状较轻，表现气管哕音、气喘和微咳，并以夜间较为明显；产蛋鸡呼吸道症状温 和，主要表现为产蛋下降，产软壳蛋、畸形蛋和粗壳蛋，蛋白稀薄如水，蛋黄与蛋白分离。病 死雏鸡剖解可见呼吸道有浆液性、粘液性和干酪样分泌物，气囊混浊，含有黄色千酪样分泌物， 肺淤血，见小叶性肺炎。组织学检查可见气管纤毛脱落，上皮细胞圆缩脱落。产蛋母鸡腹腔内 可见液状的卵黄样物质及卵黄性腹膜炎，卵巢正常或充血、出血、变形；输卵管萎缩。部分萎 缩产蛋鸡外观无症状但不产蛋，剖杀后可见卵巢发育较正常，但输卵管壁薄，又细又短，有的 鸡输卵管积水［２０，２１１。肾型传染性支气管炎在目前发生较多，流行较广，１５．３０日龄的雏鸡是本 病的高发阶段。同一鸡场可在多批次雏鸡中连续发生，且在一定的时间内发病日龄相对稳定。 成年鸡群很少发生。肾型传支病死鸡的呼吸道大多没有明显的病理变化，主要病变在肾脏：肾 肿大、苍白、肾小管和输尿管充满白色尿酸盐结品，外观花斑样［２２，２３，２４】。输卵管扩张，并和直 肠、泄殖腔一样有多量尿酸盐沉积。 ＩＢＶ血清型的多样性与不断变异［２５，２６，２７１，以及免疫应答机理的复杂性、传染性【２８，２９，３０１，给 ｍ的免疫检测和免疫预防带来了很大困难。支气管炎的临床症状和病理变化复杂多样，还有混 合感染、继发感染等因素【３¨，因此，只靠流行病学、临床症状、病理剖检等来诊断本病只能做 到初步诊断。最终确诊还要靠实验室诊断。自２０世纪六十年代以来，随着生化技术、生物技术 的发展，ｍ的检测手段也取得了很大的进步。目前，国内外建立了一系列ＩＢ诊断方法。病毒 分离鉴定【３２】，此方法是最经典、最可靠的实验方法，但此方法繁琐、耗时、昂贵，不适宜日常 检测工作。病毒中和试验【３３】具有高的灵敏度及特异性，但此实验耗时，影响常规检测工作的开 展。血凝抑制试验和免疫扩散试验【３４．３５】，尽管此方法不能区分临床发病引发的抗体，还是疫苗 免疫所导致的抗体升高，但仍是目前养禽场用于监测抗体水平常用的检测方法。此两种方法灵 敏性和特异性不好，需寻找一个更灵敏、更特异，简便快速的方法替代它。ＥＬＩＳＡ［３６，３７，３８，３９］可具 备灵活性、特异性、快速的特点，既可以进行群特异性抗体的检测，也可用于型特异性抗体的 检测，利用鸡胚接种途径培养病毒，或是鸡胚成纤维细胞途径培养病毒ｍ】，作为包被抗原。随 着分子生物学技术的快速发展，制备基因工程抗原，鸡传染性支气管炎病毒部分基因在昆虫细２麻杏石甘粉防治人工感染鸡传染性支气管炎的试验研究 胞中表达己获成功‘４¨，可作为ＥＬＩＳＡ包被抗原之用，特异性、灵敏度更好。免疫荧光抗体试验 ［４２，４３］、免疫酶组化技术（４４，４５１灵敏度低，非特异性反应严重。另外，利用ＰＣＲ及生物索标记的 ＤＮＡ探针‘４６?４７，４８１检测传染性支气管炎病毒，可及一早发现疾病，但费用高，技术操作繁琐，要 求高。不能适用于日常诊断之需，不能用于评估鸡体免疫水平及生产场疫苗的兔疫效果评价。１．２ＩＢ的病原分子生物学研究ＩＢＶ是冠状病毒科冠状病毒属的一个成员，病毒形态多样，但通常为圆形，有囊膜，直径８０～１２０ｒｉｍＥ４９】。囊膜外有类似球棒样的纤突，呈放射状排列，纤突末端呈球形，长约２０ｎｍ。ＩＢＶ 基因组为不分段的单股正链ＲＮＡ，基因组全序列长约２７ｋｂ，被分为６个区域，至少含有ｌＯ个 明显的开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ，ＯＲＦ）。ＩＢＶ的感染细胞内，可检出６种ｍＲＮＡ，分别命名为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ。这６种ｍＲＮＡ具有共同的３’端，在５’端的帽子结构后面均紧 接先导序列，长约６０～７０ｂｐ，在ＩＢＶ独特的先导．转录模式中起重要作用，即充当引物。其中Ａ、 Ｃ、Ｅ分别编码ｍＶ的３个主要结构蛋白，其余的ｍＲＮＡ编码一些功能尚不十分清楚的小分子蛋白。ＩＢＶ的主要结构蛋白为纤突糖蛋白（Ｓ）、膜糖蛋白（Ｍ）和核蛋白（Ｎ），三种结构蛋白 的分子摩尔比为ｌ：６：１５【５０】。Ｓ蛋白进化相对活跃，在病毒的血清分类中起决定作用，也是决 定ＩＢＶ抗原性的主要蛋白。Ｓ蛋白Ｎ．末端在跨越内基质网内膜时被切除ｌＯ个疏水氨基酸构成 的信号肽，并被裂解为９０ｋＤ和８４ｋＤ的两个个亚单位Ｓ１和Ｓ２。Ｓｌ亚单位由５２０～５３８个氨基 酸组成，Ｓ２亚单位由６２５个氨基酸组成。 Ｍ蛋白约占病毒结构总蛋白量的４０％，由２２４．２２５个氨基酸构成，近Ｎ末端有两个糖基化 位点。Ｍ蛋白分子量未糖基化为２３ＫＤ，随着糖基化程序不同为２６ＫＤ、２８ＫＤ、３０ＫＤ和３４ＫＤ 不等。低聚糖是通过Ｎ．糖苷键与Ｍ蛋白相连。氨基酸序列的二级结构分析推测Ｍ蛋白的二级 结构为：约１０％的氨基酸暴露于病毒囊膜外面并被糖基化，可能形成抗原决定簇。紧接着大约 ８０％氨基酸形成了３个疏水的ａ．螺旋片段嵌入双层脂膜。其余近Ｃ端氨基酸位于脂膜的内侧。 Ｍ蛋白的作用与病毒的复制有关，Ｍ蛋白在粗面内质网内的聚集是其本身性质决定的。Ｍ蛋白 的免疫原性比较弱【５０】。 核衣壳（Ｎ）蛋白是一种磷酸化蛋白，分子量约５０ｋＤ，约含有４０９个氨基酸，与病毒ＲＮＡ 结合，为核衣壳提供结构基础。Ｎ蛋白占病毒总蛋白量７０％，氨基酸中约１７％为碱性氨基酸， 在ｐＨ值为中性时带正电，８０％碱性氨基酸在位置上是保守的，通常簇集在６０．８８、１８１．２３４、 ３３４．３７３个区域。这一基本特征反映了核酸结合蛋白的特点，以便于包裹核酸，使之易于装配 入病毒内部，在进化上保守，与病毒的复制有关。１．３传染性支气管炎免疫机制传染性支气管炎只对鸡有致病力，分为呼吸型、肾型、肠型和腺胃型掣５１】；感染传染性支气管炎后，机体可以产生同源性和异源性保护，但是由于该病病毒的血清多型性、毒株毒力的３河北农业大学硕士学位（毕业）论文 不同及可能需防护的传染性支气管炎病毒的不同表现等因素，使得传染性支气管炎的免疫机制 和持续时间的研究变得复杂化瞰】。 １．３．１体液免疫 体液免疫在鸡抗ＩＢＶ感染中发挥重要的作用。机体感染ＩＢＶ后可以产生循环抗体，但是它不 能代表其免疫力，鸡仍可表现为无抵抗力。实验表明，鸡用环磷酞胺后再免疫接种，虽然查不到 抗体，但是确实可以抵抗病毒攻击。ＩＢＶ活病毒感染或灭活ＩＢＶ免疫都可诱导试验鸡体内产生 中和抗体、血凝抑制抗体和ＥＬＩＳＡ抗体。ＩｇＧ是体液抗体中含量最多的免疫球蛋白，在抗全身性 病原感染中起主要作用。在接种ＩＢＶ ７天后，气管棉抵子中开始出现ｍＶ，睁异的ＩｇＧ和ＩｇＡ。这表 明从感染开始就有两类抗体分泌并参与作用【５３】。不论是肾型ＩＢＶ还是呼吸型ＩＢＶ，在初次感染时 首先侵害呼吸道．引起呼吸道症状，产生局部体液免疫反应。而且，随着病程的不断加剧、病毒 组织嗜性的差异．最终产生典型的临床病理变化。 １３．２局部免疫 呼吸道的局部免疫对抗感染有重要作用，鼻腔分泌液中的局部中和抗体能够阻止再次感染， 并且有证据表明哈德氏腺在局部应答反应中起作用。通过滴鼻、点眼可以获得较好的免疫效果。 １．３３细胞免疫．细胞介导免疫在抗冠状病毒感染中起着重要作用。应用淋巴细胞转化试验、细胞毒性淋巴细胞活性升高试验和迟发型变态反应试验均证明ＩＢＶ感染确实能够诱发特异性细胞免型¨Ｊ。经过对Ｔ细胞亚类功能的分析表明，ＣＤＩ＋和ＣＤ８＋两种亚类Ｔ细胞在ｍ的细胞免疫中起着重 要作用。应用免疫组织化学和抗Ｎ蛋白特异的单克隆抗体检测，发现Ｔ细胞介导针对ＩＢＶ的 局部免疫反应，ＩＢＶ在Ｔ细胞介导下产生溶细胞作用。在病毒存在的肾脏和气管组织部位即为 Ｔ淋巴细胞和非淋巴细胞浸润的部位，ＣＤＩ＋Ｔ细胞可识别抗原，之后递呈到巨噬细胞表面而被 激活。激活的ＣＤＩ＋Ｔ细胞有多种功能：它决定着与Ｔ、Ｂ细胞结合的辅助因子的分泌，在某些 情况下可能具有细胞毒作用；它与Ｂ细胞结合，激活Ｂ细胞而最终导致体液免疫，与细胞性Ｔ 细胞前体结合产生细胞毒反应。在ＩＢＶ感染期间，ＣＤ８＋Ｔ细胞增多表明，依赖抑制性Ｔ细胞 对两种免疫应答进行负调节，细胞毒性Ｔ细胞应答在两种免疫应答中均显现出来，两种免疫应 答都是抗感染和抗病毒的。当ＩＢＶ进入易感的气管和肾小管上皮细胞后，在Ｔ细胞介导下引起 局部免疫应答【５５１。Ｃｏｌｌｉｓｓｏｎ ＥＷ等【５６】对ＩＢＶ接毒后细胞免疫和体液免疫的变化规律进行了较为 详细的研究，表明ＩＢＶ感染（或免疫）后细胞免疫和体液免疫都在发挥作用，只不过是两种免疫 反应发挥作用的时间不同。进一步的研究证实在ｍＶ核蛋白碳末端１２０个氨基酸的多肽可诱导 细胞毒性Ｔ淋巴细胞反应和对急性感染的雏鸡具有保护作用。用ＩＢＶ弱毒和灭活苗对淋巴细胞 的转化试验、细胞毒性淋巴细胞活性升高和迟发型过敏反应有一定作用。但是这些反应在免疫 中的作用还不清楚。干扰素的产生因毒株不同而异，但是同样未知它在其抗感染中起的作用。 一般认为ＩＢ是呼吸道易感的疾病，地塞米松、环磷酰胺、环孢菌素等细胞免疫抑制剂的应用从 另一个侧面阐明了细胞免疫反应在抗ｍＶ感染中的重要作用。将１日龄雏鸡用嗜肠型ＩＢＶ Ｃ株 感染，并跟踪检测到３５天后未发现排毒，但发现某些鸡群在性成熟产蛋时再次排毒，如早期注 射激素则不会再排毒，而在接种环孢菌素（ＣＳＰ）后将产生再次排毒现象，这说明Ｔ细胞在抑制 ＩＢＶ感染方面起着关键性的作用。实验证明Ｍ，Ｔ细胞参与的主要作用在于限制ＩＢＶ感染所引 起的损伤和致死方面比清除病毒更重要，鸡群发病是在Ｔ细胞受到抑制的情况下发生的。４麻杏石甘粉防治人工感染鸡传染性支气管炎的试验研究 １．３．４被动免疫 同其他抗原感染时一样，母源抗体也能为雏鸡提供一定的保护力。研究发现具有较高母源 抗体水平的１日龄雏鸡可得到较好的保护，保护率高于９５％；随着日龄的增大，保护率逐渐降低， 到７日龄时则低于３０％。这种保护与气管局部的抗体水平有关而与血清抗体水平无关【５８】。母源抗 体可以保护１日龄和１周龄内遭遇攻毒的鸡，但是不能够对２周后的鸡产生保护作用。如果母鸡和 雏鸡用的疫苗相同，母源抗体可以降低疫苗反应的激烈程度，又可降低其效能。 １．３．５免疫抑制 传染性支气管炎病毒和新城疫活苗经常联合使用。如果ＩＢＶ的量大，会干扰新城疫病毒的 应答１５９１，然而无干扰ＩＢＶ的报道。１．４家禽黏膜免疫研究进展动物机体与内外环境相接触的界面在外侧是皮肤，内侧是黏膜。黏膜是免疫的主要屏障． 黏膜由鼻腔、口腔、呼吸道、消化道、泌尿生殖道等表层构成，其表面积巨大，是大多数病原 微生物入侵机体的途径，因此，黏膜的屏障作用对防止外来微生物的入侵、抗原的进入起着第 一道防线作用。这种机体与外界相通的腔道黏膜表面存在的免疫称为黏膜免疫（ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ）。研究表明，黏膜免疫有与全身免疫完全不同的独特性质，对于外来抗原既可诱发免 疫应答，又可诱发免疫耐受，其中最主要的是在黏膜表面诱导产生分泌型ＩｇＡ（ｓｅｃｒｅｔａｒｙｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＡ，ＳｌｇＡ）。黏膜免疫在机体免疫中扮演了重要的角色，其组织结构基础是由鼻粘膜相关淋巴组织（ＮＡＬＴ）、支气管相关淋巴组织（ＢＡＬＴ）、肠相关淋巴组织（ＧＡＬｌ’）、泌尿 生殖道粘膜下淋巴组织，以及某些外分泌腺（如唾液腺、乳腺等）黏膜相关淋巴组织（ＭＡＬＴ） 共同构成的一个体系。该系统在体内的覆盖面积超过４００ｍ２１６０１。ＭＡＬＴ中Ｂ淋巴细胞的数量比 Ｔ淋巴细胞多，而且多是能产生分泌型ＳＩｇＡ的Ｂ细胞。 １．４．１家禽黏膜免疫系统的组成 黏膜免疫系统存在于有机体与外界直接或间接相通腔道的整个粘膜表面【６ｌｌ。家禽黏膜免疫 系统是由集合黏膜相关淋巴组织和弥散黏膜相关淋巴组织组成，集合黏膜相关淋巴组织是捕捉 抗原和产生免疫效应细胞与免疫记忆细胞的主要场所。免疫效应细胞和免疫记忆细胞游走并定 居到较远的黏膜组织和腺体，构成弥散黏膜相关淋巴组织的一部分【６２１。 集合黏膜相关淋巴组织存在于呼吸道、消化道、泌尿生殖道等黏膜组织中，包括了胃肠道 的集合淋巴结、阑尾及小的孤立淋巴结为代表的肠相关淋巴组织（ｇｕｔ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ，ＧＡＬＴ）：位于上呼吸道的支气管相关淋巴组织（ｂｒｏｎｃｈｕｓ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄｔｉｓｓｕｅ．ａＡＬＴ）；泌尿生殖道勃膜相关淋巴组织。淋巴组织的数量和位置存在着种间和个体间的差异，但大部分 以结肠和直肠数量最多，并有部分形成集结，例如派伊尔氏小结（ｐｅｙｅｒ ｐａｔｃｈｅｓ，ＰＰ）、盲肠扁桃体 及１２１腔和鼻腔中的腺体等。ＰＰ是黏膜免疫系统最重要的淋巴器官【６３１，几乎普遍存在于鸡的回肠 后段。盲肠扁桃体为禽类消化道最大局部免疫组织，位于回一盲一直肠连接部的盲肠基部黏膜 固有层和黏膜下层中。 弥散黏膜淋巴组织分布于整个黏膜组织，包括分散在固有膜，黏膜上皮和腺体（唾液、泪腺、５河北农业大学硕士学位（毕业）论文 哈德尔腺、盲肠扁桃体等）问质中的淋巴细胞，浆细胞以及上皮内淋巴细胞（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＩＥＬ），ＩＥＬ是一类独特的淋巴细胞群，在细胞介导的黏膜免疫和维持上皮的完整性 上起着重要作用。固有膜内的淋巴细胞（１ａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＬＰＬ）主要是Ｂ细胞和Ｔ细胞， 其中４０％的淋巴细胞产生ＩｇＡ抗体【６４１。 １．４．２黏膜免疫系统的功能 家禽黏膜免疫系统是机体免疫系统不可分割的重要组成部分，也是免疫系统的第一道防线。 由于动物体内黏膜表面积旁大，易受抗原的侵袭，已有研究证实，机体９５％以上的感染发生在 黏膜或由黏膜入侵机体。黏膜免疫系统受抗原刺激时，可产生大量抗体ＳＩｇＡ起到免疫防御作 用。同时部分淋巴细胞进入淋巴结和周围淋巴组织中，可引起机体的进一步免疫应答。另一方 面，黏膜免疫系统可对经肠道进入机体的抗原表现特异的耐受性，这种耐受性的生理意义不仅 在于可阻止机体对肠腔内共栖的正常菌群产生免疫应答，而且可避免宿主对食物蛋白和其它抗 原产生迟发性超敏反应，有利于机体的自稳和平衡。因而黏膜免疫是机体一种重要的保护机制【６５】。１．４．３家禽黏膜免疫系统的特点 （一）有别于系统免疫的独特的结构特点：家禽黏膜免疫系统的大量免疫细胞和免疫分子 弥散在黏膜上皮内及黏膜下，或由单个或多个淋巴滤泡聚集成滤泡结节，如ＰＰ结、盲肠扁桃 体及大Ｗ Ｊ＇Ｉ－分泌腺构成黏膜相关淋巴组织（ＭＡＬＴ）。已知黏膜部位的免疫细胞和免疫分子数量均 超过系统免疫，使黏膜免疫系统成为机体最大的免疫器官［６６１。 （二）有特异的免疫反应机制：淋巴细胞归巢，即抗原通过粘膜中Ｍ细胞激活固有层中Ｂ 淋巴细胞，致敏的Ｉｇａ Ｂ细胞前体通过淋巴或血液再迁移到粘膜组织和腺体，从而产生广泛的 局部分泌Ｉｇａ抗体反应【∥７１。淋巴细胞归巢到粘膜是由淋巴细胞表达的粘附分子与粘膜血管内皮 表达的组织特异性配体相互作用而启动的【碣】。研究发现参与淋巴细胞归巢与定居的粘附分子有 几类，如整合素、Ｌ．选择素、ｐ７亚家族等。其中主要是整合素，整合素中Ｉ型跨膜糖蛋白，由 ｉｆ，、１３亚基组成，参与细胞之间的粘附。不同的ａ亚基和不同的ｐ亚基可配对形成２０多个整合 素分子，形成不同的整合素亚家族。 （三）有特异的免疫细胞介导和调节黏膜免疫，直接通过粘膜表面上皮细胞接受抗原。Ｌ－ 选择素主要是介导淋巴细胞归巢到外周淋巴结，但也参与淋巴细胞归巢到粘膜淋巴结，它在淋 巴细胞起始粘附及沿内皮滚动中起着重要作用。 （四）独特的抗感染机制：免疫应答由特异Ｔ细胞和细胞因子调节，并诱导分泌大量ＳＩｇＡ， ＳｌｇＡ是黏膜表面特有的抗体，家禽黏膜免疫主要通过ＳＩｇＡ来发挥作用，其含量占粘膜相关组 织产生所有抗体的８０％以上，从而导致局部免疫保护作用【６９１。在局部黏膜，ＳＩｇＡ通过ＳＣ转运 进入黏膜后，当病毒抗入侵时，ＳＩｇＡ大量分泌的ＳＩｇＡ可以与进入黏膜表面的病毒结合，阻止 病毒与上皮细胞的结合，同时黏膜大量分泌黏液蛋白来降解病毒，从而清除病毒的感染【７０１。１．５家禽黏膜免疫主要效应因子ｓＩｇＡ１．５．１ｓＩｇＡ的结构６麻杏石甘粉防治人工感染鸡传染性支气管炎的试验研究 ｓＩｇＡ是由两个或更多的ＩｇＡ单体聚合而成，一个典型的ｓｌｇＡ分子由二个ＩｇＡ单体、一条Ｊ 链（ｊｏｉｎｉｎｇ ｃｈａｉｎ，Ｊ）和一条分泌片（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ｓｃ）构成，ｓｌｇＡ中所有的多肽均由免疫球 蛋白基因超家族编码。ＳＣ则是ＩｇＡ穿上皮转运过程中加上的，是一种糖蛋白，没有免疫活性， 它除了能帮助ＩｇＡ通过黏膜膜表面外，还能够保护ＩｇＡ，抵抗蛋白酶的分解作用，使黏液更加 粘稠，增强了黏附作用及防御能力。Ｊ链是在浆细胞分泌ＩｇＡ前同ＩｇＡ聚合的。这一系列过程 受Ｔ细胞、细胞因子以及激素的调节。另外ｓＩｇＡ主要存在于唾液、泪液、鼻和支气管分泌物 等外分泌液中，禽类的胆汁中富含ｓＩｇＡ，含量较血清高６．８倍，是机体黏膜防御感染的重要成 分。１．５．２ｓｌｇＡ在黏膜免疫应答中的作用 ｓＩｇＡ与病毒结合后能阻断病毒感染与进入宿主细胞。ｓｌｇＡ在外分泌液中以双链和四链的形式存在，ＳＩｇＡ的这种多链性比单链ＩｇＡ对抗原有更大的结合力，可为黏膜表面提供一个免疫屏 障，可以抑制甚至阻断病原体对黏膜的黏附，如ｓＩｇＡ能够阻断禽流感病毒Ａ的黏附【７ｌ】；ＳＩｇＡ 可有效中和黏膜上皮内的病原体、毒素、酶等有害物质，不需要补体就可以与呼吸道、消化道 部位的病毒，形成免疫复合物排出［７２１：ｓｔｇＡ抗体可结合滤泡联系上皮的Ｍ细胞，并经Ｍ细胞 运输到上皮下黏膜淋巴组织中，此过程中ＳＩｇＡ或ＩｇＡ抗原复合物与抗原呈递细胞反应，露出 ＩｇＡ结合位点。进入黏膜组织后，ＳＩｇＡ首先引发黏膜免疫反应，其次，ＳＩｇＡ抗原复合物经Ｍ 细胞运输至上皮下淋巴组织，抗原提呈细胞的ＦＣＡ受体可强化处理和摄取抗原，在这种途径下， 再摄取的ＳＩｇＡ可形成一个扩大环，增强免疫和再免疫反应；最后，Ｍ细胞再次摄取的ＳＩｇＡ可 通过基因型调节免疫反应【７３１。ＳＩｇＡ能有效地与黏膜表面的病原体结合，形成ＳＩｇＡ病原体复合 物，通过肠蠕动或纤毛运动排出体外，此外，ＳＩｇＡ的免疫排斥机制可消除ＩｇＥ和ＩｇＧ的炎性抗 体介导的过敏反应。 此外ＳＩｇＡ还有促进天然抗菌因子作用，可增强乳肝褐质及乳过氧化物酶系统对几种黏膜 病原体的抗菌作用，可通过黏膜淋巴组织增强抗原依赖性细胞并能武装腔中淋巴细胞，从而提 高直接杀伤能力，与分泌物中抗菌物质如乳铁传递蛋白、溶菌酶等有协同作用。 机体在正常状态下，黏膜是防止病原体入侵的主要屏障；但在病理状态下，黏膜屏障便会 失去免疫反应能力，病原微生物及其有毒产物就会入侵机体，产生病理损伤。黏膜免疫系统广 泛分布在呼吸道、消化道和泌尿生殖道，以及唾液腺、泪腺、乳腺等外分泌腺中。该系统在体 。内覆盖面积很大，研究已经证实，机体９５％以上的感染发生在黏膜或由黏膜入侵机体【７４１。黏膜 结合淋巴组织是黏膜免疫应答的组织基础，机体５０％以上的淋巴组织存在于黏膜免疫系统。实 际上，机体感染的主要途径也是消化道、呼吸道和泌尿生殖道等粘膜系统。且实验证明经黏膜 免疫之后，黏膜局部的抗体比血清抗体出现早、效价高，且维持时间长。１．６中药防治病毒性疾病的研究进展随着我国养鸡业的日益兴旺，鸡病也以不可阻挡之势出现。细菌性、病毒性传染病，寄生 虫病，营养代谢病，中毒病以及各种综合感染性疾病时有发生，给养鸡业造成巨大损失。兽医７河北农业大学硕士学位（毕业）论文 工作者在同疾病的长期斗争中，做出了巨大努力，尤其是近年来，用中兽医之理、法、方、药 防治疾病，引起兽医界的重视，尤以中草药以其无与伦比的优势，被越来越多的兽医工作者和 养殖户所接受，中草药防治鸡病已成为发展的必然趋势。 １．６．１中兽医在防治病毒性疾病的理论基础 中兽医在几千年的临床实践中，形成了一套独特的理论体系，与现代医学比较有其独到的 优势，这就是整体观念、辨证论治的理论体系与方法及科学的中药配伍组方。这套理、法、方、 药使人们对疾病的发生、发展、预防及治疗的认识，首先考虑（畜、禽）机体的自卫能力及其生 活环境的自然因素，而不是单独着眼于外邪的致病作用。其治疗方法灵活，因证而变。通过扶 正祛邪，调整脏腑功能的盛衰而使失衡的阴阳复归平衡，这是其特色和优点。 中兽医学治病，从“整体观念”和“辨证施治”出发，根据“治病求因”的观点，提出了 “扶正祛邪”“扶正固本”等基本治疗原则。正虚者（相当于免疫功能低下）治疗以扶正为主， 即调动畜体的抗病力，提高机体的自身免疫功能，做到“正气存内，邪不可干”。邪实而正不 虚者（即抗原过多，易致变态反应）治之以祛邪为主，使机体达到免疫平衡，做到“邪去正自安”。 正虚邪实并存者，治疗则扶正祛邪兼用，一方面提高机体的抗病能力（即增强机体中免疫功能）， 一方面又抑制邪气深入并清除邪气（即抑制抗原的增殖并清除抗原）Ｆ５１。 １．６．２中药对鸡传染性支气管炎的防治现状 中药是祖国医学防治疾病的有力武器。现代研究表明，有些中药不但具有抑杀病毒的作用， 且能够调节机体的免疫功能，有非特异性的抗病毒功能。我国的兽医学工作者对中药防治ｍ 进行了大量的研究工作，用中兽医之理、法、方、药防治疾病，引起兽医界的重视，尤以中草 药以其无与伦比的优势，被越来越多的兽医工作者和养殖户所接受，中草药防治鸡病已成为发 展的必然趋势。张文彬【７６搬道，以牛黄、板蓝根等为主组成的“７８１ ｌ”粒剂，在人工感染病例取得了显著疗效的基础上又进行了大量的自然感染病例试验，其对ｍ的治愈率高达９８．５４％，并认为该粒剂 的问世打破了“目前对该病无特效疗法”的说法。刘群【＿７“７】等通过纯中草药制剂一喉宝和西药红 霉素对鸡常见呼吸道疾病的防治研究结果表明：喉宝对人工感染雏鸡传染性支气管炎的保护率 达８６．７％，具有明显的预防作用（（Ｐ＜Ｏ．ｏｉ），对鸡传染性支气管炎、传染性喉气管炎、慢性呼吸 道病治疗效果优于红霉素（（ｐ＜０．０１）。李新华【７８】等通过纯中草药制剂感喘康对鸡常见呼吸道疾病 的防治研究结果表明：感喘康对人工感染雏鸡传染性支气管炎的保护率达８６．７％，具有明显的 预防作用（（Ｐ＜０．０１），对鸡传染性支气管炎、传染性喉气管炎、慢性呼吸道病治疗效果优于红霉素坼Ｏ．０１）。据报道【７９１，双花、连翘、贯众、川贝母、制半夏、桔梗、炒杏仁、紫苑、冬花、苏叶、茯苓、细辛、米壳、甘草组成了方剂“强力咳喘灵”口服液防治ｍ，结果本法的治愈率 为８９％０３４／１５０），空白对照组的死亡率为６２％（３１／５０）。还有关于家禽慢性呼吸道病的防治报道， 从所用方药分析亦应对ｍ有较好的防治作用。如毕玉霞【舳Ｊ等人用“麻杏石甘散”（麻黄、石膏、 杏仁、甘草等组成）经１８群病鸡的治疗试验，表明对ｍ和慢性呼吸道病的治愈率为９８．５％。刘 振湘【８ｌ】用大青叶、金银花、鱼腥草等中药组方，进行人工感染鸡传染性支气管炎治疗试验并在 大群使用。结果表明，该中药组方对于鸡传染性支气管炎具有较好的防治作用，其防治效果在 ９７％以上。８麻杏石甘粉防治人工感染鸡传染性支气管炎的试验研究１．７中兽药剂型的改革与创新兽医中药产品为什么现在没有国际市场？除了思想文化背景外，与兽医中药产品的缺点有 很大关系。当前兽医中药产品的主要问题是产品的“粗、大、黑”。“粗”是指产品比较粗糙和 剂型单调，产品的高科技含量较低，停留在古老的水平上，没有新的创新和发展；“大”一是指 产品的体积比较大，如散剂，二是指用量大；“黑”是指产品的颜色。发展不离宗，继承不泥古， 对剂型的改革要广泛吸收材料科学的一些新技术和新方法。应用当今技术加以研究，从中开发 出新技术、新剂型，以去除中药或中药复方制剂显效慢、使用不便、疗效不稳定、质量不易控 制的缺点。中药的传统剂型是散剂、片剂、丸剂和注射剂等，中药的剂型改革应借鉴西药的一 些新剂型，如缓释剂、微型包囊技术、透皮剂和脂质体技术等。防治动物疾病关键在于防，如 果能将中药制成透皮缓释剂或其它作用持久、效果可靠的剂型来预防疾病，如奶牛在一个泌乳 期内使用一次类似于这种药物即可防止乳房炎或口蹄疫等的发生，由于中药在乳产品中不会形 成有害残留，其应用前景将十分广阔。１．８本项目研究的目的意义由于ＩＢ具有高度的遗传变异和广泛的组织嗜性，给防治带来很大麻烦。为了有效地预防和 控制该病的发生，现多采用疫苗免疫和西药治疗，但是由于疾病本身特点和疫苗存在的问题以 及西药的种种弊端导致防治效果不甚理想。我国的传统中兽医学博大精深，治疗疾病讲究整体 且标本兼治，用中药治疗病毒性疾病有其独特的疗效。大量研究表明，许多中药具有抗病毒、 抗炎、提高机体免疫力等作用，所以，研究利用这类药以防治病毒性疾病成为当今中兽医学界 的热点。虽然中药用于ｍ的防治已有了大量的研究工作，但已经报道的方剂中多以散剂为主， 只能拌料使用，投药不方便，且影响疗效，对禽呼吸系统疾病防治有一定的困难，因此，研制 出集对症治疗、抗毒、抑菌、增强机体免疫功能、高效、无毒、便于生产于一体的新型防治药 物具有十分重要的意义。为此，我们以中兽医药学理论为指导，将兽药典上关于治疗禽呼吸系统疾病的经典药方――麻杏石甘散原来的粗粉通过一定工艺提取，加工制作成易溶于水的可溶 性粉――麻杏石甘粉，对其进行较系统的研究，在一定程度上阐明其作用机理，为申报新的中兽药奠定基础。９河北农业大学硕士学位（毕业）论文２材料与方法２．１试验材料２．１．１药物麻杏石甘粉：麻黄３００９、苦杏仁３００９、石膏１５００９、甘草３００９，以上４味，取石膏打碎、包裹， 先煎煮０．５ｈ，其它各味粉碎后加入煎煮，煎煮２次，第一次１．５ｈ，第二次ｌｈ，合并煎液，静置，滤 过，滤液减压浓缩至浸膏密度１．１６（６０℃测），冷至室温，加入９５％乙醇使药液含醇量达５０％，静 置１２ｈ，吸取上清液减压回收乙醇至无味，加水至１０００ｒａｌ，以２０％氢氧化钠液调药液ＰＨ值６．肛７．０， 静置５ｈ，过滤，滤清液减压浓缩至１．１５喷雾干燥，加入辅料，制成１０００９，即得。每１００９相当于原生药２４０９。２．１．２病毒ＩＢＶ标准株Ｍ４１Ｅ４，购自中国兽医药品监察所，批号：ＡＶｌ５１ｌ。２．１．３雏鸡和ＳＰＦ种蛋’ＳＰＦ种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，实验室自行孵化至１０日龄； 非免疫１日龄伊莎褐商品代蛋公鸡２４０羽，购自石家庄金羽祖代鸡场。常规饲养至１５日 龄供试验用。试验期间未做任何疫苗免疫。２．１．４主要仪器设备ＦＴ－ＸＦ４微电脑全自动孵化机 ＤＬ℃Ｊ．１Ｎ超净工作台 ＭＤＦ．３８２Ｅ直立式超低温冰箱 ２ｋ．１５台式高速冷冻离心机 ７２２Ｅ型可见分光光度计 ３１８ＭＣ酶标仪 ０８．２３０＿２Ｃ型滑走切片机 Ｓ．３５型日本羽毛牌石蜡切片刀片 ＪＡｌｌ０３Ｎ精密电子天平 ＤＨＧ．９１４０型电热恒温鼓风干燥箱ＤＮＰ．９１ ６２型电热恒温培养箱北京春明方通电子有限公司 北京东联哈尔仪器制造有限公司ＳＡＮＹＯ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｊａｎｐａｎ ｓｉｇｍａ‘上海光谱仪器有限公司 上海三科仪器有限公司ＥＲＭＡ ＩＮＣ．ＴＯＫＹＯ．ＪＡＰＡＮＺＬＩ－９４０１，Ｊａｐａｎ上海民桥精密科学仪器有限公司 上海精宏实验设备有限公司 上海精宏实验设备有限公司２．１．５主要试剂１０麻杏石甘粉防治人ｊ［感染鸡传染性支气管炎的试验研究 鸡ＩＢ抗体检测试剂盒（美国ＩＤＥＸＸ产品），北京爱德士元亨生物科技有限公司；ＡＰＥＳ （ＺＬＩ一９００１，北京中山金桥生物技术有限公司）；ＳＰ一９００２免疫组化试荆盒（中山金桥公司产品）： ３％Ｈ２０２，生物素标记羊抗小露ｌ，ＩｇＧ－－抗和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液，ＤＡＢ显色液； 小鼠抗鸡ｌｇＡ单抗（ＳＢＡ公司产品）。２．２试验方法 ＩＢＶ种毒复壮与半数鸡胚感染量（ＥＩＤ５０）的测定２．２．１１药物配制１）ＰＢＳ ＫＣｉ ＮａＣＩ Ｎａ２ＨＰ０４。１２Ｈ２０ ＫＨ２Ｐ０４Ｏ．２９８９ １．４４９ ０．２４９双蒸水８００ｍＬ溶解，定容至１０００ｍＬ，调ｐＨ值７．４ ２）双抗 青霉素 链霉素 ＰＢＳ液 １００万ＩＵ１０００ｍｇ ５０ｍＬ ｍＬ将青、链霉素溶解于５０ＰＢＳ液中，此为双抗溶液，无菌操作，分装小瓶，每瓶１０ ｍＬ，每ｍＬ内含有青霉素２万ＩＵ，链霉素２０ ｍｇ，低温冻结保存，使用时每２０ｍＬ加双抗ｌｍＬ， 即每ｍＬ含青霉素１０００ＩＵ，链霉素ｌｍｇ。２ＩＢＶ种毒复壮 １）接种前处理：先用检卵灯在暗室检查鸡胚活力，并用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要 接种的部位做好一个记号。鸡胚发育正常时，可见清晰的血管及活的鸡胚，血管及其主要分支 均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。未受精和死胚胚体固定在一端不动，看不到血管，应剔出。２）实验操作要求：所有操作必须严格无菌。实验室、实验超净台都需事先用紫外线消毒２０－－３０ 分钟，实验用具应高压消毒灭菌。接种操作在超净台进行。 ３）尿囊腔接种 取出鸡胚，在鸡胚气室接近胚位处（打孑Ｌ的位置）用碘酒棉、酒精棉进行消毒，用钢锥在酒 精灯火焰灼烧消毒后，在气室顶端和气室下沿无血管处各穿－－ｄｑ：Ｌ； ＩＢＶ标准株Ｍ４１种毒按ｌ：１０稀释，加双抗后４。Ｃ作用４．６ｈ，注射器吸病毒稀释液，随后将注 射器针头从气室下沿小孔垂直插入０．５～１．０厘米处（避开血管），注入Ｏ．２ｍｌ接种物。紧接着用石 蜡封口，并置孵卵箱中直立孵育，２４／Ｊ，时内夕Ｅ亡者废弃。 孵育３６．４０／Ｊ，时后进行收获尿囊液，取出放４＂Ｃ冰箱过夜或．２０℃冰箱中１．５小时冻死鸡 胚，以免收获时出血。河北农业大学硕＋学位（毕业）论文 收集尿囊液：从冰箱取出鸡胚，用碘酒或７５％酒精消毒气室部卵壳，在超净台用镊子剥开 气室部位的蛋壳，撕去内层壳膜和绒毛尿囊膜，用镊子轻轻按住胚胎，以无菌吸管或消毒注射 器避开血管吸取尿囊液，以３０００ｒ／ｍｉｎ离，ｔ：，３０ｍｉｎ，取上清，将收集的鸡胚尿囊液均合并后分装， 保存于．２０℃冰箱，以备下次传代用。 以上方法盲传５代，实验用毒种是ＩＢＶ第５代病毒。３ｌＢＶＥＩＤ５０的钡９定取３５枚ＳＰＦ鸡胚，分为７组，每组５枚。３７℃培养至ｌＯ日龄全部存活，将种毒液用生理 盐水液稀释为ｌＯ～、１０’４、１０４、１０。６、１０～、ｌＯ罐六个不同的稀释浓度，每个浓度尿囊腔接种５ 枚鸡胚，每胚０．２ｍｌ，剩余５枚鸡胚作为对照组接种生理盐水。将接种后的鸡胚在３７＂Ｃ条件下 培养，每天在检蛋灯下观察鸡胚存活情况。２４ｈ内死亡的鸡胚弃去不计，观察１４８ｈ，详细记录 死亡与存活数，用Ｒｅｅｄ．Ｍｕｅｎｃｈ法计算其ＥＩＤ５０【８２１，具体公式为 距离比＝（高于５０％的感染百分数－５０）／（高于５０％的感染百分数一低于５０％的感染百分数） ＥＩＤ５０＝高于５０％感染的病毒最高稀释度的对数＋距离比２．２．２人工感染鸡传染性支气管炎病毒模型的建立将试验用１５日龄雏鸡用１００ ＥＩＤ５０ ＩＢＶ第五代鸡胚尿囊液滴鼻染毒，０．２ｍＬ／只。将攻毒鸡只隔 离在密闭健康环境中饲养。饲养环境中人工调节室温，每日均给予保持低温环境１０―１５＂Ｃ２－４ｈ，其他时间保持房间的室温１８．２０＂Ｃ左右，并利用频繁室内洒水使室内湿度保持在７０％以上。攻毒后， 密切观察试验鸡的发病状况。２．２．３麻杏石甘粉对人工感染ＩＢＶ雏鸡的疗效试验ｌ试验分组及动物处理 １５日龄鸡２４０只，随机分成８组，每组３０只，各组隔离饲养。药物试验组予染毒后４８ｈ， 分别在饮水中投放相应浓度的药物，连用３ｄ。试验鸡自由饮水和采食。具体分组及用药见表ｌ。表ｌ试验分组与用药Ｔａｂｌｅ １ Ａｎｉｍａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ３临床疗效的观察 １）观察用药前、后鸡只的临床症状，主要包括精神状态、食欲、呼吸、咳嗽和哕音等；从１２麻杏石甘粉防治人‘Ｔ感染鸡传染性支气管炎的试验研究 １）观察用药前、后鸡只的临床症状，主要包括精神状态、食欲、呼吸、咳嗽和哕音等；从 给药后每天记录鸡只的死亡数，攻毒后２ｄ之内死亡者不计，最后统计死亡率以及药物对雏鸡 的有效率和治愈率。 ２）疗效评价标准 治愈率：试验期间，经用药后临床症状消失，精神及采食情况恢复正常判为治愈；每组治愈 鸡数占每组试验鸡数的百分率为治愈率。 有效率：除完全治愈的鸡只为有效外，凡试验期间未死亡，并且症状明显减轻，粪便、精神、 饮水、食欲有好转者也视为有效；每组存活鸡占每组试验鸡数的百分比为有效率。 死亡率：凡在试验期间死亡，剖检有ＩＢＶ特征性病变者判为死亡；死亡鸡数占每组试验鸡数 的百分率为死亡率。．２．２．４样品的采集与处理于雏鸡１８、２ｌ、２４、２７、３０日龄时，每组随机取６只鸡，无菌心脏采血，分离血清，．２０＂Ｃ保 存用于检测抗体水平；然后将雏鸡处死，摘取脾脏、法氏囊，滤纸吸去表面的水分，用分析天平 称重，计算免疫器官指数（免疫器官指数＝免疫器官重ｍｇ／体重ｇ）；取相同部位支气管于Ｂｏｕｉｎ氏液 中固定，常规石蜡切片，免疫组化染色方法用以Ｉ酣分泌细胞的检测。２．２．５病理组织学检查取气管、肺部分组织波恩液固定，常规石蜡包埋切片，苏木精．伊红（Ｈ．Ｅ）染色，光镜下 观察组织病理学变化。 １常规石蜡切片的制作 从７５％酒精溶液中取出固定组织块，经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，在滑走 切片机上切４～５９ｍ的切片。２Ｈ．Ｅ染色 常规脱蜡至水，苏木素染色５－８ｍｉｎ，０．５％ＨＣＩ酒精分色，自来水冲洗，梯度乙醇上行，０．５％伊红乙醇染色ｌｍｉｎ。脱水、透明、中性树胶封片。２．２．６免疫器官指数的测定．于雏鸡１８、２ｌ、２４、２７、３０日龄时，每组随机取６只鸡，剖杀摘取脾脏、法氏囊，滤纸吸去 表面的水分，用分析天平称重，计算免疫器官指数（免疫器官指数＝免疫器官蚕：ｍｇ／体重曲。２．２．７ＥＬＩＳＡ测定血清中抗体的相对水平根据抗原抗体特异性结合的性质，用ＥＬＩＳＡ试剂盒检测血清中ＩＢＶ抗体水平：按照试剂 盒说明书操作，试剂盒反应终止后，在酶标仪６３０ ｎｎｌ处测量和记录吸光（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ） 值。１３河北农业大学硕士学位（毕业）论文 本试剂盒要求实际测定样品时，阳性对照孔所得的均值减去阴性对照孑Ｌ所得的均值大于 ０．０７５时，阴性对照孔所得的均值小于或等于０．１５０时测定结果才有效。 终点抗体滴度（１：５００）－Ｌｏｇｌｏ滴度＝１．０９（ＬｏｇｌｏＳ／Ｐ）＋３．３６ 其中Ｓ／Ｐ值＝（待测样品ＯＤ值一平均阴性样品ＯＤ值）／（平均阳性样品ＯＤ值一平均阴性样 品ＯＤ值） 滴度判断：滴度≤３９６为ＩＢＶ抗体阴性，＞３９６为ＩＢＶ抗体阳性。２．２．８ＳＰ染色法检测ＩｇＡ分泌细胞石蜡切片脱蜡至水，经３％Ｈ２０２处理，５％正常羊血清封闭，弃羊血清后直接加入小鼠抗鸡ＩｇＡ 单抗（ＳＢＡ公司产品），４＂Ｃ过夜，ＰＢＳ洗涤后分别加入用生物素标记羊抗小自４ＩｇＧ－抗（３７＂Ｃ、４０ｍｉｎ，中山金桥公司产品）和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液（３７℃、３５ ｒａｉｎ，中山金桥公司产 品）孵育，ＤＡＢ（中山金桥公司产品）显色；梯度酒精脱水、二甲苯透明．、中性树胶封片。阴性对照 组用ＰＢＳ替代兔抗鸡ＩｇＡ单抗。结果判定：镜下ＳＩｇＡ阳性反应物呈棕红色或棕黄色。 在１０Ｘ４０光镜下，用Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜观察ＩｇＡ分泌细胞的分布并拍照，利用ＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ软件分析支气管中ＩｇＡ分泌细胞的阳性表达率（ＩｇＡ分泌细胞阳性表达率（％产视野中ＩｇＡ分泌 细胞所占面积／观察视野面积×１００％）。每组选取ｌＯ张切片，每张切片选取１０个视野，进行 统计。２．２．９急性毒性试验采用改进Ｋａｒｂｅｒ法测定【２】，以半数致死量（ＬＤ５０）评价麻杏石甘可溶性粉的毒性。将４０只 小白鼠随机分为４组，每组ｌＯ只，并且保证雌雄各半。给药途径为口服，根据预试试验的０％ 和１００％动物死亡的剂量范围，分成四个剂量组，组间剂量比为ｌ：０．８。用药量分别为１．２００９、 ０．９６０９、０．７６８９、Ｏ．６１４９，。试验期为７ｄ，观察动物临床表现和死亡情况。２．３统计学处理。用ＳＰＳＳｌ３．０对数据进行单因素方差分析（Ｏｎｅ Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ），Ｐ＜０．０１为差异极显著，Ｐ ＜０．０５为差异显著。结果以平均数和标准差（Ｍｅａｎ士ＳＤ）表示，疗效结果进行ｘ２（Ｃｈｉ．ｓｑｕａｒｅ）检 验。１４麻杏石甘粉防治人丁感染鸡传染性支气管炎的试验研究３结果３．１ＩＢＶ的ＥＩＤ５０的测定根据ＩＢＶ．Ｍ４１尿囊液接种ＳＰＦ鸡胚后的照蛋结果，用Ｒｅｅｄ．Ｍｕｅｃｈ法计算ＩＢＶ的ＥＩＤ５０为 ｌＯ矗６８／０．２ｍＩ。表２ Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｃｈ氏法计算ＩＢＶ的ＥＩＤ５０Ｔａｂｌｅ ２ Ｃａｌｃｕａｌｔｉｏｎ ｏｆＥＩＤｓｏ ｏｆｔｈｅ ＩＢＶ ｂｙ Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｃｈ距离比＝（６１．５―５０）／（６１．５．２５）＝０．３２ＥＩＤ５０＝１９１０。６＋ｏ．３２＝－５．６８３．２人工诱发雏鸡支气管炎试验结果根据本试验结果，给每只供试雏鸡滴鼻０．２ｍＬ供试毒液，并人工制造低温潮湿环境成功诱 发了鸡传染性支气管炎，病鸡表现出明显的临床症状与病理特征。 临床观察发现试验鸡于攻毒３６ｈ后陆续发病，迅速波及全群。第３天开始症状明显，病鸡主 要表现为精神沉郁、不安或嗜眠、畏寒怕冷、积堆，羽毛松乱，垂翅呆立，甩头、粘涕、喷嚏、 喘咳、出现明显的气管哕音，晚上症状尤为明显。健康对照组鸡全部健活。剖检发现病鸡鼻道、 气管、支气管粘膜肿胀，腔内含有不同数量的浆液、粘液或干酪样渗出物：支气管和气管交界处 有出血，而气管的环状部分也呈现出血症状；气囊混浊；其它脏器未见异常。３．３疗效试验结果经卡方检验，雏鸡感染ＩＢＶ后，模型组死亡率显著高于正常组（Ｐ＜０．０１），药物治疗组死亡 率显著降低，且ＩＩ、ＩＩＩ组与阳性对照组差异显著（Ｐ＜ｏ．０１）。各药物治疗组之间ＩＩ、ＩＩＩ治愈率 显著高于Ｉ组，其中Ｉ组与Ⅳ、Ｖ、Ⅵ组之间差异显著（Ｐ＜０．０５）：ＩＩ、ＩＩＩ组用药３ ｄ即控制了 病情，治疗效果最佳。表３，图ｌ一２。１５河北农业大学硕＋学位（毕业）论文表３疗效试验结果ｊ｜｜ｊ｜｜｜｜｜｜ｊ ｊ ｊ｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜ｊ ｊ｜｜｜｜ｊ｜｜ ¨拍射＾｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜注：不同大写上标字母表示差异极显著（Ｐ＜Ｏ．０１），不同小写上标字母表示差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５），下 表同。Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ａｎｄ ｃａｐｉｔａｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０．０５ ａｎｄ ０．０ １ ｌｅｖｅｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｉｓａｓｆｏｌｌｏｗｓ．４０ ； ： ；， 』７｜ｉ １１０ＯⅧ图ｌ麻杏石甘粉防治人－Ｔ感染鸡传染性支气管炎的试验研究∞ｏ Ｕ∞ － ｏ ■ ｊ９０ｌ一渔盒到∞∞ ∞ ∞０３ 褥 诵 艇刚■■■■■■ＩＩ轴■＿Ⅳ ＶＯ０ｍⅥⅦⅧ组别（ｇｒｏｕｐｓ）图２各组雏鸡治愈率的变化Ｃｈａｒｔ ５ｃｕｒｅｒａｔｅｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ３．４组织病理学观察结果显微镜下观察，健康对照组气管组织结构清晰、完整（附图Ａ１）。模型组在攻毒后３ｄ（１８ 日龄），气管粘膜水肿，气管纤毛缺损，上皮细胞完全脱落：固有膜内小血管充血、出血，炎 性细胞浸润，上皮细胞大部分脱落（Ａ２）；攻毒后６ｄ（２１日龄），气管上皮细胞脱落明显， 固有层显露，腺体细胞大多数崩解消失，只留腺体轮廓及少量残留细胞（Ａ３）；在２４日龄时， 固有层淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞增生，并有少量浆细胞。同时见残留腺体细胞及上皮 细胞开始再生。部分病例气管腔内有较多的脱落上皮细胞及渗出的纤维素、红细胞、淋巴细胞 等（Ａ．４）。麻杏石甘散散剂剂量组在１８日龄时，可见气管上皮细胞完全脱落，腺体细胞大多 数崩解消失，只留腺体轮廓及少量残留细胞，在２１日龄时才依稀可见再生的腺体。而麻杏石甘 可溶性粉中、高剂量组两组间无显著差异，均能提前上皮细胞和腺体细胞再生过程，并使再生 过程加快， ２１日龄时，已可见再生的上皮细胞有的已形成高柱状，崩解的腺体通过再生已出现腺体结构。固有层浸润增生的炎性细胞减少（Ａ５）。２１日龄时，上皮细胞和腺细胞再生过程 明显，再生细胞排列规则，损伤的黏膜通过再生基本由新生细胞覆盖，部分上皮细胞已分化形 成柱状并出现纤毛。腺体结构基本恢复，淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等细胞的增生进一 步明显，上皮细胞和腺体细胞再生较普遍（Ａ６）。 显微镜下观察，健康对照组的肺组织结构清晰、完整、肺泡壁等均未见异常病理变化（附 图Ｂ１－Ｂ２）。模型组在攻毒后３ｄ（１８日龄），支气管黏膜上皮细胞肿胀，部分破坏脱落，固有 层轻度出血、水肿，有数量不等的淋巴细胞及异嗜性粒细胞散在浸润，管腔内含有脱落的上皮 细胞及炎性渗出物（Ｂ３）。攻毒后６ｄ（２１日龄），肺内各级支气管扩张，支气管黏膜上皮脱 落，黏膜层充血，有多量淋巴细胞和单核细胞浸润，管腔内充满炎性渗出物、脱落上皮细胞和 红细胞（Ｂ４）。麻杏石甘可溶性粉各剂量组用后均有不同程度的好转，中、高剂量组效果最好， 在２１日龄时可见组织病变减轻，炎性渗出和红细胞渗出明显减少，支气管腔扩张状态明显减轻， 其黏膜的皱褶也接近正常，部分上皮细胞开始重生（Ｂ５）；２４日龄时炎性细胞基本已经消失，肺１７河北农业大学硕士学位（毕业）论文 泡中渗出的红细胞不可见，肺泡结构基本完整（Ｂ６）。３．５免疫器官指数的动态变化３．５．１对脾指数的影响在雏鸡１８龄时，各试验组的脾指数差异不显著，随着药物作用的发挥，麻杏石甘粉中、高剂 量组在２ｌ龄时达到显著水平（Ｐ＜０．０５），在２４Ｈ龄时与各组达到极显著水平差异（Ｐ＜０．０１），并持 续到２７日龄；麻杏石甘散中剂量组和高剂量组对脾指数也有一定提高作用，但只有至ＪＪ２７日龄时与 对照组相比才有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。详见表４，图３。表４不同试验组的脾指数Ｔａｂｌｅ ４ Ｓｐｌｅｅｎ ｉｎｄｅｘ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐｓ噬－ｇＣ３．ｇ∞２．量１．籁 靼０． 琏 １８日龄 ２１日龄２４日龄 日龄（ｄ）２７日龄３０日龄图３不同试验组的脾指数Ｃｈａｒｔ ３ Ｓｐｌｅｅｎ ｉｎｄｅｘ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐｓ３．５．２对法氏囊指数的影响法氏囊指数随着雏鸡日龄的增加而减小，但其中麻杏石甘粉中、高剂量组下降的速度较其１８麻杏石甘粉防治人工感染鸡传染性支气管炎的试验研究 他各组慢，到２４日龄时麻杏石甘粉中、高剂量组与其他各组相比有显著性差异（Ｐ＜０．０５），甚 至到３０日龄时表现为极显著差异（Ｐ＜Ｏ．０１）；而麻杏石甘散中剂量组和高剂量组只有在３０日龄 时才与对照组有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５）。详见表５，图４。表５不同试验组的法氏囊指数Ｔａｂｌｅ ５ Ｂｕｒｓａ ｏｆ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓｉｎｄｅｘ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐｓ５留时昌ｎｑ一籁靼球岖燃ｆ＿】ｃｏ口 一∞Ｔ１ｔｕ一．工。时‘ Ｏ１８日龄２１日龄２４日龄 日龄（ｄ）２７日龄３０日龄图４不同试验组的法氏囊指数Ｃｈａｒｔ ４ Ｂｕｍａ ｏｆＦａｂｒｉｃｉｕｓ ｉｎｄｅｘ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐｓ３．６ＩＢＶ抗体测定结果抗体测定结果显示，健康对照组中抗体滴度始终为阴性，攻毒后，各攻毒组的抗体滴度呈增 加趋势，其中麻杏石甘粉中、高剂量组在１８日龄时的抗体滴度就显示为阳性，且与其他各组有显 著差异（Ｐ＜Ｏ．０１），一直到实验结束，此差异始终存在（Ｐ＜Ｏ．０１）；而麻杏石甘散中剂量组和高剂量组 到２４日龄时才显示为阳性，与模型组相比有显著差异（Ｐ＜Ｏ．０５），与健康对照组相比，模型组血 清ＩＢＶ抗体滴度虽然显著增加，但只在鸡群即将耐过时（２４日龄时）为阳性。详见表６，图５。１９河北农业大学硕士学位（毕业）论文表６血清中ＩＢＶ抗体检测结果Ｔａｂｌｅ６ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＩＢＶ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｓｅｒｕｍＯ０ ０ Ｏ ＾∞ｈｏｐ＿【ｐ０Ｏ吾。口召暑蔷Ｈ一趟壤蛙避０枷啪咖姗咖蜘姗ｏ Ｏｉ◆１８日龄 ２１日龄 ２４日龄 ２７日龄 日龄（ｄ）图５血清中ＩＢＶ抗体检测结果Ｃｈａｒｔ ５ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆＩＢＶ＋Ｉ ＋ＩＩ，Ⅲ＋Ｖ ＋Ⅵ 十Ⅶ 一Ⅷ～＊Ⅳ３０日龄ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｓｅｒｕｍ３．７ＩｇＡ分泌细胞的分布特点及数量变化数据分析结果表明，正常情况下，ＩｇＡ分泌细胞阳性表达率维持一定水平，攻毒后３ｄ（１８日龄），攻毒组ＩｇＡ分泌细胞的数量上升明显，且与空白对照组相比呈显著差异（ｐ＜Ｏ．０５），其中，麻杏石甘 粉中、高剂量组的ＩｇＡ分泌细胞数量显著高于其他攻毒组（ｐ＜０．０５）；攻毒后６ｄ（２１日龄），麻杏石甘 粉中、高剂量组阳性表达率与其他各组相比差异极显著（ｐ＜Ｏ．０１），且到实验结束，此差异始终存 在（Ｐ＜Ｏ．０１）；而麻杏石甘散组只有在２１日龄时，其中剂量和高剂量组才与模型组相比差异极显著 （ｐ＜０．０５）；此后，攻毒组阳性表达率继续上升，但麻杏石甘散组的增加幅度显然不及麻杏石甘粉 组，而且在３０日龄时，ＩＩ、ⅡＩ组仍然维持上升趋势。详见表７，图６．７。２０―――――――――ｊ堡查至旦型堕堕塑皇薹堑壑墅燮皇笪壅竺姿丝婴窒表７对ＩｇＡ分泌细胞的影响掣－―塑冬―世Ｌ迎．！！旦墼一Ｔａｂｌｅ ７ Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｔｈｅ ＩｇＡ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓｌ！旦旦坠６５，４８＋０?５２曲６．５１士０．２５＆８．９３４－０．１６她８．５１：主０．Ｉ产８．６ｌ±ｏ．１９Ｂ５?９８士Ｏ．一－２４ ８．７１４－０．４２＾１１．０３：ｔ－０．５５Ａ １ ０。３２＿４－０．４４Ａ儿 ＩｌＩ ＩＶ Ｖ ｖＪＶｕ６ ６ ６ ６ ６６１１．５５：ｔ－０．３１＾ＩＩ．９２±ｏ．１７＾１５?８６士Ｏ?４５‘７?６３：ｔ－０．５５Ａ０．９跚．４７Ａ５?２５如～７３１１．２５±ｏ．５２＾Ｂｃｂ５．８９－±＇－０．３４肪６．９３＋０。４６Ｂｃ７．１２＋０．８８曲７．３４±Ｏ．５ｌ５?３４：ｔ－０?２８曲６．２３：Ｌ－－０．６８ａｌ，８．１７：￡０．５２胁８．３４：［－０．４７＆８．４８±０．３３鼬 ８．５８生０．６３两 ６．９０士０．３４Ｂｃ ８．７６士Ｏ．６ ｌＢ５?４ｌ：ｔ－Ｏ?２２曲６．７２．－＋０．２７鼬７．９８．Ｉ－０．４８Ｂｂ ５?１３士０?２５ｂ ５．９２．：１：０．１６Ｂｃ ６．７１士０．４０蹦６．９５士Ｏ．３ ｌ＆＿ＬＬ翌坐Ｌ羔堡塑ｃ＿型竺！：！！：型型！：塑型！：１４ １２ ｌＯ ８ ６一∞一 ｏ∞ａ譬２０廿∞《宕Ｔ４ ２Ｊｏ苦ｎ：告ｖ啊藕窨基露嚣求《∞Ｈ０１８日龄２１日龄２４日龄 日龄（ｄ）２７日龄３０日龄２１河北农业大学硕士学位（毕业）论文图６［ｇＡ分泌细胞的数量变化Ｃｈａｒｔ ６ Ｔｈｅ Ｑｕａｎｔｉｔｙ ｃｈａｎｇｅ ｏｆｔｈｅ ＩｇＡ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ鞋；ｉ芷＊ 静图７：Ａ．健康对照组，黏液腺、固有层和黏膜下层结构清晰，Ｂ．健康对照组，ＩｇＡ分泌细胞均匀的分 布在黏膜固有层中，Ｃ．模型组，黏液腺、固有层和黏膜下层之间界限不明显，支气管黏膜层变薄，易脱落，Ｄ．模型组，高倍镜下气管黏膜层紊乱，ＸｇＡ分泌细胞杂乱分布于支气管黏膜层中，Ｅ．麻杏石甘粉中药中剂量组，支气管黏膜层开始增厚，结构开始清晰，Ｆ．麻杏石甘粉中药中剂量组，ＩｇＡ 分泌细胞显著增多。图中箭头所指即为ＩｇＡ分泌细胞，比例尺为１００肛ｍ（Ａ、Ｃ和Ｅ）、２５ ｇｍ（Ｂ、Ｄ 和Ｆ）。。注：ａ：黏液腺：ｂ：气管软骨；ｃ：固有层；ｄ：黏膜下层。Ｆｉｇ １．Ａ．ＩｇＡ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｍｕｃｏｕｓ ｇｌａｎｄ，ｔｈｅ ｂｏｕｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａａｎｄｓｕｂｍｕｃｏｓａ ｉｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．Ｂ．［ｇＡ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓａｒｅｗｅｌｌ―ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ．Ｃ．ＩｇＡ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｂｏｕｎｄ ｉｓｉｎｃｈａｏｓ．ｔｈｅ ｓｔｒａｔｕｍ ｍｕｃｏｓｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｏｎｃｈｕｓ ｉｓ ｇｅｔｔｉｎｇ ｎｌｉｎｎｅｒ ａｎｄ ｅａｓｙ ｔｏ ｆａｌｌ ｏｆｆ．Ｄ．ＩｇＡ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｃｏｎｆｕｓｅｄａｎｄｄｉｓｏｒｄｅｒｌｙＥ．ＩｇＡｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｄｄｌｅ ｄｏｓｅ ｏｆｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒ ｇｒｏｕｐ，ｍｕｃｏｓａ ｂｅｃｏｍｅ ｔｈｉｃｋｅｒ，ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｓｔａｒｔｓｔＯｄｉｓｔｉｎｃｔ．Ｆ．ＩｇＡ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎｍｉｄｄｌｅ ｄｏｓｅｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅ ＩｇＡ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｐｏｉｎｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｒｒｏｗｓ．Ｓｃａｌｅ ａｎｄｂａｒ：１００ｐｍ（Ａ，ＣＥ），２５ ｐｍ（Ｂ＇ＤＦ）．麻杏石甘粉防治人工感染鸡传染性支气管炎的试验研究Ｎｏｔｅ：ａ：ｍｕｃｏｕｓ ｇｌａｎｄ；ｂ：ｔｒａｃｈｅａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｓ；ｃ：ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ；ｄ：ｓｕｂｍｕｃｏｓａ．３．８急性毒性试验结果经过７ｄ的观察，口服组小白鼠给药后运动减少，给药量为１．２００９、０．９６０９的试验组小白鼠 有半数精神萎靡，灌药０．５ｈ后开始恢复活力，吃少量的水和食物，ｌ￣２ｈ后饮食和活力都恢复 正常，给药量为０．７６８９、０．６１４的组及对照组表现正常。试验中所有小白鼠都没有死亡，动物生 长良好，呼吸、活动正常，饮食、饮水、排便均正常，口、眼、鼻，无异常分泌物。由于没有 出现中毒死亡现象，按毒理学评价标准，可不必测半数致死率（ＬＤ５０），可认为ＬＤ５０＞１２００× １０００／２０ｍｇ／ｋｇ体重（小白鼠平均体重２０９）即ＬＤ５０＞６００００ｍｇ／ｋｇ体重，表明该药物无急性毒性， 安全。河北农业大学硕士学位（毕业）论文４讨论４．１ＩＢＶ人工感染模型的建立人工致雏鸡感染ＩＢＶ发病模型的建立，是本研究的首要问题。Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｈｏｖｅ等【ｓ列发现， 大肠杆菌对ＩＢＶ的致病性具有重要的协同作用，单独用各ＩＢＶ分离毒株进行攻毒时，很少发现 能对鸡产生严重的临床症状，但如果同时混合接种ＩＢＶ及大肠杆菌两种病原体，则能诱导出与 自然病例十分相似的临床症状及高死亡率。Ｒｏｕｓｓａｎ等发现，当ＩＢＶ与败血支原体混合感染时， 会产生比ＩＢＶ毒株单独感染严重得多的临床症状和病理变化瞰】。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等发现鸡传染性法 氏囊病会加剧ＩＢＶ的感染程度及延长疾病的持续时间【８５１。虽然ＩＢＶ与大肠杆菌、败血支原体 以及鸡传染性法氏囊病混合感染可以加剧ＩＢＶ的致病性，但是却会使我们的研究中多了一个混 杂因素，会对我们药物研究的结局具有不可知性，因此我们放弃了混合感染致病的造模方式。 由于有研究认为呼吸道病毒感染与环境的湿度高度相关【８６］。于是我们考虑建立一定的环境因素 来刺激ＩＢ的发生，也即给予模型雏鸡可调控的寒冷与潮湿环境刺激。这些环境因素对实验的便 利进行提供了条件，而且环境因素是可控制因素，避免了实验中的非控制因素的产生，使实验 更加具有可比性。 我们在借鉴前人的研究基础之上【８７ｌ，对此模型进一步研究。首先，我们选用雏鸡作为实验 对象。虽然所有年龄的鸡均易感ＩＢＶ，但是雏鸡的感染发病更为严重，短时间内发病率就达到 １００％，死亡率可以高达５０％以上。而６周龄以上的鸡感染后呼吸道症状则较为温和，且很少见 死亡【明１；其次低温刺激和潮湿的环境，因为临床诱因的存在是ｍ发病的重要条件，Ｉｇｎｊａｔｏｖ／ｃ等在研究澳大利亚的ＩＢＶ毒株的致病时发现饲养在寒冷环境中的实验组的致病性明显增科秘Ｊ。本实验证明，在接种ＩＢＶ．Ｍ４１后，对雏鸡进行了冷刺激，并频繁在室内洒水，攻毒组雏鸡 在第３ｄ均出现了比较明显的呼吸道症状：喷嚏、咳嗽、呼吸罗音以及呼吸困难等症状。这与 Ｉｇｎｊａｔｏｖｉｅ等【８９】的研究结果基本吻合。且病理组织学检查也证实呼吸型ｍＶ－Ｍ４ｌ毒株引起了典 型的呼吸道病理改变：气管粘膜下血管充血、出血，粘膜上皮细胞受损、坏死；支气管固有层 充血、出血；肺充血、出血，肺内支气管粘膜下出血、异嗜性粒细胞浸润，肺内大量淋巴细胞 增生、浸润以及原有组织结构消失等。从攻毒后的鸡只临床症状、死亡鸡只的剖检病变症状等 可以说明，本实验成功建立理想的ｍ模型，为接下来的研究打好了基础。４．２中药方剂分析麻杏石甘散（汤）源于张仲景的《伤寒论》