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车停好,摘档,拉手刹,熄火。顺序不错吧?可是过几个小时,钥匙再插进去发动,拧不动,也发动不了。把手刹松掉,车子稍微前后移动下,再插进去发动,ok。我很纳闷,不知道原因在哪里。买车三个月,出现三次这种现象,木有顾上问ssss。请大神分析下。
二星认证车友会
&不清楚&如果不是没踩离合这种问题的话真不清楚具体情况了
【新乡M4车友会】风刹白CX927牧野Q群:
钥匙再插进去发动,拧不动,
&于& 09:26&发表在&钥匙再插进去发动,拧不动,拧的时候稍微转一下方向盘就拧动啦
方向盘锁上了吧!
方向盘没回正,拔掉钥匙后锁上了。钥匙插进去,踩离合。动方向盘,同时拧钥匙就OK了&
&于& 20:37&发表在&方向盘没回正,拔掉钥匙后锁上了。钥匙插进去,踩离合。动方向盘,同时拧钥匙就OK了&如果有下次试一下,
四星认证车友会
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方向盘锁住了,轻轻摇动下就好了...
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下一主题:求各位大神推荐调香入门,以及调香前所需要准备的工具还有香料? - 知乎51被浏览<strong class="NumberBoard-itemValue" title="1分享邀请回答315 条评论分享收藏感谢收起关注今日:10 | 主题:408682
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刚进实验室,跑了半个月WB,内参都没出结果,我把步骤写下来,请求各位大神们帮我看看哪一步错了,万分感激!
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一、提取蛋白取50mg脑组织加入500uL RIPA裂解液+5uLPMSF(100:1),冰上裂解30分钟,12000转 4℃离心20min,取上清分装,-20℃储存。二、测蛋白浓度(用的PierceBCA试剂盒)按说明书50:1配置BCA工作液,按说明书加水稀释标准蛋白至各个浓度,分装到A、B、C、D、E、F、G、H、I九个离心管里,标准蛋白终浓度分别为(2000ug/mL、1500 ug/mL 、1000 ug/mL、750 ug/mL、500 ug/mL、250 ug/mL、120 ug/mL、25 ug/mL、0 ug/mL);取各个稀释浓度的标准蛋白25uL加入96孔板里,取待测蛋白样品5uL加入96孔板,用水补到25uL,每孔加200uL配置好的BCA工作液;37℃孵育1小时,调至562测各孔吸光值。用EXCEL绘制标准曲线图(如下图),得出公式,代入求出待测蛋白浓度,待测蛋白用水稀释5倍,终浓度为X5后的浓度,用RIPA裂解液平衡至统一浓度。三、电泳按说明书配置10%分离胶,用水压平,待胶和水之间出现明显折线之后加入配置好的5%的浓缩胶,插入梳子,待凝固后装配上电泳槽,倒入电泳液,(两块玻璃板之间的电泳液都是用新的,旁边的一般会多用两次),垂直小心拔出梳子,根据蛋白浓度计算上样量(我把浓度都调成4ug/ul,因此我每孔加样加了10ul),两侧加入MAKER,其余孔我一般都加相同体积废弃的蛋白,80V跑出浓缩胶,120V跑1h。四、转膜取出玻璃板,切割目的蛋白所在的胶,把遇冷的转膜液倒入盆中,把转膜夹泡入转膜液里,PVDF膜泡在甲醇里备用,黑面在底,依次放入,海绵,三层滤纸,胶,PVDF膜,三层滤纸,海绵,每放一层都赶走气泡,最后合上转膜夹,黑对黑,白对红放入转膜槽,250mv转1h40min。五、封闭取出转好的PVDF膜,泡在5%BSA里封闭1h。六、一抗孵育按说明书推荐的浓度1:1000(10ul抗体+10ml碧云天一抗稀释液),每张膜放入5ml冰箱4℃过夜。七、二抗孵育取出孵育好的PVDF膜,用TBST漂洗3次,每次10min,按说明书加入二抗(一抗是内参,来源是小鼠,二抗用了兔抗鼠的,1:5000比例稀释),室温摇床孵育1h,TBST漂洗3次,每次10min。七、发光显影(加ECL发光液白天拉上窗帘)按1:1配置发光液(400ulA液+400ulB液),取干净保鲜膜,把PVDF膜取出放置在保鲜膜上,均匀加上发光液,每膜400ul,静置1-2分钟,把发光液吸走,放入干净的保鲜膜并包上,放入X线暗盒,拿入小黑屋,剪差不多大小的X线胶片,分别放入X线暗盒压平1分钟,放入显影液,待出现条带后,放入水中涮一下,放进定影液中至胶片透明。1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、5小时、隔夜都压过了,什么都没有,进小黑屋关上灯并没有看见荧光,不知道哪一步出了问题,做了半个月,连内参都出不来。
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也不传个图片上来,如果膜上Mark清晰,说明转膜没问题。您的问题我觉得在加了化学发光液后的这段时间,您加了滑雪发光液后不要等,马上压片,不要信那些**说明书。您看一下您做过的膜,在条带的位置是不是有黄色的条带痕迹,如果有,肯定是加了化学发光液没有马上压片的问题。
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步骤没啥问题,我们是发光仪发光,所以对压片不是很了解
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黑面在底,换成白面在底,试试
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