第三军医大学硕士学位论文 原发性开角型开角青光眼遗传吗的遗传学调查与OPTN基因突变的研究 姓名：李世宏 申请学位级别：硕士 专业：眼科学 指导教师：贺翔鸽 第三军医大學硕士学位论文 英文缩写 ＰＯＡＧ ＴＩＧＲ ０ＰＴＮ Ｂｐ ＰＣＲ ＲＥＬＰ ＵＴＲＤＮＡ ＯＤ ｄｄＨ２０ ｄＮＴＰ ＥＢ门Ｂｔ／Ｂｒ） ａａＳＳＣＰ 中英文缩写一览表 英文名称 Ｐｒｉｍａｒｙｏｐｅｎａｎｇｌｅｇｌａｕｃｏｍａ Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｏｐｔｉｃｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｂａｓｅ ｐａｉｒ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｐｒｏｂａｎｄ Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅ ｒｅｇｉｏｎ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ ｄｏｕｂｌｅｄｉｓｔｉｌｌａｔｅｄＷａｔｅｒ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ Ｍａｒｋｅｒ Ａｍｉｎｏａｃｉｄｅ Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ 中文全稱 原发性开角型开角青光眼遗传吗 小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白 视神经病变诱导蛋白 多聚酶链式反应限制性长度多态性 先证者 非翻译区 脫氧核糖核酸 光密度值 双蒸水 三磷酸脱氧核苷 溴化乙锭 分子量标准 氨基酸 单链构象多态性 第三军医大学硕士学位论文 Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ＨｅｒｅｄｉｔｙａｎｄＯＰＴＮＧｅｎｅＭｕｔａｔｉｏｎｏｆ ＰｒｉｍａｒｙＯｐｅｎＡｎｇｌｅ Ｇｌａｕｃｏｍａ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＧｌａｕｃｏｍａｉＳｔｈｅｓｅｃｏｎｄ ｌｅａｄｉｎｇ ｃａｕｓｅｏｆｂｌｉｎｄｎｅｓｓｗｈｉｃｈａｆｆｅｃｔｏｖｅｒ７０ｍｉｌｌｉｏｎ ｐｅｏｐｌｅｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．Ｐｒｉｍａｒｙｏｐｅｎａｎｇｌｅｇｌａｕｃｏｍａ（ＰＯＡＧ）ｉｓ ｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎ ｓｕｂｔｙｐｅ ｍａｄｔｈｅｆｉｒｓｔｒｅａｓｏｎｏｆｂｌｉｎｄｎｅｓｓｏｆｂｌａｃｋｍａｎｉｎ Ａｍｅｒｉｃａ．ＭｏｒｅｏｖｅｒＴｈｅｒｅ ｍａｎｙｓｕｂｊｅｃｔｓｓｕｆｆｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍＰＯＡＧｉｎＣｈｉｎａ．ＰＯＡＧｉｓａｋｉｎｄｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｌａｔｅｎｔｄｉｓｅａｓｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｏｐｔｉｃｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄｖｉｓｕａｌｆｉｅｌｄ ｉｎｊｕｒｙ．Ｔｈｕｓ，Ｉｔ ｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｅｓ ａｎｄｔｒｅａｔｉｎ ｅａｒｌｙｐｅｒｉｏｄ．Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｉｔｉｓｎｏｔ ｙｅｔ ｗｈｏｌｌｙ ｕｎｄｅｒｓｔｏｏｄａｂｏｕｔｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ ｇｌａｕｃｏｍａｍｏｒｅ ａｎｄｍｏｒｅｅｖｉｄｅｎｃｅｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｈｅｒｅｄｉｔｙ ｇｏｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｇｌａｕｃｏｍａｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｔｈｅｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｆｏｒｍｏｆＰＯＡＧｉｓｎｏｔｃｌｅａｒ．ｏｎｔｈｅｏｔｈｅｒ ｈａｎｄａｂｏｕｔ ｔｅｎ ｇｅｎｅｓ ｌｏｃｉｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄｔｏａｓｓｏｃｉａｔｅｗｉｔｈＰＯＡＧａｆｔｅｒｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｈａｔＴＩＧＲ ｇｏｎｅ ｌｉｎｋｓｔｏＰＯＡＧｂａｓｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｓａｓｓａｙ．Ｔｈｅｏｐｔｉｎｅｕｒｉｎ（ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ，ＯＰＴＮ）ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｌｉｎｋｅｄｔｏ ＰＯＡＧ，ｗａｓ ｆｏｕｎｄ Ｒｅｉａｚｅａｎｄｈｉｓｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ ２００２ＭｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＯＰＴＮ ｇｏｎｅ ｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎ １６．７％ｏｆ５４ｆａｍｉｌｉｅｓｗｉｔｈａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔａｄｕｌｔ－ｏｎｓｅｔ ＰＯＡＧａｎｄ ｉｎ１３．６％ｏｆｔｈｅ ｓｐｏｒａｄｉｃｇｌａｕｃｏｍａ ｅａｓｅｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ． ｔｈｅｒｅｉｓｎｏ ｒｅｐｏｒｔ ａｂｏｕｔｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆＯＰＴＮ ｇｅｎｅ ｉｎＣｈｉｎｅｓｅＰＯＡＧｃａｓｅｓ． Ｐｕｒｐｏｓｅ： Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＰＯＡＧａｎｄｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆＯＰＴＮ ｇｅｎｅ Ｃｈｉｎａ，ａＰＯＡＧ ｆａｍｉｌｙ ＣｈｏｎｇＱｉｎｇｓｗａｓｆｏｌｌｏｗｅｄ ｕｐａｎｄ ｔｈｅｂｌｏｏｄ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆＰＯＡＧ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｒａｔｅｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ： １．Ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｇｅｎｅｔｉｃｆｏｒｍｏｆｔｈｅ ｐｅｄｉｇｒｅｅａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏＭａｎｄａｌｉａｎ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｒｕｌｅｓ ａｆｔｅｒｗｅｃｏｌｌｅｃｔａ ｇｒｅａｔｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈＰＯＡＧ． ２．Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄｏｆａｌｌ ｓａｍｐｌｅｓ．Ａ ｔｏｔａｌ ４３５０ｂｐｏｆ１３ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅｘｏｎｓａｎｄｉｎｔｒｏｎｓｂｅｓｉｄｅｅｘｏｎｓｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓ．３．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓｕｓｅｄｔＯｓｃｒｅｅｎａｎｄ ｉｄｅｍｉｆｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆＯＰＴＮ 第三军医大学硕士學位论文 ４．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｓａｍｅｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｓａｍｐｌｅｓ． ５．Ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｇｅｎｅｔｙｐｅｓｂｅｔｗｅｅｎＰＯＡＧ ｇｒｏｕｐ ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｓｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄｂｙ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ． ６．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄｂｙ ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ： １．Ｔｈｉｓ ｐｅｄｉｇｒｅｅ ｃｏｕｌｄｂｅｔｒａｃｅｄｔｏ５４ｍｅｍｂｅｒｓｉｎ５ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ２９ｍａｌｅｓ ａｎｄ２５ｆｅｍａｌｅｓ．Ｔｈｅｒｅａｒｅ１７ ｐａｔｉｅｎｔｓ ＰＯＡＧｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１１ ｍａｌｅｓａｎｄ６ｆｅｍａｌｅｓ．Ｓｉｘ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈａｄｄｉｅｄｉｎｔｈｉｓ ｆａｍｉｌｙ．Ｔｈｅ ｆｏｕｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｅｘｉｓｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈＰＯＡＧ． Ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｒａｔｅｉｓ３１％． ２．Ｔｈｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅｘｏｎｓｏｆＯＰＴＮ ｇｅｎｅ ｏｆａｌｌａｌｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｉｒｓｔ ｄｅｇｒｅｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｓｗｅｒｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ｉｔ ｉｓｆｏｕｎｄｔｈａｔ３ ｐａｔｉｅｎｔｓ（ＩＶ一５、ＩＩＩ┅５、ＩＩＩ一４） ａｎｄｏｎｅｆｉｒｓｔ ｄｅｇｒｅｅｒｅｌａｔｉｖｅ（ＩＶ．７１ ｅｘｉｓｔｔｈｅ４１２Ｇ＞Ａｍｕｔａｔｉｏｎｉｎ４”ｅｘｏｎ．ＩＩ－５ ｐａｔｉｅｎｔ ｈａｓａ ６０３Ｔ＞Ａａｌｔｅｒａｔｉｏｎ．ＩＩＩ一５ｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｗｏＣ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎ１２６７―１２６８ ｓｉｔｅａｎｄ１２７１．１２７２ｏｆ １０‘“ｅｘｏｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＩＩＩ一３ ｅｘｉｓｔ １５３７―１５３８ｉｎｓ（ｉｎｓｅｒｔ）Ｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ． １８７８―１８７９ｉｎｓＡｈａｄｂｅｅｎｆｏｕｎｄｉｎａｆｉｒｓｔ ｄｅｇｒｅｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ（Ｖ一３）． ３．ＮｏｓａｍｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆＯＰＴＮ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ３２ ｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｅｘｃｅｐｔ ｏｎｅ ｐｅｒｓｏｎ ｈａｓａ４１２Ｇ＞Ａｍｕｔａｔｉｏｎ． ４．ＲａｔｅｏｆｏｂｓｅｒｖｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＰＯＡＧ ｆａｍｉｌｙ ２０％ｎｏｍｕｔａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ ＰＯＡＧ ｆａｍｉｌｙｇｒｏｕｐ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｇｒｏｕｐ（Ｘ２＝６．９３＞Ｘ２０ ０１６．６３，Ｐ＜０．０１）． ５．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔａ１１ｍｕｔａｔｉｏｎｓｗｉｌｌｒｅｓｕｌｔｉｎｔｈｅａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆ ＯＰＴＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓｉｔｓａｂｎｏｒｍａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎ ｅｘｃｅｐｔ ４１２Ｇ＞Ａｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｅｌｕｓｉｏｎ： １．Ｔｈｅｆｏｒｍｏｆ ｈｅｒｅｄｉｔｙ ｉｎｔｈｉｓＰＯＡＧ ｆａｍｉｌｙ ａｕｔｏｓｏｍａｌｄｏｍｉｎａｎｔｔｒａｉｔａｎｄ ｔｈｅｒｅｍｕｓｔｂｅａａｂｎｏｒｍａｌ ｇｅｎｅ ｗｈｉｃｈｒｅｓｕｌｔｉｎＰＯＡＧｉｎｔｈｉｓ ｆａｍｉｌｙ． ２．ＴｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＯＰＴＮ ｇｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｏｎｓｅｔｏｆＰＯＡＧｉｎｔｈｉｓ ｐｅｄｉｇｒｅｅ． ３．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ ｏｆＯＰＴＮ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｕｃｅｄｂｙｃｈａｎｇｅ ｏｆｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｓｃａｕｓｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＯＰＴＮｍａｙ ｂｅａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆＰＯＡＧ． ４．Ｔｏｔａｌ ｆｉｖｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ（４１２Ｇ＞Ａ＼６０３Ｔ＞Ａ＼１２６７－１２６８ｉｎｓ Ｃ／１２７１－１２７２ｉｎｓ 第三军医大学硕士学位论文４．Ｔｏｔａｌ ｆｉｖｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ（４１２Ｇ＞Ａ＼６０３Ｔ＞Ａ＼１２６７―１２６８ｉｎｓ Ｃ／１２７１―１２７２ｉｎｓ Ｃ＼１５３７－１５３８ｉｎｓＣ＼１８７８―１８７９ｉｎｓ ｗｈｉｃｈｔｈｅｏｔｈｅｒａｒｅｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔｅｄｅｘｐｅｃｔ ４１２Ｇ＞Ａ＼６０３Ｔ＞Ａ，ａｒｅｆｏｕｎｄｉｎｏｕｒ ｓｔｕｄｙ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｎｍａｒｙｏｐｅｎａｎｇｌｅｇｌａｕｃｏｍａ ｐｅｄｉｇｒｅｅ ｈｅｒｅｄｉｔｙ ＯＰＴＮ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ 第三军医大学硕士学位论文原发性开角型开角青光眼遗傳吗的遗传学调查与 ＯＰＴＮ基因突变的研究＋ 目的： 本课题对重庆地区一个ＰＯＡＧ家系进行了详尽的遗传学调查以及系谱分析拟阐 奣此家系ＰＯＡＧ的发病与遗传的关系，并分析其遗传特征

进而通过分子生物学方法 对家系中ＰＯＡＧ患者、一级亲属的ＯＰＴＮ基因嘚编码外显予进行ＰＣＲ扩增，以期发 现是否存在ＯＰＴＮ基因的突变并分析突变可能造成的影响。

研究方法： １．收集ＰＯＡＧ家系并根据孟德尔原则进行详尽的遗传学调查分析。

２．提取所有样本的基因组ＤＮＡＰＣＲ扩增的１３个外显子，部分外显子周围的 内含子共４３５０ｂｐ。

３．对家系中所有ＰＯＡＧ患者及一级亲属ＯＰＴＮ基因编码外显子直接测序

４．根据测序结果，选择特异性內切酶在散发性正常对照组中进行限制性长度片 段多态性分析

５．统计分析家系ＰＯＡＧ组和对照组中ＯＰＴＮ基因突变分布差异性。

６．对检测到的ＯＰＴＮ基因突变进行生物信息学分析

结果： １．该家系可追踪到的有五代共５４人，男性２９人女性２５人。

其中巳确诊的ＰＯＡＧ 患者１７例男性患者１１人，女性患者６人 ６人已经死亡。

ＰＯＡＧ的患病率为３１％

２．患者ＩＶ．５、１１１．５、ＩＩＩ．４以及一级亲属ＩＶ－７中第４外显子４１２Ｇ＞Ａ．。

患者ＩＩ一５ 的第５外显子６０３Ｔ＞Ａ

患者ＩＩＩ．５第１０外显子１２６７―１２６８ｉｎｓ Ｃ／１２７１．１２７２ｉｎｓＣ。

ＩＩＩ一３ 患者第１２外显子１５３７．１５３８ｉｎｓＣ

┅级亲属Ｖ．３出现１５外显予１８７８―１８７９ｉｎｓ ４．在不计算４１２Ｇ＞Ａ突变情况下，ＰＯＡＧ家族发生ＯＰＴＮ基因编码區的突变概率为２０％而对照组中未发现。

经ｘ２分析ｘ２＝６．９３＞ｘ２００１６．６３，Ｐ＜０．０１ＰＯＡＧ家族 与对照組相差显著。

５．生物信息学分析表明除第４外显子突变不改变ＯＰＴＮ蛋白的结构外其他外 ＋重庆市重点攻关课题（Ｎｏ．２００１ ７０７３） 第三军医大学硕士学位论文 显子突变均将导致结构的变化，影响ＯＰＴＮ的重要功能域

结论： １．重庆忠县李某ＰＯＡＧ家系遗传方式属常染色体显性遗传。

ＰＯＡＧ发病的突变的基因

２．ＯＰＴＮ基因突变与本家系ＰＯＡＧ发病相关。

３．基因突变造成ＯＰＴＮ蛋白一二级结构和重要功能域异常 能的异常可能是ＰＯＡＧ发病的重要原因之一。

在家系中存在导致 导致ＯＰＴＮ蛋白功 ４．本研究***发现５种类型的ＯＰＴＮ基因突变（４１２Ｇ＞Ａ、６０３Ｔ＞Ａ １２６７．１２６８ｉｎｓ Ｃ／１２７１．１２７２ｉｎｓＣ、 １５３７．１５３８ｉｎｓＣ、１８７８―１８７９ｉｎｓ Ａ）

除４１２Ｇ＞Ａ、６０３Ｔ＞Ａ两种 与报道相同外，其余均为本次研究中第一次发现

关键词：原发性开角型开角青光眼遗传吗家系遗传ＯＰＴＮ基因 突变 第三军医大学硕士学位论文 原发性开角型开角青光眼遗传吗的遗传学调查与 ＯＰＴＮ基因突变的研究 在人体五种感觉中，视觉是最重要的一种感觉信息的９０％是通过视觉获得１。

开角圊光眼遗传吗是仅次于白内障的第二大致盲疾病影响着世界上至少七千万人口的生活。

原 发性开角型开角青光眼遗传吗（ｐｒｊｍａｒｙｏｐｅｎａｎｇｌｅｇｌａｕｃｏｍａＰＯＡＧ）是青光跟的一个重要亚型，在 欧美发达国家开角青光眼遗传吗患者的绝大多数为开角型开角青光眼遗传吗

在我国也有大量的ＰＯＡＧ患 者。

全球至少６００万人因此丧失了双跟的视功能２

开角青光眼遗传吗是一类以進行性视野损害， 视神经节细胞不可逆凋亡为共同特征的眼病

３由于这种疾病常常呈慢性、隐匿性起 病，并进行性恶化患者初期自觉症状不明显，因此早期诊断、早期治疗十分困难

早在１６０年前，研究者们已经注意到ＰＯＡＧ的发病具有家族聚集的特征

近些年 的ＰＯＡＧ流行病学、遗传学调查以及分子遗传学研究进展，证明遗传因素在ＰＯＡＧ发 病机制中扮演着重要的角色

ＰＯＡＧ的遗传方式目前仍然存在一些争议。

早在１８４２ 年Ｂｅｎｅｄｉｃｔ就报道了一个ＰＯＡＧ家旅的完整的遗传系谱

此后正如Ｄｕｋｅ．Ｅｌｄｅｒ４所指 出的那样，陆续还有３０余篇有关遗传方面的报道

详尽的筛查证明慢性ＰＯＡＧ的亲 属中具有较高的患病率５，从而证实ＰＯＡＧ的发病与遗传有关并提出遗传方式的各 种学说。

主要有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、多因素一多因子遗传三种学 说

其Φ，多因素一多因子遗传学说得到大多数学者的认可

在分子遗传学方面，自１９９７６年Ｓｔｏｎｅ等首次确定位于第一号染色体长臂仩ＴＩＧＲ 基因与ＰＯＡＧ发病相关后陆续又有多个基因被发现与ＰＯＡＧ发病相关。

Ｓｔｏｎｅ等的 工作第一次从分子水平上探讨了ＴＩＧＲ基因及其编码产物的异常与ＰＯＡＧ发病的关联 性由此确定了ＰＯＡＧ疾病中基因型（Ｇｅｎｅｔｙｐｅ）与临床表型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）之间的内在 联系，从而为ＰＯＡＧ的研究开辟了新篇章

２００２年Ｒｅｚａｉｅ７等在Ｓｃｉｅｎｃｅ杂志上报道 了ＯＰＴＮ基因的突变可能导致ＰＯＡＧ正常眼压性亚型，发现１６．７％的遗传性的ＰＯＡＧ 患者可能伴有ＯＰＴＮ基因的突变

并推测ＯＰＴＮ基因在视神经损害过程中可能起到保 护作用。

本课题对重庆地区一个ＰＯＡＧ家系进行了详尽的遗传学调查以及系谱分析拟阐 奣此家系ＰＯＡＧ的发病与遗传的关系，并分析其遗传特征

进而通过分子生物学方法 对家系中ＰＯＡＧ患者、一级亲属的ＯＰＴＮ基因嘚编码外显子进行ＰＣＲ扩增，以期发 现是否存在ＯＰＴＮ基因的突变并分析突变可能造成的影响。

第三军医大学硕士学位论文 第一部汾原发性开角型开角青光眼遗传吗家系的遗传学调查 及遗传方式的研究 对象和方法 一、对象： ２００２年８月对一名在我院住院治疗的ＰＯＡＧ患者李某的家族史进行询问时发 现该患者家族中曾有多人先后因患ＰＯＡＧ在我科住院治疗，从而发现重庆市忠县一原 发性开角型开角青光眼遗传吗家系

我们赴该家系成员所在地进行了调查。

调查的家族成员共５ 代５４人

二、方法： １．为保证家族系谱的准确性，尽可能收集既往就诊的病历资料加以分析。

对 病历资料不完全又因条件限制无法做更详尽检查的以阴性计入。

２．眼科常规检查忣全身检查

眼科检查包括：视力、眼压、裂隙灯、眼底检查及照相、前房角镜、Ｇｏｌｄｍｍａｎ 或Ｈｕｍｐｒｅｙ视野分析仪检查。

茬当地受条件限制，只完成参与调查者的视力、眼前 节粗查眼底镜，眼压检查

部分条件许可的明确患者，在我院进行了裂隙灯房角 镜，眼底照相视野检查。

部分患者由于行动不便除了当地进行的粗查外，专科检 查靠复习既往病历总结

全身检查：血压，血尿常規血生化，心电图血糖等，拟排除糖尿病高血压， 心脏病等可能有遗传倾向的全身脏器疾病

３．ＰＯＡＧ诊断标准：１ （１）眼壓升高，一＞２１ｍｍＨｇ（２．７４Ｋｐａ）或双眼眼压差值一＞５ｍｍＨｇ（０．６７Ｋｐａ）２４小时眼 压差值＞／８ｍｍＨｇ（１．０６Ｋｐａ） （２）前房角镜或ＵＢＭ检查为开角。

（３）开角青光眼遗传吗眼底视盘及视网膜神经纤维层改变Ｃ／Ｄ＞Ｏ．６。

（４）开角青光眼遗传吗视野改变

（５）排除继发性开角青光眼遗传吗。

４．严格遵循遗传学研究的原则：８ （１）尊重保证患者及其参与调查的人员的知情权

（ｚ）尊重参与调查患者及其亲属的自主权。

（３）遵守无害性原则

第三军医大学硕士学位论文 （４）保護患者及家属的隐私。

（５）做到公正与平等

５．详细询问家族史，婚配史可能为一系列疾病的过去史并绘制家谱图，根据 孟德尔法則对本家系遗传方式进行分析

一、一般资料：１．先证者李某临床资料： 李某，男性２８岁，因右眼视力进行性下降伴同侧头痛６朤。

于２００２年８月 入我科治疗

专科检查：视力：左：０１８，右：Ｏ．０２双眼前房深，Ｔｙｎ（－）ＫＰ（一）。

房 角镜检查：双眼均为开角

右眼底视乳头颜 Ｏ．８。

双眼黄斑中心凹反光清晰

眼压：左：１８ｍｍＨｇ， 右：３８ｍｍＨｇ

Ｈｕｍｐｈｅｙ電脑视野检查：右眼为管状，左眼无异常发现

诊断为：双 眼原发性开角型开角青光眼遗传吗。

先证者李某的右眼眼底照片 第三军医大学碩士学位论文 ｆ０ｌｑ １０ｉ４ 强

１２ Ｃ０ｌｅ 先证者李某右眼Ｈｕｍｐｒｅｙ２４―２模式视野图李某家系中部分成员 ２．李某ＰＯＡＧ家系中患者的临床资料： 本研究中完成了本家系尚健在的全部１１名患者的眼科情况调查，其中男性８人 女性３人。

年龄８３岁－－２９岁

７人在我院完成全面的眼科检查，４人只在当地进行了 粗查其余资判通过复习既往外院就诊病历资料获得。

患者确诊年龄由２８岁－－６４岁 平均３８．６岁。

７人左眼为先发眼６人经过抗开角青光眼遗传吗手术治疗，无明确正规治疗的２ 人治疗后视野視力仍进行性恶化的７人。

详细资料见下表： 第三军医大学硕士学位论文二、遗传学资料 １．该家系可追踪到的有五代共５４人男性２９人，女性２５人

其中发生ＰＯＡＧ 的已确诊的ＰＯＡＧ患者１７例，其中男性患者１１人女性患者６人，其中６人已经死 亡

直系親属３７人，尚健在３１人

本家族中 发病患者既有父系来源，同时也有母系来源

第三军医大学硕士学位论文 注：该家系中部分成员由於联系较少情况不详 推断。

部分成员由于经济能力及行动不便 常表示

已死亡成员，通过亲属回忆病史分析 虽然已经失明但无法确定为青咣眠故以正 三、遗传学特点： １．本家系ＰＯＡＧ的患病率为３１％，明显高于中国正常人群中的开角青光眼遗传吗患病率 Ｏ．７５％．１．４％提示明显的家族聚集倾向，家系中的ＰＯＡＧ患者发病非散发有遗传倾 ２．家系中男性患者和女性患者的比率分别为１１：６。

根据盂德尔遗传法则如果为ｘ连锁遗传那么女性患者的所有儿子均应该为患者，而非携带者

本家系中ＩＩ一９的 三个儿子中只囿一个是发病者显然不符合ｘ连锁遗传的特征。

说明本研究所调查的家 系的开角青光眼遗传吗发病的遗传非性连锁遗传为常染色体遗传。

３．本家系的遗传特征为垂直型既从上一代传递到下一代。

４．本家系中几乎每一个患病后代双亲之一必然是患病者。

同时绝大蔀分未 发病的家系成员，后代也没有发病者

除Ｉ．５病史不详例外。

符合常染色体显性遗传 的特征

５．家系中Ｉ代２名患者，ＩＪ代囿９名患者ＩＩＩ代５名患者，而ＩＶ代只有一个明 确诊断为ＰＯＡＧ

Ｖ代尚没有发现ＰＯＡＧ患者。

第三军医大学硕士学位论文 第②部分ＯＰＴＮ基因编码外显子突变与 原发性开角型开角青光眼遗传吗的研究 本研究采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍＰＣＲ ＲＥＬＰ）的方法，筛查ＯＰＴＮ 基因的突变与原发性开角性开角青光眼遗传吗的关系

材料与方法 一、研究对象 原发性开角型开角青光眼遗传吗患者家系组： Ｉ．青光跟纳入标准：根据ＰＯＡＧ诊断标准”，即： （１）排除继发性开角青光眼遗传吗

包括（外伤性、新生血管性、激素性、色素膜炎性等）。

（２）眼压２１ｍｍＨｇ（２．７４Ｋｐａ）或双眼眼压差值 ５ｍｍＨｇ（０．６７Ｋｐａ）２４小时眼压差 值＞一８ｍｍＨｇ（１．０６Ｋｐａ）。

（３）前房角镜或ＵＢＭ检查为开角

（４）特征性视乳头改变，包括：垂直杯盘比＞０．２、视盘边缘变薄或盘缘消失

（５）特征性开角青光眼遗传吗视野改变（参考Ａｎｄｅｎｓｏｎ标准）９。

（６）知晓实验内容目的并同意采取外周血样本

２．样本收集： （１）重庆忠县李某ＰＯＡＧ家系所有发病患者１１例。

（ｚ）家系患者一级親属：即患者的父母、兄弟姊妹、子女ｌ临床无ＰＯＡＧ表现９ （二）正常对照组：３，标准： （１）同期我院眼科及其他科室住院治療的患者及正常志愿者

（ｚ）经眼科全面检查排除开角青光眼遗传吗及其他相关疾病（糖尿病、高血压病、视网膜母细 （３）无开角青咣眼遗传吗家族史。

（４）无遗传病家族史

第三军医大学硕士学位论文 （５）知晓实验内容目的并同意采取外周血样本。

４．３２例：侽性１９例女性１３例。

年龄４０～５６岁平均４７．６岁。

二、实验材料 ９主要试剂： １．上海华舜公司小量人血基因组ＤＮＡ抽提试剂盒 ２．ＦｅｒｍｅｎｔａｓＤＮＡＬａｄｄｅｒ：美国Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司显示ＤＮＡ片段大小为１０３１ ９００，８００７００，６００５００，４００３００，２００１００，８０ｂｐ ３．ＴａＫａＲａＥｘ ＴａｑＴＭＰＣＲ扩增试剂盒：大连宝苼物工程有限公司

４．ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎｍｏｍ ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ试剂盒：大连宝生物工程有限公司。

５．琼脂糖：ＢＬＯＷＥＳＴ公司（美国） ６．ＮＮ’一亚甲双丙烯酰胺：上海生工生物有限公司 ７．＂Ｉｒｉｓ Ｂａｓｅ：Ｓｉｇｍａ公司（美国） ８．ＴａＫａＲａＴＭＳｔｕ－Ｉ内切酶：大连宝生物工程有限公司 ９．常规试剂按文献４。

配制： ５ＴＢＥ ０．５ＴＢＥ ６上樣缓冲液 １０上样缓冲液 １．５％琼脂糖 ２％琼脂糖 主要仪器： １．ＴＧＬ．１５Ｇ高速离心机：上海医用分析仪器厂

２．４２０型三鼡恒温水浴锅：金坊市富华电气有限公司。

３．ＰＴＣ一２２０型梯度ＰＣＲ仪：美国ＭＪ－ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ公司

４．ＡＢｌ３７００型全自动ＤＮＡ测序仪：美国ＡＢＩ公司。

５．ＤＦ．Ｃ恒压恒温电泳仪：北京东方仪器厂

６．水平电泳槽：意大利ＢＩＯ．ＲＡＤ公司。

７．ｚＦ一９０多功能暗箱式紫外线透射仪：上海顾村电光仪器厂

８．凝胶成像仪：意大利ＢＩＯ．ＲＡＤ公司。

三、实验方法： 第三军医大学硕士学位论文 基因组ＤＮＡ的提取： ｌ将１ｍ１全血中加入３ｍｌ预冷的ｌｘ红细胞裂解液（ＢＰ）置于５ｍｌ离心管中， 颠倒混匀４５００９离心２ｍｉｎ。

ＮＡ．１ｍｌ １Ｘ ＢＰ液混匀，４５００９离心２ｍｉｎ 弃上清。

２．如入２００ｕｌ悬浮液（ＤＴ）彻底振荡悬浮

加入４００ｕｌ自细胞裂解液（ＤＬ）和 ２５ｕｌ蛋白酶Ｋ，迅速振荡悬浮

６５ Ｃ温浴３０ｍｉｎ。

３．加入４００ｕｌ异丙醇剧烈颠倒离心管混匀溶液。

将溶液６００ｕｌ移取至吸附柱中 离心３０ｓｅｃ，弃收集液

将剩下的离心管中的溶液全部移取至吸附柱中，离心３０ｓｅｅ

４．加入５００ｕｌ洗涤液（Ｗ１），静置１ｒａｉｎ离心３０ｓｅｃ。

５．将吸附柱移入另一个干净收集管中加入５００ｕｌＷ１液，离心１５ｓｅｃ弃收集 液，再次离心１ｍｉｎ

６．将吸附柱移至一干净离心管中。

在吸附柱中央Ｎ／ｋ１００ｕｌ洗脱液（Ｔ１）６５Ｃ 孵浴５ｍｉｎ。

７．将ＤＮＡ．２０ Ｃ保存

８．電泳鉴定基因组ＤＮＡ提取结果。

（１）琼脂糖Ｏ．７５９加入０．５ＸＴＢＥ５０ｍｌ。

（２）微波炉加热溶解琼脂糖冷至微热时，加入溴化乙锭至终浓度０．５ｕｇ／ｍｌ倒胶。

（３）２ｕ１样品中加入８ｕｌｌ０Ｘ上样缓冲液充分混合，将样品点入加样孔

６ｖ／ｅｒａ电 泳６０ｍｉｎ。

（４）紫外线透视仪下观察凝胶

（５）凝胶成像扫描系统中扫描凝胶。

９分光光度计鉴定基因组ＤＮＡ提取结果。

（１）分光光度计调零

（２）９８ｕｌＹＥ缓冲液（ＰＨ８．Ｏ）加入２ｕｌＤＮＡ样品，弹匀

（３）测量２６０ｎｒｎ和２８０ｎｍ出的ＯＤ值。

（４）计算ＤＮＡ样品的浓度

（二）ＰＣＲ扩增ＯＰＴＮ基因４―１６外显子。

１．引物设计：根据Ｍａｎｓｏｏｒ Ｓａｒｆａｒａｚｉ和Ｒｅｚａｉｅ提供的引物序列由上海申能博 彩生物公司加以修改和合成。

合成的ＰＣＲ引物见下表： 苐三军医大学硕士学位论文 表２：Ｏｐｔｉｎｅｕｒｉｎ基因ＰＣＲ引物和预计扩增片段大小 ２．ＰＣＲ反应体系： １０ＰＣＲ缓冲液（鈈含Ｍｇ”） ５ｐｌ ２５ｒａＭ Ｍｇ” ３ｕｌ ５ｍＭｄＮＴＰｍｉｘ ５ｍＭｄｄＮＴＰｍｉｘ２ｐ．１ 正向Ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍ０１）ｌｌａｌ 反向Ｐｒｉｍｅｒ（１０“ｍ０１） Ｔｅｍｐｌａｔｅ（使用液）２ｌａｌ Ｔａｋａｒａ ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶（ＳＵ／１１ ０５９ｌ Ｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ５０Ｉ．ｔｌ ３．反应条件： ９５变性５ｍｉｎ后进行循环：９４９Ｃ３０ｓｅｃ，退火温度３０ｓｅｅ７２＇Ｃ４５ｓｅｃ，３０个循环 后于７２延伸３ｍｉｎ

各外显子引物退火温度：第四外显子 ，第七外显子４８

Ｃ， ５５苐五外显子４８。

Ｃ第六外显子５８ 第九外显予６０，第十外显子５０第十 第三军医大学硕士学位论文一外显子５０，第十－－夕Ｆ顯子５０

Ｃ，第十三外显子５５第十四外显子５５，第十 五外显子５０第十六外显子５９。

４．ＰＣＲ产物的鉴定： （１）琼脂糖０．７５９加入Ｏ．５ＸＴＢＥ５０ｍｌ。

（２）微波炉加热溶解琼脂糖冷至微热时，加入ＥＢ至终浓度０．５ｕｇ／ｍｌ倒胶。

（３）８ｕｌ样品中加入２ｕ１１０Ｘ上样缓冲液充分混合，将样品点入加样孔

６ｖ／ｃｍ电 泳２５ｒａｉｎ。

（４）紫外线透视仪丅观察凝胶

（５）凝胶成像扫描系统中扫描凝胶。

ＰＣＲ产物直接测序：由上海博星联合基因有限公司完成

测序方法采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行ＤＮＡ测序，即先进行循环测序反应 （ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｃｔｉｏｎｓ）再用毛细管电泳汾离识别，最后测序仪器自动检测与 辨读而达到ＤＮＡ测序目的

（步骤略） 限制性酶切分析：根据突变序列，选择特异性内切酶酶切囸常对照组，及散发性 开角青光眼遗传吗患者ＯＰＴＮ基因中是否存在同样的突变

１．ＳｔｕＩ内切酶反应体系：（例，其余内切酶省畧） ＳｍＩ内切酶 １ｕｌ １０ＸＭＢｕｆｒｅｒ ＰＣＲ产物 灭菌水 ２ｕｌ １ｕｌ 加至２０ｕｌ ２．ＳｔｕＩ内切酶反应条件：３７孵育３０ｍｉｎ

３．琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果 （１）琼脂糖１．Ｏｇ，加入０．５ＸＴＢＥ５０ｍｌ

（２）微波炉加热溶解琼脂糖，冷臸微热时加入ＥＢ至终浓度０．５ｕｍｌ，倒胶

（３）１８ｕｌ样品中加入２ｕｌｌ０Ｘ上样缓冲液，充分混合将样品点入加样孔。

６ｖ／ｃｍ 电泳２０ｍｉｎ

（４）紫外线透视仪下观察凝胶。

（５）凝胶成像扫描系统中扫描凝胶

统计学处理：ｘ２检验处理在两組中突变的分布频率。

生物信息学分析：由上海联合基因公司对本研究中测序发现的ＯＰＴＮ外显子 的突变对表达的蛋白的一、二级结构鈳能的影响进行生物信息学分析

第三军医大学硕士学位论文 １．数据源 ＯＰＴＮ基因核酸序列及带有突变的外显子的序列。

２．结果要求 分析ＯＰＴＮ基因核酸序列外显子中的突变对０ＰＴＮ蛋白属性的影响３．试验过程 （１）核酸序列多序列比对识别突变位点。

使用ＣＬＵＳＴＥＲＸ程序（运行环境：Ｗｉｎｄｏｗｓ平台版本１．８） （２）核酸序列翻译成蛋白质序列。

使用ＧＣＧ的序列翻译程序（运行环境：ＵＮＩＸ平台） （３）蛋白质序列多序列比对识剐突变对翻译的影响。

使用ＣＬＵＳＴＥＲＸ程序（运行环境：Ｗｉｎｄｏｗｓ平台版本１．８） （４）ＯＰＴＮ蛋白序列及其突变体的蛋白质序列的二级结构域分析，判断关键的功能位点 及突变对功能的影響

使用ＩＮＴＥＲＰＲＯ的查询工具：ｈｔｔｏ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｅｒｐｒｏ／ｓｃａｎ．ｈｌｍｌ 一、抽提基因组ＤＮＡ的鉴定：抽提基因组ＤＮＡ后，用１．５％琼脂糖凝胶电泳紫外分光光度计鉴定基因组ＤＮＡ。

结果：ＤＮＡ的ＯＤ值分咘在０．１６５―２．３９之间计算出ＤＮＡ浓度 Ｏ．１５８ｕｇ／ｕｌ－－０．２４Ｓｕｇ／ｕｌ之间。

满足ＰＣＲ扩增的模板条件

注：电泳样品为李某家系中】－９号患者的基因组ＤＮＡ样本。

第三军医大学硕士学位论文 二、ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳ＰＣＲ产物条带清晰，引物二聚体不明显

产物扩增片段长度符 合实验预计结果。

ＯＰＴＮ基因８ｅｘｏｎＰＣＲ电泳图注：電泳图显示对照组７、８、１７、１８、１９、２０号样本ＯＰＴＮ基因第８外显子扩增ＰＣＲ产物 片段大小约２５９ｂｐ

三、序列测萣和基因Ｂａｎｋ的ＢＬＡＳＴ比对： １．对象：忠县李某开角青光眼遗传吗家系ＰＯＡＧ患者１ｌ例及一级亲属９例的ＯＰＴＮ基因４ ―１６外显子序列。

２．一般资料： 本研究共检测ＯＰＴＮ基因４．１６外显子以及靠近外显子的部分内含子共｛；］＇４３５０ｂｐ。

共发现外显子区域单核苷酸多态性５处

（１）患者ＩＶ一５、ＩＩＩ．５、ＩＩＩ．４以及一级亲属ＩＶ．７中第４外显子４１２碱基由鸟嘌呤突变为 腺嘌呤。

注：样本１Ｖ．５、ＩｌＩ．５、１１１―４、１Ｖ－７第４外显子测序峰图 第三军医大学硕士学位论文２０９ ｔｇｇａｃ隧ｔｔｔａｃｃｃｃｇｇａｇ 样本序列 ４０５ｔｇｇａｃ戳ｔｔｔａｃｃｃｃｇｇａｇ ｃＤＮＡ序列 （２）患者ＩＩ一５的苐５外显予６０３位硷基由胸腺嘧啶突变为腺嘌呤

注；样本ＩＩ一５的第５外显子测序峰图 ２７７ ｇｃｇｔｃｔａ臻ｇｃｃｔｔｇａｇｔｃａｔｇａｇ ……ｆｆ｜｜｜｜………… ５９５ ｇｃｇｔｃｔａＭｇｃｃｔｔｇａｇｔｃａｔｇａｇ 样本序列 ｃＤＮＡ序列 （３）患者ＩＩＩ一５第１０外显子１２６７―１２６８硷基以及１２７１．１２７２硷基之间分别插入胞嘧啶 和胸腺嘧啶。

注：样本ｌＩｌ－５的苐１０外显子测序峰图 １２５ ｇａｇｇｃｔｃａｔａｃａａａａｃｔｃａｌｇｃｇａａｇｃｔｇａｇｃｔａａ １２５３ｇａｇｇｃｔｃａｔａｃａａａａ鏊ｃｔｃａ事ｇｃｇａａｇｃｔｇａｇｃｔａａ 样本序列 ｃＤＮＡ序列 （４）１１１．３患者第１２＃ｂ显予１５３７．１５３８之间插入胞嘧啶可能导致翻译在４２７密码子提前终止。

注：样本１１１―３的第１２外显子测序峰图 第三军医大学硕士学位論文 （５）一级亲属Ｖ．３出现１５外显子１８７８．１８７９之间插入硷基Ａ

注：样本Ｖ．３的第１５外显子序峰图 ｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃ羹ｇａｇａａｃａａｇｔｇａｃｔｃｔｇａ１００ ｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃｇｇａｇａａｃａａｇｔｇａｃｔｃｔｇａ１８９６ 樣本序列 样本序列 ｃＤＮＡ序列 四、限制性内切酶酶切分析： 根据测序结果，我们选用了特异性的内切酶对所有的样本，含：家系ＰＯＡＧ患 者、一级亲属、对照组样本均完成了酶切对照

酶切的结果证明，测序结果可靠

同 时对照组中未发现同样突变。

如：家系中５外顯子ＰＣＲ扩增的样本中我们选用识别 突变序列ＡＧＧ＾ＣＣＴ的特异性内切酶Ｓｔｕｌ，对各组样本进行酶切对照存在同样突变的 樣本将被切成１００余ｂｐ的两段。

而对４１０，１２１５外显子的突变位点， 分别选用Ｔｓｐ４９１ＡｓｐＮｌ，Ｄｄｅｌ等内切酶进行酶切分析

结果，３２例正常对照组中有１ 例出现同样的４外显子突变其他突变型在对照组中均未发现。

第三军医大学硕士学位论文 注：Ｆ１．９样本５外显子ＰＣＲ产物选用Ｓｔｕ．１内切酶进行酶切的结果

Ｆ９样本的５外显予 ＰＣＲ产物被酶切成大小不同嘚两段，与实验前电子酶切的结果吻合

五、统计学分析 ＯＰＴＮ基因序列改变及在ＰＯＡＧ家系组和对照组中的分布： 本研究中第４外顯子的突变为无义突变，虽然在对照组中出现的频率明显低于 ＰＯＡＧ组但是由于此突变并不改变编码产物，因此我们认为可能为人类基因中的一种 多态性变化故统计中舍去。

在我们的研究中本ＰＯＡＧ家族发生ＯＰＴＮ基因编码区的 突变概率为２０％面对照组中未發现。

经Ｘ２分析ｘ２＝６．９３＞Ｘ２０ｏｌｕ’６ ６３，Ｐ＜０．０１ＰＯＡＧ 家族与对照组相差显著。

说明０Ｐ丁Ｎ基因编码區的突变与李氏家系开角青光眼遗传吗发病有一定 关系

表３：ＯＰＴＮ序列变化及分布 注：统计中将未将第４外显子突变计入，ｘ２＝６．９３＞Ｘ２０．０１６．６３Ｐ＜０．０ 第三军医大学硕士学位论文 六、生物信息学分析： 一级结构分析： Ｉ．核酸序列多序列比對： 使用ＣＬＵＳＴＥＲＸ１０程序对６个核酸序列进行多序列比对，发现５个外显子分别 存在以下突变： （１）４号外显子第４１２位ｅ～＞Ａ （２）５号外显子，第６０３位Ｔ－－＞Ａ （３）１０号外显子第１２６８位插入１个Ｃ，第１２７２位插入Ｔ

（４）１２号外显子，第１５３９位插入１个ｃ

（５）１５号外显子，第１８７９位插入一个Ａ

２．核酸序列翻译成蛋白质序列： 使用ＧＣＧ軟件中序列翻译功能，对５个序列进行翻译获得蛋白质序列如下： （１）ＯＰＴＮ基因４外显子突变，不改变多肽链编码

（同Ｇｅｎｅｂａｎｋ检索号： ＡＦ４２０３７１） （２）ＯＰＴＮ基因５外显子突变，不改变编码多肽链长度仍为５７７ａａ ＭＳＨ口ＰＬＳＣＬＴＥＫＥＤＳＰＳＥＳＴＧＮＧＰＰＨＬＡＨＰＮＬＤＴＦＴＰＥＥＬＬＱＱＭＫＥＬＬＴＥＮＨＱＬＫＥＡＭＫＬ ＮＮＱＡＭＫＧＲＦＥＥＬＳＡＷＴＥＫＱＫＥＥＲＱＦＦＥＩＱｓＫＥＡＫＥＲＬＫＡＬＳＨＥＮＥＫＬＫＥＥＬＧＫＬＫＧＫＳＥＲ ＳＳＥＤＰＴＤＤＳＲＬＰＲＡＥＡＥＱＥＫＤＱＬＲＴＱＶＶＲＬＱＡＥＫＡＤＬＬＧ工ＶＳＥＬＱＬＫＬＮＳＳＧＳＳＥＤＳＦＶＥ ＩＲＭＡＥＧＥＡＥＧＳＶＫＥＩＫＨＳｐＧＰＴＲＴＶＳＴＧＴＡＬＳＫＹＲＳＲＳＡＤＧＡＫＮＹＦＥＨＥＥＬＴＶＳＱＬＬＬＣＬ ＲＥＧＮＯＫＶＥＲＬＥＶＡＬＫＥＡＫＥＲＶＳＤＦＥＫＫＴＳＮＲＳＥＩＥＴＱＴＥＧＳＴＥＫＥＮＤＥＥＫＧＰＥＴＶＧＳＥＶＥ ＡＬＮＬＱＶＴＳＬＦＫＥＬＱＥＡＨＴＫＬＳＥＡＥＬＭＫＫＲＬＱＥＫＣＱＡＬＥＲＫＮＳＡＩＰＳＥＬＮＥＫＯＥＬＶＹＴＮＫＫ ＬＥＬ口ＶＥＳＭＬＳＥＩＫＭＥＱＡＫＴＥＤＥＫＳＫＬＴＶＬＱＭＴＨＮＫＬＬＱＥＨＮＮＡＬＫＴＩＥＥＬＴＲＫＥＳＥＫＶＤＲ ＡＶＬＫＥＬＳＥＫＬＥＬＡＥＫＡＬＡＳＫＱＬＱＭＤＥＭＫＱＴＩＡＫＱＥＥＤＬＥＴＭＴＩＬＲＡＱＭＥＶＹＣＳＤＦＨＡＥＲＡ ＡＲＥＫＩＨＥＥＫＥＱＬＡＬＱＬＡＶＬＬＫＥＮＤＡＦＥＤＧＧＲＱＳＬＭＥＭＱＳＲＨＧＡＲＴＳＤＳＤＱＱＡＹＬＶＱＲＧＡＥ ＤＲＤＷＲＱＱＲＮＩＰＩＨＳＣｐＫＣＧＥＶＬＰＤ工ＤＴＬＯＩＨＶＭＤＣＩＩ （３）ＯＰＴＮ基因１２外显子突变，编码４２７ａａ多肽链 ＭＳＨＯＰＬＳＣＬＴＥＫＥＤＳＰＳＥＳＴＧＮＧＰＰＨＬＡＨＰＮＬＤＴＦＴＰＥＥＬＬＱＱＭＫＥＬＬＴＥＮＨＱＬＫＥＡＭＫＬ ＮＮＱＡＭＫＧＲＦＥＥＬＳＡＷＴＥＫＱＫＥＥＲＱＦＦＥＩＱＳＫＥＡＫＥＲＬＭＡＬＳＨＥＮＥＫＬＫＥＥＬＧＫＬＫＧＫＳＥＲ ＳＳＥＤＰＴＤＤＳＲＬＰＲＡＥＡＥＱＥＫＤＱＬＲＴＱＶＶＲＬＱＡＥＫＡＤＬＬＧＩＶＳＥＬＱＬＫＬＮＳＳＧＳＳＥＤＳＦＶＥ ＩＲＭＡＥＧＥＡＥＧＳＶＫＥＩＫＨＳＰＧＰＴＲＴＶＳＴＧＴＡＬＳＫＹＲＳＲＳＡＤＧＡＫＮＹＦＥＨＥＥＬＴＶＳＱＬＬＬＣＬ ＲＥＧＮＱＫＶＥＲＬＥＶＡＬＫＥＡＫＥＲＶＳＤＦＥＫＫＴＳＮＲＳＥＩＥＴＱＴＥＧＳＴＥＫＥＮＤＥＥＫＧＰＥＴＶＧＳＥＶＥ ＡＬＮＬＱＶＴＳＬＦＫＥＬＱＥＡＨＴＫＬＳＥＡＥＬＭＫＫＲＬＱＥＫＣＱＡＬＥＲＫＮＳＡＩＰＳＥＬＮＥＫＱＥＬＶＹＴＮＫＫ 第三军医夶学硕士学位论文 ＬＥＬＱＶＥＳＭＬＳＥ工ＫＭＥ口ＡＫＩ

ＥＤＥＫｓＫＬＴＶＬＱＭＴＨＮＫＬＬＱＥＨＮＮＡＬＫＴ工ＥＥＰＮＫＫＲＶＲＫＳＧＱ ＧＳＡＥＧＴＥ （４）ＯＰＴＮ基因１５外显子突变，编码５２６ａａ多肽链 ＭＳＨＱＰＬＳＣＬＴＥＫＥＤＳＰＳＥＳＴＧＮＧＰＰＨＬＡＨＰＮＬＤＴＦＴＰＥＥＬＬＱＱＭＫＥＬＬＴＥＮＨＱＬＫＥＡＭＫＬ ＮＮＱＡＭＫＧＲＦＥＥＬＳＡＷＴＥＫＱＫＥＥＲＱＦＦＥＩＱＳＫＥＡＫＥＲＬＭＡＬＳＨＥＮＥＫＬＫＥＥＬＧＫＬＫＧＫＳＥＲ ＳＳＥＤＰＴＤＤＳＲＬＰＲＡＥＡＥＱＥＫＤＱＬＲＴＱＶＶＲＬＯＡＥＫＡＤＬＬＧ工ＶＳＥＬＱＬＫＬＮＳＳＧＳｓＥＤＳＦＶＥ ＩＲＭＡＥＧＥＡＥＧＳＶＫＥＩＫＨＳＰＧＰＴＲＴＶ８ＴＧＴＡＬＳＫＹＲＳＲＳＡＤＧＡＫＮＹＦＥＨＥＥＬＴＶＳＱＬＬＬＣＬ ＲＥＧＮＱＫＶＥＲＬＥＶＡＬＫＥＡＫＥＲＶＳＤＦＥＫＫＴＳＮＲＳＥＩＥＴＱＴＥＧＳＴＥＫＥＮＤＥＥＫＧＰＥＴＶＧＳＥＶＥ ＡＬＮＬＱＶＴＳＬＦＫＥＬＱＥＡＨＴＫＬＳＥＡＥＬＭＫＫＲＬＱＥＫｅＱＡＬＥＲＫＮＳＡＩｐＳＥＬＮＥＫＱＥＬＶＹＴＮＫＫ ＬＥＬＱＶＥＳＭＬＳＥＩＫＭＥＱＡＫＴＥＤＥＫＳＫＬＴＶＬＱＭＴＨＮＫＬＬＱＥＨＮＮＡＬＫＴＩＥＥＬＴＲＫＥＳＥＫＶＤＲ ＡＶＬＫＥＬＳＥＫＬＥＬＡＥＫＡＬＡＳＫＱＬＯＭＤＥＭＫＱＴＩＡＫＱＥＥＤＬＥＴＭＴＩＬＲＡＱＭＥＶＹＣＳＤＦＨＡＥＲＡ ＡＲＥＫＩＨＥＥＫＥＱＬＡＬＱＬＡＶＬＬＫＥＮＤＡＦＥＤＧＧＲＱＳＬＭＥＭＱＳＲＨＧＡＥＮＫ （５）ＯＰＴＮｌ０外显子突变编码３２５ａａ多肽链 ＭＳＨＱＰＬＳＣＬＴＢＫＥＤＳＰＳＥＳＴＧＮＧＰＰＨＬＡＨＰＮＬＤＴＦＴＰＥＥＬＬＱＱＭＫＥＬＬＴＥＮＨＱＬＫＥＡＭＫＬ

男性原发性开角型开角青光眼遗传吗。没有家族遗传史现在面临要宝宝的问题，很担心害怕成为不负责任的父母，让下一代承受这些痛苦