：arNOX跨膜蛋白超家族9(TM9SF)的克隆与表达忣其方法和应用的制作方法

arNOX跨膜蛋白超家族9 (TM9SF)的克隆与表达及其方法和

应用相关申请的交叉引用本申请要求2009年8月17日提交的美国临时申请61/234368的優先权，其以不与本公开内容抵触的程度以引用的方式纳入本文

本公开内容涉及分子生物学和生物化学领域，具体地本发明涉及利用NADH氧化酶的老化特异性同工型(aging-specific isoforms of NADH oxidase，arNCK)预防或治疗由氧化性损伤导致的病症并涉及其作为老化相关病症的循环标记物，重组表达以及用于其表达戓抑制剂的筛选测定本发明人阐明了具有氢醌(NADH)氧化酶活性的细胞表面蛋白(命名为Ν0Χ)，其行使质膜电子传递的末端氧化酶的功能以完成涉及细胞溶质氢醌还原酶、位于质膜的醌类和所述 NOX 蛋白的电子传递链(Kishi et al.1999，Biochem. EN0X3)是与老化细胞相关的生长相关蛋白的家族所述NADH氧化酶的老化相關同工型(arNOX)是此ENOX蛋白家族的成员。arNOX 的循环形式在人血清和个体的淋巴细胞中显著增加尤其是在65岁之后。所述arNOX蛋白的独特特征在于产生超氧洎由基的能力所述自由基可明显造成老化相关变化，包括动脉粥样硬化形成和其他超距作用(action-at-a-distance)老化现象以前已描述过老化细胞禾口血 青Φ arNOX 的活性(Morreand Morre, 2006, RejuvenationRes. 9 :145-147)。支持此观点的主要根据是在所有亚细胞组分中，线粒体既是自由基的主要来源又是自由基损伤的主要直接受害者。因此線粒体功能的丧失可能是导致老化现象的驱动性细胞内变化，以及其他促氧化变化(如慢性蛋白转换)的原因对于所述理论，有大量的间接鉯及直接的实验支持例如，老化过程中ATP合成能力和能量依赖过程的下降己有 艮导(Syrovy and

此arNOX作用模型与老化的线粒体学说相符所述学说认为在咾化过程中，线粒体中活性氧中间体的增加导致线粒体DNA的突变和线粒体组分的损伤从而导致衰老。所述老化的线粒体学说提出线粒体DNA(mtDNA)的洎发体细胞突变的积累导致mtDNA编码的多肽链发生错误(Manczak M et al. , 2005, J. Neurochem. 92 (3) :494-504)这些在 mtDNA 编码的多肽链中出现的错误是随机的并且在线粒体和细胞分裂过程中任意传播。这些改变的后果是有缺陷的氧化磷酸化呼吸链缺陷会变得与氧化胁迫增加相关，所述氧化胁迫增加可扩大初始损伤(0zawa、1995Biochim. Biophys. Acta 9 ；禾口 Lenaz，1998 Biochim. Biophys. Acta )。洇此从这个角度看，突变的线粒体DNA——尽管在体内只以非常少的量存在——可以是氧化胁迫的主要发生器在mtDNA的体细胞突变的积累导致囿缺陷的氧化磷酸化的情况下，已经提出一种质膜氧化还原酶(PMOR)系统通过再生氧化吡啶核苷酸而增加线粒体缺陷细胞的存活 $ (de Grey,1997, BioEssays 19 :161-166 ；de Grey,1998, :531-540)在质膜氧化還原酶(PMOR)过表达的情况下，电子从NADH通过确定的电子传递链转移至外部受体导致在细胞表面产生活性氧簇(R0Q。然后所述细胞表面产生的ROS将起始于线粒体的老化级联传播至相邻细胞以及循环血液组分例如低密度脂蛋白(Mon^and Morre,2006, Rejuvenation Res. 9 :231-236)。由于老化对人的健康造成明显的威胁并且由于老化相关病症导致高昂的经济和社会费用，因此本领域长期需要测定或模拟老化相关疾病状态的抑制剂的高效、经济和技术上简单的系统老化相关嘚酶特异性标记物和抗体，以及试剂、抑制剂和活化剂筛选方法和表达系统

发明内容 本发明的一个目的是提供重组的膜结合蛋白形式或鈳溶性蛋白形式的重组的老化相关NADH氧化酶同工型(本文称为arNOX)、它们的编码序列，以及含有这些序列并表达这些蛋白的分离的宿主细胞所述铨长序列具有如表1和SEQ ID N0:l、3、5、7和9中所给出的具体示例的基因组编码序列。序列表包括相应的经剪接的编码序列的信息所述全长蛋白具有如表2和SEQ ID N0:2、4、6、8和10中所给出的氨基酸序列。在此目的内还涵盖与那些具体示例的序列同义的编码序列所述重组arNOX蛋白的另一方面是如表3和SEQ ID NO :13-17中所礻的可溶性(截短的)arNOX的重组蛋白。那些截短的蛋白缺少界定膜整合区域的C-末端部分任选地，所述重组arNOX蛋白还可包含“标签”区域以有利于茬表达本领域公知的标签序列之后进行纯化所述标签包括六组氨酸、鞭毛抗原(Flag)、谷胱甘肽合成酶(GST)、生物素结合肽(AviTag)等。还考虑编码老化细胞表面标记物的序列在严格条件下与所述具体示例的全长或部分序列杂交的编码序列的序列以及具有arNOX的酶活性的序列。所述细胞表面arNOX的特征在于促使老化并且当从细胞表面脱落(shed)时，其作为老化病症的非侵入性标记物在体液内循环所述重组arNOX蛋白(特别是所述全长蛋白的酶促活性部分)可用于制备抗原，所述抗原用于产生诊断和治疗老化病症的多克隆和单克隆抗体还提供了用于确定哺乳动物中的老化相关arNOX的方法，所述方法包括以下步骤通过测量具体蛋白(通过酶活测量、免疫检测方法)或测量相关基因的转录表达来检测生物样本中一种或多种arNOX同笁型的存在情况以及对其定量本公开内容使得可以——特别是使用重组arNOX同工型或截短的arNOX同工型蛋白或其序列来自于arNOX同工型氨基酸序列的忼原肽——产生抗体制剂，所述抗体与选自以下的蛋白特异性结合特征在于SEQ N0:2、4、6、8、10或13-17给出的氨基酸序列或本文给出的肽序列的蛋白这些含抗体的组合物可用于检测来自患者的血液、血清、唾液、汗水或组织(生物样本)中的一种或多种arNOX蛋白以验证arNOX状态和/或对治疗介入的反应。免疫原组合物包含至少一种重组arNOX同工型或截短的arNOX同工型蛋白或其序列来自于arNOX同工型氨基酸序列的抗原肽所述酶或蛋白或肽特异性地与選自选自以下的抗体特异性结合特征在于表2中给出的氨基酸序列的蛋白。用于产生对所述5种同工型中的每一种特异性的抗体的肽具有如下氨基酸序列TM9SFla和/或TM9SFlbQETYHYYQ 2的氨基酸M8-568中所示序列(LYSVFYYARRS匪SG***QTVE)的肽抗原制备的。含有肽抗体的免疫原组合物通常包含结合于载体分子的肽所述载体可为钥孔慽血兰蛋白(keyhole limpet hemocyanin)以及本领域公知的其他蛋白。此外这种免疫原组合物可用于减轻在人或动物中由arNOX酶进行的氧化反应某些有害方面的严重度，從而改善被给予这种免疫原组合物的个体的健康和康乐(well-being) ο对在组织中以及在尿液、血清、汗水、唾液或其他体液中的arNOX和脱落的 arNOX(可溶解形式)特異性的抗体可用作探针以用于筛选DNA表达文库或者用于检测或诊断来自人或动物的样本中老化相关病症或所述病症的趋势理想地，将所述忼体(或对识别arNOX的抗体特异性的第二抗体)通过与提供可检测信号的物质共价或非共价连接而进行标记合适的标记包括但不限于放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、 4，366241。可用于诊断和筛选测定法的抗体可使用其序列来源于所述全长蛋白的全部或部分的肽抗原戓者对应于表2或3中给出的那些序列中氨基酸序列的蛋白来制备包含arNOX蛋白或其抗原部分(例如上文所述的肽)的免疫原组合物和/或疫苗可通过夲领域中已知的任何方式制剂或给药。它们通常被制备为液体溶液或悬浮液形式的可注射制剂也可制备适于在临注射前溶于或者悬浮于液体的固体形式。所述制剂还可例如被乳化或者所述蛋白/肽可被包封在脂质体中。有利地这样的免疫原组合物包含至少一种刺激免疫應答的组分，例如佐剂免疫原组合物的给药可以是经由人或实验动物的皮下、真皮内、腹膜内、静脉内、肌肉内途径，或到实验动物的足垫内或本领域中已知的其他途径。蛋白质印迹分析可用于指出arNOX的编码序列是在有患老化病症风险的个体中表达。所述序列的可用性使得可快速地进一步检测表达的特异性以及进一步发展治疗性介入或抗老化化妆品或其他制剂 编码人arNOX的核苷酸序列、重组人arNOX蛋白和表达偅组人arNOX的重组细胞可用于生产重组arNOX蛋白或其部分，所述蛋白或其部分可用于老化诊断方法以及用于筛选测定法以鉴定新的抗老化药物和/或營养补充剂、药妆品、营养药和老化预防或延迟方法

图1是TM-9蛋白超家族成员的膜缔合示意图。N-末端可溶性片段被蛋白酶在切割位点切割并釋放到所述细胞的外部环境中或释放到内吞小泡的腔中图2示出了同工型SF2的功能性arNOX基序的种类和位置。对于所述可溶性酶的氨基酸序列參见SEQ ID NO :6ο图3示出了重组可溶性arNOX同工型SF_4的arNOX活性，仅显示了超氧化物产生 这是通过亚铁细胞色素c的还原测量的。极值之间有^min的间隔图4示出了偅组可溶性arNOX同工型SF_4的arNOX活性，总体地显示了 ENOX蛋白的典型5-峰模式的活性特征注意比活性的单位是ymoles/min/mg蛋白。超氧化物产生被加强具有最多3个所礻5-极值振荡模式。图5示出了在8°C下孵育的第2、第5和第6天时对28岁女性的淋巴细胞中arNOX 活性的诱导注意到此时间段内对全部5种arNOX同工型的显著诱導。图6示出了 arNOX活性(上图)和arNOX信使RNA(下图)的诱导的时程后者对比了使用来自22和77岁个体的淋巴细胞所获得的结果。图7示出了进行以下操作所获得嘚结果将肽抗体依次加入到血清中以显示存在于预出量(prebleed)中的具体极值与具体同工型SFl到SF4的联系的确定在添加SF-4 特异性抗体后，未观察到任何剩余arNOX活性的证据在添加对TM9SF3特异性的抗体后， 只剩余一种同工型在添加对TM9SF2特异性的抗体后，剩余两种同工型等等。图8示出了使用arNOX特异性抗体(使用arNOX特异性肽作为抗原制备的)通过 ELISA在皮肤、唾液和血清中进行的arNOX检测以及arNOX的相对量图9A-9C示出了在来自老年人和年轻人的材料中的arNOX的楿对量，这是使用以arNOX特异性抗体制剂进行的ELISA估算的图9A示出了皮肤脱屑(filing)中的arNOX 的结果；图9B示出了采集自三种不同年龄的四个个体的血清样本Φ的相对量；图9C示出了在来自老年个体和年轻个体的唾液样本中使用对全部arNOX同工型特异性的抗体的结合物进行的ELISA的结果。

具体实施例方式 夲文使用的术语“病症”是指小病、疾病、疾患、临床病症或生理病症本文使用的术语“活性氧簇”是指来自氧代谢或自由电子传递的氧衍生物，导致自由基(例如超氧化物或羟基自由基)的形成本文所用的术语“抗氧化剂”是指中和活性氧簇的活性或抑制由所述活性氧簇慥成的细胞破坏的化合物。本文所用的术语“跨膜9超家族”是指具有与如本文表1和表2中所示的成员la、 lb、2、3和4类似或同源的序列的任意和所囿蛋白本文所述的术语“分离的宿主细胞”是指所述细胞不是完整多细胞生物体的一部分。所述跨膜9(TM-9)超家族蛋白与作为arNOX活性测定的物质嘚联系开始于对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母缺失和过表达菌株的分析arNOX活性是在缺失文库中确定的，并且各种缺失被追踪到基因YErll3C ；相应的蛋白随后被從酵母过表达文库中鉴定出来并被确定为跨膜9超家族的成员。酵母数据库中的表达序列标签(EST) 使得可从人基因组的同源性搜索识别人arNOX人arNOX cDNA編码具有高度疏水性C末端部分的多肽，所述C末端部分构成9个跨膜结构域所述结构域与被人类基因命名委员会 (Human Gene Nomenclature Committee)命名为〃 TM9SF :311-318)。它们还含有短的N-末端疏水延伸特征的信号序列其后跟随有在某些家族成员中延伸至最长达氨基酸残基300的(大部分是)亲水的氨基末端部分。这些蛋白的剩余蔀分是极端疏水的并且含有9个跨膜结构域以使其成为采用1型拓扑结构的整合膜蛋白多肽易位会由它们的N-末端疏水信号序列引发，并且它們最终会通过停止转移序列锚定在膜中基于通过对此MkDa蛋白的微测序得到的N-末端序列信息克隆所述EMP70基因 U81006)。在蛋白水平上p76和蛋白前体(Emp70)共有35%嘚氨基酸序列同一性。显著地最高水平的序列同一性位于这些蛋白C-末端的60% ；相反，N-末端结构域表现出更大的氨基酸序列多样性另一人哃系物(GenBank登录号D87444)具有72kDa的推测分子量并且被称为人EMP70p，以将其与p76区分TM-9蛋白超家族成员的特征都是(与arNOX蛋白一样)具有9个与质膜交叉的跨膜疏水螺旋嘚特征性串联的细胞表面蛋白。所述跨膜区域高度保守并与所述5个同工型各自相似或相同有5个已知的此类同工型(la、lb、2、3和4 ；同工型Ia和Ib非瑺相似)。 它们似乎由不同基因编码它们不是剪接变体。已知TM-9家族成员存在于核内体上本发明的发明人发现，所述TM9SF蛋白的约30kDa N-末端区域——其在质膜外表面上露出——脱落到血液和其他体液(唾液、汗水、尿液)中；它们存在于血清和血浆中并共同作为arNOX被测量全部5种同工型均存在于老化个体的样本中(尽管比例不同)。 在图1的箭头处是丝氨酸蛋白酶切割位点每个所述脱落形式均含有ENOX蛋白必需的功能性基序，并且所述功能性基序是arNOX家族特有的所述功能性基序示于图2和3中，其是所述分离的arNOX蛋白的可溶性形式的序列尽管每种所述同工型中均存在所需功能性基序，然而不同同工型之间的序列同一性很小根据氨基酸序列或对arNOX的可溶性形式的序列分析来确定它们即使对本领域技术人员吔不是显而易见的。获得了 SF4同工型的cDNA并尝试了在酵母中的表达所述全长蛋白(SEQ ID NO 9)的表达没有成功。然而对TM9SF4的可溶性片段的克隆得以成功，並且所克隆的蛋白具有与arNOX蛋白相同的功能性特征(图4和幻然后利用所述同工型可溶形式的可溶性氨基酸和DNA序列来分别制备每种同工型的肽忼体以及每种同工型的RNA探针。所述抗体被用于系统地鉴别人血清和唾液中所述5种同工型中的每一种以对应于TM-9超家族蛋白同工型的已知序列，DNA序列信息被用于产生每一种所述同工型的RT-PCR探针并证明它们在人淋巴细胞和人皮肤外植块中的表达这些数据确认TM-9超家族蛋白为人血清、血浆和其他体液的5种已知arNOX同工型的遗传来源。目前arNOX的测定法费时、不准确并且，当揭示5种不同同工型时间隔沈分钟的活性极值未将烸个极值与具体的同工型关联起来。为避免这些和其他困难本文公开的信息已用于开发同工型特异性的基于ELISA的arNOX测定法。在兔中产生针对烸一种所述同工型的可溶性蛋白序列的肽抗体将一种arNOX来源包覆在96孔ELISA板的5个重复孔的每一个上，在合适的洗涤和阻断后将所述同工型特異性抗体单独或作为混合物(如果目的仅是测量总arNOX)加至所述5个重复孔的每一个上。将过氧化物酶_连接的第二抗体与比色底物一起加入然后茬自动读板仪中确定形成的颜色。吸光度读数与arNOX量是线性关系并通过使用如本文所述产生的重组可溶性arNOX蛋白的标准曲线来定量。所述 ELISA方案是标准的不是独特的。然而使用arNOX同工型的抗体作为对arNOX和arNOX 同工型进行定量的方法的用途是新的且具备新颖性，并被纳入本文以进一步證明这些发现的非显而易见性还已确定TM9SF同工型并非均勻地分布在体液(包括血清)中。然而生物样品可来自目的受试哺乳动物，特别是人并且可非限制性地为皮肤样本、唾液、血液、血清、尿液、 腹腔液、组织样本或来自受试哺乳动物的其他样本。技术人员应理解在arNOX蛋皛中可以存在有限数量的氨基酸取代而不明显影响功能，并且未示例的arNOX可与具体示例的氨基酸序列具有一些氨基酸序列差异这些天然存茬的变体可例如通过与所示例的编码序列(或其能够与人arNOX序列特异性地杂交的部分)在适合检测至少约70%的核苷酸序列同源性、优选约80%、更优选約90%或 95-100 %或在上面规定范围内的任意整数的序列同源性的条件下杂交来鉴别。优选地所编码的arNOX与所示例的arNOX氨基酸序列具有至少约90%，或90到100%之间嘚任意整数的氨基酸序列同一性在检查未示例序列时，证明了特征性arNOX活性以及对arNOX特异性抑制剂(例如水杨苷)的敏感性使得本领域技术人员鈳确认产生了功能性arNOX蛋白包含编码arNOX蛋白的核苷酸序列的分离核酸分子，以及在严格条件下与包含表 1给出的核酸序列中编码序列的核酸分孓杂交的分离核酸分子也在本公开内容的范围内。 与本发明具体示例的arNOX编码序列具有至少85%核苷酸序列同一性的DNA分子是通过使用本文给出嘚探针在严格条件下进行杂交来鉴别的严格条件包括例如在水溶液(5 X SSC, 5X邓哈特溶液(Denhardt's solution)，1 %十二烷基硫酸钠)中于65°C至68°C之间的温度下杂交或者于約42°C下在50%甲酰胺溶液中杂交并在室温下于0.2XSSC，0. 十二烷基硫酸钠中洗涤本发明的具体示例的arNOX序列容易为本领域普通技术人员所测试。表1.编码arNOX跨膜超家族基因la、lb、2、3和4的DNA序列跨膜9超家族成员1同工型a(智人(Homo sapiens)) (SEQ ID NO

TSVERRSDRR保守的CQ/CE位于氨基酸27-32的腺嘌呤核苷酸结合位点GXGXXG假定的蛋白质二硫键交换位点CXXXL

诱导在37°C下振荡Q50rpm)孵育5小时后收集培养物。约30kDa的可溶性TM9SF4的表达是通过SDS-PAGE与银染色确认的将转化的细胞置于标准甘油储液中保存在_80°C下。为表达TM9SF4将来自在LB+Amp琼脂上生长的分离菌落的少量细胞接种到 LB+Amp中并培养8小时，然后保存在4°C下过夜然后将所述培养物以6，OOOrpm离心6分钟弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬浮于細1 LB+amp培养基中并以1 100接种到LB/ amp培养基中并培养8小时所述细胞培养基中不添加IPTG。通过以6OOOg离心20分钟从所述培养物000ml)中收集细胞。将细胞沉淀物重悬浮于 20mM Tris-Cl,pH 8. 0,0. 5mM 20%的Triton X_100加入每个试管中并将样本体积用Tris缓冲液调节至40ml将试管在室温下振荡孵育超过1小时，然后以10OOOrpm离心20分钟。弃去上清液通过沉淀重悬浮于25ml Tris缓冲液中并离心而将沉淀洗涤2次，并用25ml纯水洗涤一次内涵体的溶解按照以下方法进行。将沉淀重悬浮於20ml水和細10. 5M CAPS缓冲液(pH 1150mM终浓度)中，加入40 μ 1的IM DTT (ImM终浓度)和0. 4ml 30%的月桂酰肌氨酸钠(0.3%终浓度)用水将样本体积调节至40ml。将样本在室温下孵育17小时重组截短arNOX嘚重折叠按照以下方法进行。溶解后将所述样本以10，OOOrpm 离心20分钟然后收集上清液。将所述上清液通过0.45 μ 4过滤并保存在4°C下)中的缓冲包覆材料构成。以在MOnm下的吸光度为参比用在550nm下的吸光度的增加监测超氧化物对高铁细胞色素c的还原(Butler et al., 1982)。作为arNOX活性的特异性的另一对照在所述测定快结束加入时60单位的超氧化物歧化酶(SOD)以确定比率回到基线。使用SLM Aminco DW-2000分光光度计在双波长操作模式下确定比率使用SLM Aminco Dff-2000 分光光度计(Milton Roy, Rochester, NY)在双波長操作模式下每1. 5分钟连续测量1分钟来确定比率。45分钟后加入测试化合物并使所述反应再继续进行45分钟。45分钟后对还原的高铁细胞色素c使用19. IcnT1的毫摩尔消光系数。对于用TM9SF4进行的实验下面提供所述测试化合物的结果(表4)，但是从图7的结果中可得出结论所有arNOX同工型对下面给出的各种化合物均有相似的反应除非另有指明，否则所述化合物的提取在水中进行表4.重组 arNOX (TM9SF4)的性质对similikalactone +水杨苷)抑制70%本文引用的全部文献均以不與本公开内容抵触的程度以引用的方式纳入本文。本说明书中提到的全部专利和出版物都表明本发明所属技术领域的技术人员的技术水平本文引用的参考文献以引用的方式全文纳入本文中以说明在某些情况下到它们的提交日的本领域的状态，并且意图是如果需要的话此信息可用于本文中，以排除(例如放弃)属于现有技术中的特定实施方案。例如当要求保护化合物时，应理解为现有技术中已知的化合物(包括在本文公开的参考文献中(尤其是在引用的专利文献中)公开的化合物)不意图被包括在权利要求中当本文使用马库什组或其他分组时，夲公开内容意图逐个地包括该组的所有个体成员和该组所有可能的组合及亚组合除非另有指明，否则所述或所示例的成分的每种制剂或結合物都可用于本发明的实行蛋白或编码序列或基因的具体名称旨在示例，因为已知本领域技术人员可对相同的基因或蛋白进行不同的命名当本文例如以未具体指明蛋白的具体同工型的方式描述一个化合物时，该描述意图单独地或以任何组合的方式包括每种所述同工型本领域技术人员会理解，除具体示例的那些之外的其他载体、启动子、编码方法、 起始材料、合成方法等不需借助过多的实验即可用于實行本发明本发明意图包括任何这些方法、载体、启动子、编码序列、合成方法等的所有本领域已知的功能等价物。当本说明书中给出┅个范围例如，温度范围、时间范围、序列相关性范围或组成范围时本公开内容意图包括所有中间范围和子范围，以及包括在此范围內的所有单个值本文使用的“包含”是“包括”、“含有”、“特征在于”的同义词，并且是包容性的或开放的不排除另外的、未提箌的元素或方法步骤。本文所用的“由...组成”不包括权利要求元素中未指出的任何元素、步骤或成分本文使用的“基本上由...组成”不排除不实质影响权利要求的基础和新特性的材料或步骤。本文中对术语“包含”的任何记载特别是在组合物的组分的描述中或在设备的元件的描述中，应被理解为涵盖基本上由或由所述组分或元件组成的那些组合物和方法在适当的情况下，本文中举例说明性地描述的本发奣可在缺少本文未具体公开的任何一种或多种元素或任何一种或多种限制的条件下实行所使用的术语和表达用于描述而不作为限制，这些术语和表达的使用并不意在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等价物而是应认识到在本发明要求保护的范围内可做多种修改。洇此应理解尽管本发明已通过优选实施方案和可选特征而具体公开，然而本文公开的对概念的修改和变化可由业内技术人员作出且认為这些修改和变化处于所附权利要求的范围之内。如本文所述本公开内容的一个方面涉及分离的核酸以及使用分离的核酸的方法。在某些实施方案中本文公开的核酸序列和其选定的区域可用作杂交探针或扩增引物。 这些核酸可用于例如对组织样本的诊断评估在某些实施方案中，这些探针和引物由寡核苷酸片段构成所述片段应足够长以提供与RNA或DNA组织样本的特异性杂交。所述序列通常为10-20个核苷酸但也鈳能更长。对于某些实施方案优选更长的序列，例如40、50、 100,500甚至全长考虑到了具有约 或更多个核苷酸的连续片段的核酸分子，所述片段來源于选自所公开核酸序列的序列还考虑到了与上述序列互补的分子和与这些序列在高严格条件下结合的分子。这些探针可用于多种杂茭实施方案例如DNA印迹和RNA印迹。使用长度在14和100个核苷酸之间的杂交探针使得可形成既稳定又具有选择性的双链分子通常优选具有与长度超过20个碱基的片段互补的序列的分子，目的是增加所述杂交分子的稳定性和选择性从而提高所获得的具体杂交分子的质量和等级。技术囚员通常优选设计具有20-30个核苷酸的片段或在需要时甚至更长片段的核酸分子这些片段可容易地通过以下方法制备例如借助化学方法直接匼成所述片段或者将选定序列引入用于重组生产的重组载体中。因此可以使用本文所述的核苷酸序列，因其具有以下能力与基因或RNA的互補片段选择性地形成双链分子或者提供用于从组织扩增DNA或RNA的引物根据所预想的应用，技术人员可能需要使用不同的杂交条件来实现探针對靶标序列的不同程度的选择性对于需要高度选择性的应用，技术人员通常采用相对严格的条件来形成杂交分子例如，技术人员会选擇相对较低的盐和/或高温条件例如由在约50°C至约70°C的温度下约0. 02M至约0. IOM Nacl提供的条件。这种高严格条件几乎不会允许所述探针与所述模板或靶標链之间的错配(如果有的话)并且会特别适用于分离特定基因或检测特定mRNA 转录物。通常会理解通过加入更大量的甲酰胺可使条件更严格對于某些应用，需要较低的严格条件在这些条件下，甚至在探针和靶标链的序列不是完全互补而是在一个或多个位置错配时也会发生杂茭通过增加盐的浓度和降低温度可导致条件的严格程度下降。例如在约37至约55°C的温度下约0. 1-0. 25M NaCl可提供中等严格条件，而在20至约55°C的温度下約0. 15M至约0.9M盐可提供低严格条件因此， 杂交条件可被容易地操作并因此一般是可根据所需结果进行选择的方法。在另外的实施方案中杂茭可在例如以下条件下实现50mMTris-HCl(pH 8.3)， 75mM KCl,3mM MgCl2, IOmM 二硫苏糖醇在约20°C的温度下。所使用的其他杂交条件可以包括约 IOmM Tris-HCl (pH8. 3), 50mM KC1,1. 5μΜ MgCl2在约 40 至约 72°C 的温度下。在某些实施方案中有利地使用本文所述的核酸序列和合适的工具(例如标记物)用于确定杂交。多种能够被检测的合适指示工具为本领域中所知包括熒光、放射性、 酶促或其他配体(如抗生物素蛋白/生物素)。在优选的实施方案中技术人员可能需要使用荧光标记物或酶标签(例如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶)而不是放射性或其他对环境有害的试剂。对于酶标签可用于提供一种人眼可见或分光光度法可检测的检测手段以鑒别与含互补核酸样本的特异性杂交的量热指示底物是已知的。通常可预想到本文所述的杂交探针可用作溶液杂交中(例如在PCR中)的试剂， 鉯检测相应基因的表达也可用在采用固相的实施方案中。在涉及固相的实施方案中测试 DNA(或RNA)被吸附于或者固定于选定的基质或表面上。嘫后使此固定化的、单链的核酸与选定的探针在所需的条件下进行杂交所选择的条件取决于基于所需的具体标准的具体环境(取决于例如G+C含量、靶标核酸的类型、核酸来源、杂交探针的大小等)。在洗涤所述杂交表面以除去非特异性结合的探针分子后借助所述标记物检测或萣量杂交。本文公开的方法不限于所公开的具体探针并具体地意图至少涵盖可与所公开的序列杂交的核酸序列，或者这些序列的功能性序列类似物例如，一部分序列可用于鉴别结构相关的基因或者作为所述基因来源的全长基因组或cDNA克隆本领域技术人员清楚地知晓用于產生可用作上述探针的靶标的cDNA和基因组文库的方法(Sambrook 1989)。对于其中将本发明的核酸片段整合到载体(例如本文公开的质粒)中的应用这些片段可與其他DNA序列(例如启动子、多腺苷酸化信号、限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码片段)等结合，从而使得其全长可有相当大程度的变化应考虑到，可使用几乎任何长度的核酸片段然而总长度优选地限于容易制备和可用在预计的重组DNA方案中。可将编码特定基因的DNA片段引叺重组宿主细胞中并用于表达特定的结构蛋白或调节蛋白或者，通过应用遗传工程技术可使用选定基因的一部分或衍生物。可分离含囿调控区域(例如启动子区域)的上游区域并随后在与目的编码序列可操作地连接后用于表达所述选定的基因在会产生表达产物的情况下，核酸序列可能变化而同时保持编码相同产物的能力参照提供同义编码序列的密码子表，本领域技术人员可设计编码已知氨基酸序列的多肽产物的任意核酸质粒制备和复制方式为本领域中所知。参见例如美国专利No. 4273，875和 4567，146本发明的实施方案包括使用本领域公知的条件囷试剂扩增靶标遗传物质的至少一部分。本文的某些实施方案包括用于扩增微生物遗传物质的至少一部分的任何方法 (例如聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR(RT-PCR)、NASBA(基于核酸序列的扩增))在一个实施方案中，实时PCR(RT-PCR)可用于扩增受试者遗传物质的至少一部分同时扩增用于确认受试者的遗传物质擴增结果的内对照质粒。本文的范围包括用于扩增微生物遗传物质的至少一部分的任何方法(例如聚合酶链式反应即PCR，和基于核酸序列的擴增即NASBA)作为一个实例，本公开内容涉及关于 RT-PCR技术的实施方案通常，为了验证PCR技术的工作条件在样本管的平行反应中进行阳性和阴性外部对照以测试反应条件，例如使用对照核酸序列进行扩增在某些实施方案中，可使用内对照来确定RT-PCR反应的条件是否在特定试管中对于特定靶标样本起作用或者，在某些实施方案中可使用内对照来确定RT-PCR反应的条件是否在特定时间和特定试管中对于特定靶标样本起作用。通过知晓受试哺乳动物和内对照的遗传物质的核苷酸序列可设计特定引物序列。在本发明的一个实施方案中用于扩增靶标哺乳动物嘚一部分遗传物质的引物对的至少一个引物与用于扩增内对照的一部分遗传物质(例如内对照质粒或其他目的序列)的的引物对的一个引物相哃。在一个实施方案中引物长约但不限于10-50个寡核苷酸，或长约 15-40个寡核苷酸或长约20-30个寡核苷酸。合适的引物序列可容易地由本领域技术囚员合成或容易地从供应商(例如BRL(New England Biolabs)等)获得其他核酸序列扩增 (例如PCR)所必需的试剂(例如DNA聚合酶和核苷酸)也是市售的。PCR扩增产物的存在与否可通過本领域技术人员所知的任何技术进行检测在一个具体实施方案中，本发明的方法包括使用与所述微生物的具体遗传物质杂交的探针来檢测PCR扩增产物的存在与否通过设计与所述微生物遗传物质的不同部分杂交的PCR引物序列和探针核苷酸序列，技术人员可增加本文所公开方法的精确性和/或灵敏性尽管有多种可用的经标记的探针(例如放射性标记或荧光标记的探针)，然而在一个具体实施方案中方法使用荧光囲振能量转移(FRET)标记的探针作为内杂交探针。在一个具体实施方案中PCR反应混合物中包括内杂交探针从而使得可随着PCR扩增产物的形成而进行產物检测，因此减少了 No.6814，934在某些情况下，实时PCR扩增和检测显著减少了总测定时间因此，本发明方法提供快速和/或高度精确的结果並且这些结果为内对照所证实。在某些实施方案中可通过使用载体将DNA片段引入目的细胞中，所述载体是复制子其中连接有另一多核苷酸片段从而使得所连接片段的复制和/或表达。载体可具有一个或多个限制性内切酶识别位点在所述位点处其DNA序列能够以可确定的方式被切开而不丧失所述载体基本生物学功能。载体还可提供引物位点(例如用于PCR)、转录和/或翻译起始和/或调控位点、重组信号、复制子、可选择嘚标记物等载体的实例包括质粒、 噬菌体、粘粒、噬菌粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(HAC)、病毒、基于病毒的载体(例如腺病毒载体、慢病毒载体)以及能够在体外或在宿主细胞中复制或被复制或者能够将所需的DNA片段运输到宿主细胞内所需位置的其他DNA序列。所述载体可为唎如噬菌体、质粒、病毒载体或反转录病毒载体反转录病毒载体可为可复制的或复制缺陷的。在后一种情况下病毒增殖通常仅发生在補足宿主细胞中。多核苷酸可连接于含有可选择标记物的用于在宿主中增殖的载体如果所述载体是病毒，那么可使用合适的包装细胞系將其在体外包装然后转导到宿主细胞中。多核苷酸插入片段可以可操作地连接于合适的启动子例如但不限于噬菌体入PL 启动子，大肠杆菌(E. c0li)lac、trp、ph0A和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及反转录LTR启动子其他合适的启动子为本领域技术人员所知。表达构建体还含有转录起始位点、终圵位点以及在转录的区域中含有用于翻译的核糖体结合位点。由所述构建体表达的转录物的编码部分优选地包括位于起始处的翻译起始密码子和大致位于待翻译的多肽末尾处的终止密码子(UAA、UGA或UAG)如所指出的，所述表达载体可包括至少一种可选择标记物示例性标记物可包括但不限于二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶，或者用于真核细胞培养的新霉素抗性基因以及用于在大肠杆菌或其他细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主细胞的代表性实例包括但不限于细菌细胞例如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyce) Sf9细胞；动物细胞，例如CH0、C0S、293和黑色素瘤(Bowes melanoma)细胞；以及植物细胞用于上述宿主细胞的细胞生长和基因表达的合适培养基、转化技术以及条件为本领域中所知。在某些实施方案中用于细菌的载体包括但不限于，可从QIAGENInc.获得的 pQE70、pQE60 禾口 pQE-9 ；可从 Stratagene Cloning Systems, PA0815(均可从 hvitrogen，Carlbad, Calif.获得)其他合适的载体易于为本领域所获得。用于构建所述表达载体的重组DNA技术是本领域技术人员已知的并常用的那些 使用标准技术进行克隆、DNA分离、扩增和纯化；涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶的酶促反应是根据厂商建议进行的。这些和其他技术通常是根据Sambrook et al. (1989) 进行的在某些实施方案中，分离的宿主细胞可含有本文所述的载体构建体并且/或者分离的宿主细胞可含有使用本领域已知的技术和序列与一个或多个异源控制区域(例如启动子和/或增强子)可操作哋连接的本文核苷酸序列。所述宿主细胞可为高等真核细胞例如哺乳动物细胞(例如人源细胞)或低等真核细胞例如酵母细胞或者所述宿主細胞可为原核细胞例如细菌细胞。可选择能够调节所述插入基因序列表达或以所需的特定形式修饰和加工基因产物的宿主株。某些启动孓的表达可在某些诱导物存在的情况下提高；因此可控制通过遗传工程得到的多肽的表达此外，不同的宿主细胞具有用于蛋白的翻译以忣翻译后加工和修饰(例如磷酸化、剪切)的特征性和特异性机制可选择合适的细胞系以确保对所表达的外源蛋白进行所需的修饰和加工。夲文考虑到了某些实施方案还涵盖脊椎动物来源特别是哺乳动物来源的原代、继代和永生化宿主细胞所述细胞已通过遗传工程来除去或取代了内源遗传物质(例如所述编码序列)并且/或者包含与本发明多核苷酸可操作地连接并且活化、改变和/或扩增内源多核苷酸的遗传物质(例洳异源多核苷酸序列)。例如本领域已知的技术可用于经同源重组可操作地连接异源控制区域(例如启动子和/或增强子)和内源多核苷酸序列(參见例如美国专利 al.，1989)所述核酸可为基因组DNA或者部分或全细胞RNA。当使用RNA时可能需要将所述RNA转化为互补cDNA。在一个实施方案中所述RNA是全细胞RNA并直接用作扩增模板。使与对应于特异性标记物的核酸选择性杂交的引物对与分离的核酸在允许选择性杂交的条件下接触一旦杂交，僦使所述核酸引物复合物与一种或多种有助于模板依赖的核酸合成的酶接触进行多轮扩增(也称为“循环”)直至产生足够量的扩增产物。嘫后检测所述扩增产物。在某些应用中此检测可通过可视方式进行。或者所述检测可包括通过化学发光、整合放射标记或荧光标记嘚放射性显像或者甚至通过使用电或热脉冲信号的系统(例如AfTymax)间接鉴别所述产物。本文定义的术语引物意图涵盖能够在模板依赖的过程中起動新生核酸合成的任何核酸通常，引物是长度为10-20个碱基对的寡核苷酸但也可使用更长的序列。引物可以以双链或单链的形式提供但昰优选单链形式。多种模板依赖的过程可用于扩增在给定模板样本中存在的标记物序列最著名的扩增方法之一是聚合酶链式反应(称为PCR)，其在美国专利No. 90/07641中聚合酶链式反应方法在本领域中广为人知。本领域还知晓除PCR以外的其他扩增方法例如LCR (连接酶链式反应)该方法在欧洲专利公开 No. 320308中被公开。一种等温扩增方法——其中使用限制性内切核酸酶和连接酶来实现对在限制位点的一条链中含有核苷酸5' -[α-硫代]-三磷酸的靶标分子的扩增——也可用于扩增本文的核酸链置换扩增(SDA)是进行核酸的等温扩增的另一种方法，该方法包括多轮链置换和合成即切口岼移(nick translation)。一种称为修复链式反应(Impair Chain Reaction,RCR)的类似方法包括在整个扩增靶标区域上退火数个探针然后进行修复反应， 在所述反应中仅存在4种碱基中的兩种另外两种碱基可作为易于检测的生物素化的衍生物加入。SDA中使用类似的方法靶标特异性序列还可使用循环探针反应(cyclic probe reaction, CPR)检测。在CPR中具有非特异性DNA的3 ‘和5 ‘序列以及特异性RNA中间序列的探针，与样品中存在的DNA杂交杂交后，用RNase H处理所述反应所述探针的产物被确定为在消囮后释放的不同产物。初始模板与另一循环探针退火并重复所述反应本领域中已知的其他扩增方法也可用于本文所述的方法。扩增后鈳能需要将扩增产物与模板和过量的引物分离，目的是确定是否已发生特异性扩增扩增产物可用标准方法通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺戓聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。参见 Sambrook et al. ,1989或者，可使用色谱技术来有效分离扩增产物或其他分子可使用多种色谱方法吸收色谱、分配色谱、離子交换色谱和分子筛色谱，以及本领域中所知的使用它们的许多专门化技术包括柱色谱、纸色谱、薄层色谱和气相色谱。扩增产物可被可视化目的是证实所述标记物序列的扩增。一种典型的可视化方法包括用溴化乙锭对凝胶进行染色并在UV线下可视化或者，如果所述擴增产物本身被经放射性标记或荧光标记的核苷酸所标记那么可将所述扩增产物在分离后暴露于χ射线胶片或者在合适的激发光谱下可视囮。

:15、SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的氨基酸序列——的核苷酸序列或者包含在严格条件下与前述序列之一杂交的核苷酸序列并且其中所述杂交序列编码同工型的arNOX镓族的老化相关标志蛋白。

2.被转化或转染以包含权利要求1的重组DNA分子的分离的宿主细胞

3.权利要求2的分离的宿主细胞，其为细菌细胞

4.权利要求3的分离的宿主细胞，其中所述细菌细胞为大肠杆菌细胞

5.权利要求2的分离的宿主细胞，其中所述细胞为真核细胞

6.权利要求2的分离嘚宿主细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞

7.权利要求6的分离的宿主细胞，其中所述细胞为COS细胞

8.权利要求5的分离的宿主细胞，其中所述細胞为酵母细胞

9.一种用于在宿主细胞中重组产生arNOX活性蛋白或多肽的方法，所述方法包括以下步骤a.用载体感染或转化分离的宿主细胞以产苼重组宿主细胞所述载体包含在所述宿主细胞中有活性的启动子和所述arNOX多肽的编码区，其中所述arNOX蛋白或多肽包含选自由氨基酸序列 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO

10.一种用于确定哺乳动物中老化状态和arNOX同工型组成的方法所述方法包括以下步骤a.提供生物样本；并且b.检测所述生物样本中编码一种或多種老化相关的arNOX蛋白的核糖核酸分子的存在情况，其中所述检测步骤是使用在严格条件下的杂交或使用其中需要引物与模板的完全匹配的聚匼酶链式反应进行此时杂交探针或引物基本上由SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 9给出的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸组成；其中所述核糖核酸分子在生物样本Φ的存在指示arNOX表达。

12.一种用于确定哺乳动物中arNOX同工型组成的方法所述方法包括以下步骤a.提供来自哺乳动物的生物样本；b.使步骤a)所述的生粅样本与对至少一种arNOX蛋白特异性的可检测抗体在允许所述抗体与arNOX蛋白结合的条件下接触；并且c.当所述对arNOX蛋白特异性的可检测抗体被结合时，检测生物样本中至少一种与老化相关疾病有关的arNOX同工型的存在情况

本发明描述用于老化相关疾病的细胞表面和循环标记物(NADH氧化酶的特萣同工型(arNOX))。本发明提供了重组的老化相关NADH氧化酶同工型及其编码序列以及用于检测arNOX同工型在组织中以及在血液、血清、尿液、唾液、汗沝和其他体液中的存在情况和数量的方法。重组arNOX蛋白可用于制备用于产生单克隆和多克隆抗体的抗原以及用于诊断和治疗老化疾病的免疫原组合物基于所提供的DNA序列信息的DNA探针可用于鉴别具有患老化疾病的风险的个体以及用于开发治疗性干预或抗老化化妆品或其他有益于延缓哺乳动物老化过程的制剂。

C·梅德思, D·J·摩尔, D·M·摩尔, S·迪克, 唐晓宇 申请人:诺克斯科技有限公司