根据醋酸纤维电泳条带分析薄膜电泳结果,指出每个条带代表的是哪种蛋白质,并对γ球蛋白的粗提液进行讨论?

实验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

学习和掌握电泳技术的基本原理;学习掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作。

蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中蛋白质为正离子,在电场中向阴极移动;在pH大于其等电点的溶液中,蛋白质为负离子,在电场中向阳极移动。血清中含有的蛋白质等电点大部分低于pH 7.0,所以在缓冲液(pH 8.6)中,它们都电离成负离子,在电场中向阳极移动。

醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成,它具有均一的泡沫样结构,厚度仅120um,有强渗性,对分子移动无阻力,作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少,应用范围广,分离清晰,没有吸附现象等优点。目前已广泛应用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白和同工酶的分离。

醋酸纤维薄膜(2c m×8cm)、常压电泳仪、点样器、培养皿、粗滤纸、玻璃板、镊子。3〉试剂

(3)漂洗剂:含甲醇或乙醇45ml、冰醋酸5ml、水50ml,混合即可得100ml。

(4)透明性:无水乙醇70ml、冰醋酸30ml。

(1)浸泡:用镊子取醋酸纤维薄膜1张(识别出光泽面和粗糙面,并在光滑面角上用笔做上记号)放在缓冲液中浸泡20min。

(2)点样:把膜条从缓冲液中取出,用滤纸吸干膜条表面多余的液体,然后平铺在玻璃板上(粗糙面朝上),用玻棒蘸一点血清,再将点样器沾一下玻棒,则血清就会均匀地分布在点样器上,将点样器在膜条一端2~3cm处轻轻、水平地落下并随之提起,这样在膜条上点上了细条状的血清样品。

(3)电泳:先剪裁一些尺寸合适的滤纸条,取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上,使它的一端与支架的前沿对齐,而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部湿润并驱除气泡,使滤纸条紧贴在支架上,即为滤纸桥。

在电泳槽内加入缓冲液,缓冲液液面离膜条距离1.5~2cm,使两个电极槽内液面等高,将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上,膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室,通电,调节电压至100~160V,电流强度0.4~0.7mA/cm膜宽,电泳时间为60~90min。

(4)染色:电泳完毕后将膜条取下来并放在染色液中浸泡10min。

(5)漂洗:将膜条从染色液中取出来后移置到漂洗液中漂洗。

(1)将膜条漂洗至无蛋白区底色脱净为止,可得色带清晰的电泳图谱。

(2)定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干,按区带分段剪开,分别浸在0.4mol/L氢氧化钠溶液中半小时,并剪取相同大小的无色带膜条作为空白对照,在A560条件下进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2~3min后取出贴于洁净玻璃板上,干后即为

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