能不能通过病毒修改细胞的DNA组？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-06-26 06:33 标签： 细胞dna倍体定量检测

通过DNAshuffling方法靶向乳腺癌细乳腺癌细胞的腺相关病毒

在传统的治疗手段渐渐不能满足治疗疾病的今天,基因治疗则成为一个新的治疗癌症的选择,同时寻找一个理想的基因治疗载体也成为了目前基因治疗研究中不可或缺的一个重要方向。<br>　　 AAV病毒作为携带基因治疗的载体,1)具有安全性好,没有明显致病性,2)不能自主复制,3)宿主范围广,4)可长期表达外源基因,并且5)特异性的整合到人19号染色体上等优点而成为目前基因载体研究中的重要的基因携带载体,同时也是基因治疗众多基因治疗载体中最具潜力载体之一。<br>　　 但也正是由于其宿主范围广,也导致了其对组织或细胞没有特异性,导致AAV介导的基因治疗对靶细胞的感染效率低。因此提高AAV病毒感染目的细胞的效率和AAV病毒转运组织的靶向性,是改造AAV病毒的关键。越来越多的研究文献表明目前改造AAV病毒靶向性主要通过以下几种方法:1)单纯的化学修饰,2)外壳基因插入删除改造,3),交换不同血清型AAV之间的营救标记区域以及4)产生嵌合型基因载体等1。其中通过实验产生嵌合型的基因载体定向进化成为靶向某一组织或者某一细胞的新型AAV是目前改造AAV病毒趋向性的手段之一。<br>　　 本文就是采用DNA shuffling的方法,将九种不同来源的亲本型AAV病毒AAV1-AAV9通过PCR方法扩增出衣壳基因cap片段,通过DNaseI酶随机酶切,琼脂糖电泳后割胶回收100-300bp大小片段,试验了两种不同的shuffling PCR方法,结果显示用随机酶切产物直接作为PCR模板的方案特异性条带不明显,而使用用无引物PCR和有引物PCR结合的方法则能较好的扩增出2300bp左右的特异性条带,将PCR产物回收酶切以后连接到笔者自己构建的带有致死基因CCDB的病毒包装载体pARC上,产生一系列不同亲本型来源的嵌合型AAV基因的质粒pAdL,以此构建AAV随机的衣壳基因文库。<br>　　 在此基础上,利用对AAV文库基因包装病毒,建立嵌合型AAV病毒文库,利用文库病毒在体外对AAV病毒进行定向进化,筛选获得一种能够靶向乳腺癌细胞的病毒。经过重复三轮感染以后发现一种能够靶向乳腺癌细胞sk-br-3的新型AAV病毒,通过基因比对发现这种新型的嵌合型AAV病毒AAV-Y与AAV1,AAV2,AAV7,AAV8具有同源性。<br>　　 在进一步研究该病毒对肿瘤细胞的感染能力的实验中我们还发现,用相同浓度的AAV-Y病毒感染肝癌细胞BEL-7721,则几乎没有感染能力,而对乳腺癌细胞sk-br-3具有一定的感染能力,为以后进一步研究AAV-Y病毒的功能打下了基础。同时也证明了本研究中所设计的文库构建以及病毒筛选具有很强的可行性,所构建的文库能够满足本实验室定向进化其他组织细胞的要求,也为了以后AAV载体改造靶向基因治疗提供了基础。

病毒的构成：病毒由蛋白质外壳和遗传物质组成，分为DNA病毒和RNA病毒，其中DNA病毒需要进入细胞核内部才能转录、翻译、逆转录、繁殖，而RNA病毒在细胞质中就可以实现繁殖，本次的新冠状病毒就是RNA病毒。

病毒感染的过程：1、病毒进入动物体内，会遇到抗体蛋白，这些抗体蛋白会包围住病毒，使其无法进入细胞内部，并最终被免疫细胞吞噬。（相对个体）如果是新病毒，则可能抗体蛋白不足（进入体内的病毒数量不足也不会有问题），病毒就会落到细胞表面，战斗进入第二回合；2、病毒的刺突（冠状病毒表面S蛋白）欺骗细胞膜（对大分子具有选择通过性）进入细胞膜，并形成囊泡，囊泡中的溶酶体（分泌酸性物质）试图分解病毒，病毒释放特殊蛋白，并将囊泡撕裂，最终进入细胞；3、在马达蛋白的帮助下，DNA病毒的DNA会进入细胞核将自己链接到寄主DNA上。

病毒的致命过程：病毒会引起免疫反应，严重的免疫反应会出现炎症，身体的某些部位会红肿（该处的血液流速增加、血管膨胀、血管壁通透性增加从而让更多的免疫细胞和水分从血管中流到组织液里，有助于杀灭和冲淡病毒）。如果发炎太厉害，会对身体有害甚至致命，这就是细胞因子风暴。细胞因子是免疫细胞分泌的，用来促进免疫细胞产生和动员免疫细胞战斗力的蛋白质，如果免疫反应发现自身无法清除某种病毒，就会产生大量的细胞因子，动员出巨量强毒性的白细胞，有些白细胞会对组织细胞进行无差别攻击，造成大量的正常细胞死亡，器官衰竭。冠状病毒致死的原因就是自身免疫反应攻击肺部，大量体液充斥肺部，造成呼吸困难，甚至窒息死亡。

冠状病毒：人类已经发现了7种可以感染人的冠状病毒，其中四种只会引起轻微感冒，还有三种可以引起致命疾病，分别是2002年底种中国爆发的SARS、2012年底在沙特阿拉伯爆发的MERS和现在的新冠状病毒。

新冠状病毒目前的治疗方法：1、呼吸辅助（包括吸氧、人工肺），让病人多抗几天，最终依靠免疫系统产生抗体并清除病毒，这需要大约2周左右的时间；2、上激素，让免疫系统熄火，慢慢消灭病毒。

抗病毒：按目前的理解，冠状病毒策略算是入门级，而HIV和HBV才是病毒中的王者。HBV可能是策略最复杂的病毒之一，HBV病毒结合肝细胞表面受体内吞进入细胞中，然后在马达蛋白的帮助下病毒双链DNA（有缺损）进入细胞核，在细胞核中补完缺口，形成没有缺损的cccDNA，cccDNA再转录为RNA，RNA从细胞核中跑到细胞质中，其中的前体RNA居然能够逆转录成DNA，形成双链DNA，再和RNA制造的病毒蛋白组装成病毒颗粒。这还不算完，新制造的双链DNA，除了组装成新病毒以外，还有一部分会整合进人体肝细胞的基因组中，肝细胞分裂，病毒基因组也会复制。这还不算完，整合进入肝细胞基因组中的整合DNA，也会转录RNA，来制造病毒蛋白，而且是大量的制造乙肝表面抗原蛋白(HBsAg)，这种蛋白可以自己形成巨量的病毒颗粒，作为烟雾弹来耗竭免疫细胞，压制免疫系统，使得人体难以形成有效的抗体，这也是为什么乙肝难以治愈的原因。面对乙肝这样的病毒王者，虽然暂时不能治愈，但是人类早就可以完全控制乙肝病毒的复制，比如恩替卡韦、替诺福韦这些药物，也是采取欺骗病毒的策略，以其人之道还治其人之身。恩替卡韦、替诺福韦都是核苷酸类似物，核苷酸是DNA、RNA的组成部件，核苷酸类似物长的和核苷酸非常像，病毒的逆转录酶蛋白会错把类似物当成核苷酸，组装进乙肝DNA中，从而造成复制中断，病毒就停止复制了。吉利德的Remdesivir (GS-5734)也是核苷酸类似物，原理是抑制冠状病毒的RNA聚合酶，估计也是以假乱真欺骗病毒。

研究资料表明,人巨细胞病毒(HCMv)单一蛋白的单一抗原决定簇只能被部分患者阳性血清识别.组建在血清学诊断中能够替代全病毒抗原的基因工程抗原,需要含有病毒多种主要抗原蛋白的抗原决定簇.为搞清在表达载体中重复插入某一抗原决定簇基因是否能表达出更高抗原效价的融会蛋白,我们用点突变的方法,在表达载体中分别插入了人HCMv的ppUL32蛋白羧基端一个抗原决定簇基因的1个,2个和3个拷贝.在免疫转印检测中,这些克隆表达的融合蛋白与特异性阳性血清的反应性差别不明显.这表明,插入表达载体中目的基因的多寡对表达蛋白的抗原效价没有显著影响.

通过平台发起求助，成功后即可免费获取论文全文。

我们已与文献出版商建立了直接购买合作。

你可以通过身份认证进行实名认证，认证成功后本次下载的费用将由您所在的图书馆支付

您可以直接购买此文献，1~5分钟即可下载全文，部分资源由于网络原因可能需要更长时间，请您耐心等待哦~

我要回帖

更多关于 细胞dna倍体定量检测 的文章

 

随机推荐