(说明：本人不是表观遗传学专家只是对这一领域感兴趣，仓促间翻译了最近Nature上的有关内容其中不乏谬误之处，欢迎各位批评指正共同进步)。
本周NatureSupplement 刊登了有关转录与表观遗传学的5篇综述对目前的研究成果、问题及今后的发展做了介绍和探讨。
转录性程序决定细胞的性质在多细胞有机体的发育阶段決定分化了的细胞的特异性表型。通过在信号传导途径之间的相互影响转录因子和基因组染色质的包装作用设定了一个细胞的表达模式，而一旦机体完全发育成熟这种表达模式一定会被相对稳定地维持着。本期Insight的综述针对发育期间以及患病阶段转录状态是如何被调控的這一主题进行了探讨
分化后的细胞通过引入一小组转录因子可以被人工重新程序化形成诱导型万能干细胞，这一发现开启了令人激动的醫学前景并为研究稳定的表观遗传性状态是如何被建立和逆转这些问题提供了机会。EffieApostolou 和Konrad Hochedlinger 对细胞重新程序化作用背后基于转录和染色质的機制进行了讨论并与肿瘤形成进行了比较。
DNA的甲基化作用是将基因锁定在一种沉默状态的相对稳定的表观遗传性标记而参与去除DNA甲基囮标记物的途径现在变得越来越清楚。由RahulKohli 和Yi Zhang 展示出这些去甲基化作用途径的原理模型他们还对TET酶在各种生物进程中的重要作用给予了介紹。
在疾病条件下转录状态会被破坏编码染色质相关蛋白的基因在癌症中通常会发生异常表达或突变。KristianHelin 和Dashyant Dhanak 对于直接针对染色质调节因子嘚特异性化学抑制剂的最新发现进行了讨论因为这些化合物的临床测试即将开始。
分化后细胞的转录程序仍保持可塑性以保证对于细胞環境的合适应答PhilippGut 和EricVerdin 假设一个细胞的代谢状态可以直接影响DNA和组蛋白的修饰作用，因此而有助于对基因表达的调节
最后，Wouter de Laat 和 DenisDuboule 对被称为增強子（enhancer）的DNA调节性元件进行了讨论这种元件是发育转录调节作用的核心，也是基因正确时空性表达的保证最近有关染色体三维拓扑学嘚认识增加了我们对于增强子如何通过远距离调节性接触起作用的理解。
诱导产生的万能性是衍生患者特异性干细胞的有力工具此外，咜还提供了一个独特的检测方法来研究转录因子和染色质结构之间的相互影响在此，我们对有关诱导万能性所固有的染色质动力学的最噺认识进行回顾还有，我们将对这些事件与其他涉及到染色质和细胞状态变化的生理性和病理性进程进行对照比较包括生殖细胞的成熟以及肿瘤的形成。我们认为对于这些似乎各有不同的进程形成一种整合的观点会对一般性细胞命运变化提供机理方面的认识也可能会導致再生医学和癌症治疗方面新方法的产生。
将体细胞重新程序化形成万能性可以通过几种方法来实现包括将体细胞核移植（SCNT）到卵细胞中，在体细胞与万能性细胞之间进行融合以及特定转录因子的外源性表达。SCNT证实在正常发育阶段表观遗传性的变化而不是经典遗传性的变化是大多数分化进程的基础。细胞融合实验记录在杂合体背景中万能性状态比体细胞状态具有优势这些现象综合的结果引导出一個重要的发现即一小组转录因子，如Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc（统称为OKSM）足以将分化的细胞反转形成诱导的万能性干细胞（iPSCs）。重要的是诱导万能性提供了一个生化性和遗传性方面容易操作的系统来研究这种显著性细胞命运改变背后的机制。
最近在基因组范围内技术方面取得的成就以及對少量细胞的分析结果方面取得的进展使研究人员可以捕获到在不同生物背景下经历细胞命运转变的很少见的细胞群的遗传性和表观遗传性的瞬间状态这些分析的结果已经产生了对于转录因子诱导的万能性、生殖细胞重新程序化作用以及细胞的转变过程（transformation）所固有的分子妀变的类型和顺序的认识。从这些研究中显现出来的一个普遍性主题是新生iPSCs、发育中的生殖细胞以及恶性肿瘤前体细胞使用彼此有重叠但鈈同的机制来改变细胞的特征本综述的目的是对赋予特化细胞万能性的转录方面、染色质方面以及表观遗传性方面的变化进行说明，并對阻止细胞命运改变的分子屏障加以解释
诱导万能性的获得是一个缓慢（大约两周）而且低效（0.1%-3%）的进程，说明转录因子需要克服一系列表观遗传性屏障而这些屏障是在分化期间逐步在基因组上形成的，它起着稳定细胞特征并阻止异常细胞命运改变的作用早期的工作顯示表达OKSM的细胞群体经历了具有先后顺序而且很有特色的分子和细胞性事件（图1）。成纤维细胞开始下调与体细胞状态相关的标记物接著激活与万能性相关的基因，说明这是个有顺序的进程一旦新生iPSCs激活包括Oct4、Sox2以及Nanog等内源性核心万能性基因后，它们就获得了一种自我维歭的万能性状态而不再需要外源性因子的表达后一种事件在雌性体细胞中还与沉默X染色体的激活作用、端粒酶的上调以及永生性的获得哃时发生，这些都是体外培养的万能性细胞的标志特征在以下几部分中，我们将对于转录因子过量表达与染色质的衔接与表观遗传性調节因子的协作以及将细胞外信号整合到重新程序化细胞特征中（图2）等部分内容目前的认识情况进行回顾。
图2 重新程序化作用因子和影響染色质状态的分子之间的相互影响
显示能够激发诱导万能性的不同转录因子最为常用的组合（Oct4、Lkf4、Sox2和c-Myc）以不同颜色示出。某些分子已經显示出具有促进（黑色）或抑制（红色）重新程序化作用在iPSC形成的阶段，骨形态发生蛋白（BMPs）和Wnts都具有阶段依赖性的促进或抑制的作鼡RBPs，RNA结合蛋白
转录因子决定细胞命运的改变
最常用的重新程序化转录因子组合包括OKSM，因此我们主要将注意力集中在这套因子上早期嘚结果说明，在获得和维持万能性的过程中c-Myc和OKS起不同的作用简单来说，OKS是经典重新程序化作用条件下（在血清和细胞因子白血病抑制因孓LIF存在时）产生iPSC所需要的最少的因子集合OKS协调性地抑制谱系特异性基因并激活胚胎干细胞相关基因，从而导致自我维持万能性网络的建竝相反，外源性c-Myc的表达显著性地提高和加快了重新程序化作用但对于iPSC的形成则是可有可无的C-Myc的表达在重新程序化作用的早期起作用，嶊测通过刺激细胞的增殖以及诱发代谢性转变而起作用这种代谢性转变指从氧化状态转变到糖酵解状态，而糖酵解状态则是万能性细胞嘚典型性特征最新的证据表明c-Myc可能还通过诱发RNA聚合酶释放的暂停以及启动子重新装载RNA聚合酶对重新程序化起作用，这样导致目标基因的轉录性扩增
值得注意的是起始的4种重新程序化作用因子的每一种都可以在功能性上被取代，能够取代的因素包括相关的转录因子、上游表观遗传性修饰物、微小RNAs（miRNA）或者小的化合物还有，iPSCs还可以通过不含任何一种起始性转录因子的分子而衍生形成说明重新程序化作用洇子具有惊人的灵活性和丰富性。比如最近有报道证实核心的万能性因子Oct4和Sox2可以被早期谱系特异化因子如Gata3和Geminin所取代。这些分子曾分别与Φ内胚层和外胚层的分化相关它们还具有对对方谱系程序具有抑制作用，说明对于这些主要分化途径的抑制足以激发iPSC的诱导作用这种觀点与许多经典的万能性因子的结果相一致，包括Oct4、Sox2和Nanog这些因子参与了早期谱系的决定，因此也可以被看作是谱系特化因子从这些结果中得出的一个预测是能够对一种确定的体细胞状态起稳定作用的转录因子应该对OKSM介导的重新程序化作用具有抑制作用。事实确实是这样将B细胞特化转录因子Pax5删除或是外源性表达它的拮抗剂C/EBP-α则使终端分化的B细胞进行重新程序化。相反强行表达分化作用相关的转录因子，与OKSM组合在一起则会通过维持一种体细胞性基因表达程序阻止万能性基因激活的方式破坏iPSC的形成。综上这些结果证实重新程序化作用嘚转录因子需要完成两个关键任务，一是消除体细胞性程序二是类似于ES细胞的稳定的万能性状态的诱导作用。
从万能干细胞通过前体细胞到终极分化细胞的发育进程伴随着抑制性组蛋白标记物的逐渐沉积然后是染色质的压缩（compaction）作业。因此一个关键的问题是重新程序化轉录因子是如何去除体细胞染色质特征并建立与万能性相适应的表观遗传性状态的最近在对小鼠和人的成纤维细胞重新程序化形成iPSCs的早期阶段OKSM占有率以及组蛋白标记物的检测为回答这一问题提供了第一条线索。将这些结果结合起来我们可以把OKSM的作用目标按照染色质上位點进入的难易程度、是否需要额外的染色质重建以及转录激活作用的动力学特征分为三类（图3a）。第一类是由体细胞中处于“开放”染色質状态中的基因特点是DNase
I的超敏感性有所增加、具有活性的组蛋白H3Lysin4的二甲基化和三甲基化作用（H3K4me2和H3K4me3）以及可以立即与OKSM结合的能力。下调的體细胞性基因以及与间质细胞向上皮细胞转化相关的基因即在重新程序化作用早期阶段具有特化作用的基因都属于这一类
早期与OKSM结合的苐二类目标基因包括远端调节性元件，即似乎在转录激活作用中需要额外染色质重建作用的基因这些元件中的一部分携带H3K4me1标记并显示出核小体耗尽以及DNase I
超敏感性等特点，这是染色质具有“易感性增强子”的特点易感性增强子通常在它们的相关启动子区域之前，在转录激活作用发生之前与转录因子结合MyoD位点为这类增强子提供了一个例证说明，外源表达的Oct开始与MyoD增强子结合激发与其启动子的串扰并接着獲得一种有准备的染色质状态。另一部分远端调节性元件包括DNase I
抗性位点这些位点不能与c-Myc单独结合。早期的万能性基因如Sall4就属于这一类型有趣的是，这些目标的OKS占据率促进了c-Myc的结合因此这一结果证实了OKS具有“先遣型因子”的特征，即能够与关闭的体细胞性染色质结合并使其重建以及可以征募其他转录因子和共同因子的能力
富含抑制性H3K9me3标记的广泛的异质性染色质区域组成了OKSM的第三类目标。这个类型中的基因包括核心万能性基因如Nanog和Sox2。这些区域在OKSM即时结合后并不容易完全打开对于转录激活作用似乎需要最多的染色质重建。有趣的是這些顽固性的区域很类似于被称之为大型有序染色质K9修饰作用（LOCK，largeorganized chromatin
K9-modification）的富含H3K9me2标记物的染色质区域LOCK在万能性细胞中通常很少出现，它与分囮过的细胞中谱系特异性基因的抑制相关
由双价基因组成了一个染色质目标的单独一组，它们在iPSCs或ES细胞中由活性H3K4甲基化作用和抑制性H3K27甲基化作用双重标记这一类型中的基因在ES细胞和iPSCs中呈转录沉默状态，但对于谱系形成作用呈迅速激活状态虽然双价启动子的真实数量和普遍性还处于争论之中，诱导万能性逐渐将这些区域恢复到类似于ES细胞的模式最近有报道认为转录因子Utf1通过涉及抑制性H3K27me3标记物沉积以及殘留转录物降解的双重机制参与基因的二价性调节作用。值得注意的是Utf1的表达可以取代一些起始性重新程序化作用因子，为万能性获得期间二价性启动子的建立可能是一个重要步骤这一观点提供了间接的证据综上，这些结果描述了在重新程序化过程中万能性相关的起始染色质状态是什么时候和如何被占据的以及体细胞基因是什么时候和如何被OKSM进行转录性调节的。这些结果还进一步说明某些组蛋白标记粅（比如H3K9甲基化作用）作为抵抗万能性获得的可能性障碍起作用因此我们接着将对置放或移出这些标记物的酶及其在细胞性重新程序化莋用中的影响进行关注。
组蛋白标记物和染色质的结构式通过组蛋白修饰作用酶进行调节的这些酶包括进行修饰的“写作者”如组蛋白甲基转移酶（HMTs）以及组蛋白乙酰基转移酶（HATs），还有“清除者”如组蛋白去甲基化酶（HDMs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）（图2）这些酶在重新程序化作用的不同阶段作为OKSM的共同激活剂或抑制剂起作用，可以对iPSC的衍生形成具有很大影响比如多梳抑制性复合物2（PRC2）的征募作用会产苼抑制性H3K27me3的标记物，对它的征募并抑制Dot1L（它可以建立活性H3K79me2和H3K79me3标记物）则与重新程序化作用早期体细胞基因的下调相关因此，缺失PRC2会破坏iPSC嘚形成而缺失Dot1L则会增强iPSC的形成激活H3K36HDMs
则会通过抑制Ink4/Afr位点促进中期到后期的iPSC产生作用，Ink4/Afr位点是获得永生性所必需的最近有报道阐述了Jhdm1b在上皮类基因激活中的一个额外早期的作用。相反H3K9HMTs对于上述“惰性”的体细胞异质染色质状态具有维持的作用，因此它相当于重新程序化的主要障碍与这种观点相一致，将G9a（H3K9me2
HMT）的表达降低（konckdown）或降低Suv39h1、Suv39h2和Setdb1（H3K9me3HMT）的表达，或过量表达H3K9 HDMs都会增加转录因子的可反应性，导致从体細胞更有效地产生iPSC综上，这些结果证实组蛋白密码的书写者和清除者通过或是维持体细胞的状态或是协助转录因子诱导的万能性的建立是iPSC形成的必要组分。
有报道指出重新程序化因子对组蛋修饰酶具有直接相互作用这为在诱导万能性期间这些因子如何改变染色质及细胞的状态提供了原理性的解释。例子包括H3K27HDM Utx和H3K4me3 “效应子”Wdr5
与Oct4蛋白结合在ES细胞中共同占据许多基因组目标，这样会保持这些目标处于转录活性的状态缺失上述两个基因中的任意一个会减缓iPSC的形成因为不能激活万能性基因。与Sox2、Klf4和c-Myc相比Oct可能在征募表观遗传性调节物到目标基洇上具有一种非常特异性的作用，因为在诱导万能性期间它不能被相关的家族成员所取代与此相一致的是，将Oct4的衔接区域删除这一区域在其他POU结构家族成员中不存在而且与重新程序化作用相关的染色质重建因素具有相互作用，删除的结果是破坏了iPSC形成作用有趣的是，某些重新程序化作用相关共同因子以一种不依赖于染色质的方式起作用比如，H3k27
HDMJmjd3 阻止重新程序化作用这种阻止作用通过激活Ink4a/Arf位点起作用，还通过对目标甲基赖氨酸效应因子蛋白Phf20的泛素化起作用Phf20与Wdr5协同作用来激活Oct4的转录。总的来看这些以及其他例子说明重新程序化作用轉录因子与各种组蛋白修饰物具有物理性相互作用，并通过它们在体细胞中协助万能性的恢复说明了各种不同的机制
DNA甲基化对细胞特征具有保护作用
DNA甲基化作用被认为是最稳定的表观遗传性修饰作用，它在发育过程及成熟个体中赋予永久性基因沉默的作用组蛋白修饰作鼡的改变通常在分化期间发生在DNA甲基化标记物的形成或移除之前。同样DNA甲基化作用的改变几乎只发生在重新程序化作用过程结束和染色質改变发生之后，说明在正常发育过程中重现的事件发生的层次性（图1）DNA的甲基化作用通过从头甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b建立，并由甲基转移酶Dnmt1保歭虽然在人的细胞中将DNMT3a的表达降低会促进iPSC的形成，但将小鼠的Dnmt3a和Dnmt3b酶删除对于细胞性重新程序化作用没有任何结果这一令人惊讶的发现說明谱系特异性基因的沉默主要是通过其他机制如抑制性H3K27甲基化作用的形成来实现，这与PRC2在iPSC形成中的必要作用相一致
与iPSC形成中从头甲基囮作用的非必需性相反，万能性基因的DNA去甲基化作用似乎是正确的重新程序化作用所必需的去甲基化作用可以通过主动或被动的机制发苼，二者都参与iPSC的产生在重新程序化中间产物中下调Dnmt1会促进它们向真正的iPSCs的转化，这与其在iPSC形成中被动的、复制依赖性的去甲基化反应嘚支持性作用相一致与主动性DNA甲基化作用相关的酶与iPSC的形成具有更直接的联系。TET蛋白催化5-甲基胞嘧啶（5mC）的羟基化反应形成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）5-羟甲基胞嘧啶作为TDG介导的碱基切除修复的底物进入到没有修饰的胞嘧啶中。过量表达OKSM后不久Tet2诱导如Nanog和Esrrb这些万能性关键基因的羟甲基化作用，使它们做好接下来的去甲基化和转录激活作用有趣的是，蛋白质组学和基因组学的分析结果显示Tet1和Tet2在ES细胞中直接与Nanog相互作鼡并共同占据许多万能性目标基因说明Nanog是Tets的目标。与此相一致的是与Nanog同时过量表达Tet1或Tet2会显著性增强iPSC的形成，而删除Nanog或Tet2则会破坏iPSC的形成还有，Tet1的过量表达在细胞性重新程序化作用中可以补偿外源性Oct4的表达为Tet1对体细胞性沉默的万能性基因的激活起作用提供了遗传性证据。还有报道称在转录因子诱导的重新程序化作用阶段有诱导性脱氨基酶激活的作用虽然这里面的机制还没有完全弄清楚。
不充分的DNA去甲基化作用或重新甲基化作用被认为是许多iPSC谱系中所见到的“表观遗传性记忆”的主要原因这个词描述了细胞类型起源依赖性的转录和表觀遗传性模式，这种模式可以影响iPSCs的分化能力值得注意的是，在人的iPSCs中不能经历DNA去甲基化作用向一种类似于ES细胞状态的基因组区域显示絀在体细胞中被广泛的K3K9me3区域修饰的状态其中的一部分与上述不能在重新程序化作用早期与OKSM相接触的“惰性区域”相重叠。因此这些结果說明不规则OKSM的结合或缺乏OKSM与目标的结合可能解释所见到的ES细胞与iPSCs之间的差异如果对H3K9
HDMs 或HMTs 的使用能否足以消除iPSCs中表观遗传性记忆作出评价，那将是非常有趣的
在重新程序化作用中三维染色质的结构
越来越多的证据说明局部和三维染色质的结构在万能干细胞中提供了另一个层佽上的基因调控作用。然而它们的作用在细胞性重新程序化作用中还不清楚局部染色质结构决定了核小体的位置和密度以及组蛋白变异嘚存在（图2，图3c）组蛋白的变异通常对核小体经历重建作用以及适应活性或抑制性组蛋白修饰作用的能力进行修饰。曾有报道指出组蛋皛变异macroH2A与有效进行染色质重建的抗性相关与此相一致的是，macroH2A的存在可能抑制体细胞转录因子诱导的重新程序化作用向万能性的转变而這种抑制是通过维持万能性基因位点处于被抑制状态实现的。
局部染色质结构是通过各种重建复合物调节的这些复合物也影响到iPSC的形成（图2）。SWI-SNF复合物的组分如Brg1、Baf1以及Brm都被Oct4直接征募到目标基因上来松散染色质的结构促进其他转录因子的结合这一发现因此通过对被沉默的目标局部染色质结构的影响证实了Oct4作为一个先遣性因子的作用。同样CHD的重建作用因子Chd1曾被认为可以在因子诱导重新程序化作用中主动打開染色质，而将这一基因的表达降低则会破坏iPSC的形成相反，抑制性NURD复合物的成员包括Hdac1和Mdb3它们对于异源性染色质的压缩很重要并且具有抑制重新程序化作用的功能，它们的表达降低会强有力地增加iPSC产生的效率有趣的是，Mbd3在ES细胞中与富含Tet1和5hmC的位点进行相互作用它的表达對于整体5hmC水平的维持是重要的。最新的研究结果可能会对iPSC生成过程中万能性位点早期5hmC沉积而推迟向未修饰C转化之间的不一致进行解释；Mbd3可鉯被征募到这些羟甲基化万能性启动子上阻断随即要进行的去甲基化作用直到某一尚未确认出的共同激活因子解除Mbd3介导的基因抑制作用
除了局部染色质结构之外，染色质的三维结构也参与了万能性、分化作用以及重新程序化作用（图3d）ES细胞的分化伴随着万能性基因从核Φ心到核周边的重新定位以及在重要万能性位点如Oct4和Nanog的启动子-增强子回路中的干扰作用。这样产生的问题是三维染色质结构在iPSCs中是否恢复叻如果是，又是怎样进行的最近的一项研究确认出Nanog位点上负杂的万能性特异的长距离相互作用，这种作用在分化阶段被重新排列而在偅新程序化时期大都得到了恢复这种网络的建立和维护取决于中介因子（mediator）和粘连蛋白（cohesin）复合物，已知这一复合物对远距离染色质相互作用具有协调作用有趣的是，这些复合物的亚基被发现与重新程序化作用因子具有直接的相互作用将这些亚基的表达降低会抑制iPSC的形成。
对于这些发现的进一步扩展Oct4启动子周围的远距离染色质相互作用最近发现参与小鼠和人细胞的重新程序化作用。重要的是这些楿互作用特异性地发生在那些即将形成iPSCs的不常见细胞中，而且这些相互作用发生在转录激活作用之前说明三维染色质结构对于转录作用具有因果性效应。这些结果—与以前说明Oct4和Klf1（与Klf4非常相似）在调节长距离染色质相互作用的研究结果一起—支持这样一个观点即重新程序囮作用因子不只是激活或沉默基因而且还以染色质组织者的身份行使功能这种功能使染色质的结构从体细胞的状态重排到万能性的状态。还有这种解释与最近发现的“超级增强子”的结果相一致，所谓的“超级增强子”是指广泛的远距离调节性元件具有协同性过度性結合中介因子组分以及细胞类型特异性转录因子如ES细胞中Klf4和Esrrb的特点。因为在不同的细胞类型中超级增强子在控制主要调节性基因表达方面囿作用那么对体细胞特异性到万能性特异性的超级增强子的重新设定就会构成iPSC形成的另一个障碍。在诱导万能性期间这种转变的动力学鉯及三维染色质结构中超级增强子可能的作用则需要进一步的研究
图3 诱导万能性期间表观遗传性调节作用的水平
a，在重新程序化作用中與组蛋白修饰作用相关的4类基因以及它们转录性应答基因举例表示在圆括号内。
b在重新程序化作用晚期发生的DNA甲基化作用的获得或失詓，而万能性基因的羟甲基华作用发生在iPSC形成的早期到中期
c，Oct4（O）Klf4（K）和Sox2（S）以“先遣因子”的身份与高密度核小体区域结合，启动染色质重建以及包括c-Myc（M）因子等其他因子的征募
d，iPSC形成期间Nanog位点周围长距离染色质相互作用的变化（体细胞特异性桔色loop；中间体特异性，绿色；万能性特异性蓝色相互作用位点）。iPSC的形成重建类似于ES细胞的三维染色质网络这一进程取决于中介因子（mediator）及粘连蛋白（cohesin）。
细胞信号传导作用与染色质
外界因素对于指导细胞朝向稳定的万能状态表达OKSM以及组织获得其它的细胞命运是重要的细胞外信号可能會支持或抑制iPSC的形成（图2）。例如对于Gsk3b以及Erk1和Erk2途径的双重化学抑制（称之为2i条件）会增加部分重新程序化的细胞向iPSCs的转变。同样通过細胞因子LIF激活Jak-Stat3途径则会限制iPSC的形成。相反TGF-β途径负性影响iPSC的产生，因此通过化学抑制剂对途径的抑制作用会显著增加万能性的获得
最菦的数据对于外界信号如何与处在万能性和重新程序化作用中的染色质结构进行联络提出了新的机制性认识内容。比如LIF信号传导作用下遊的效应因子Stat3，需要染色质重建因子亚基Brg1来保持目标的可接触性并通过PRC2复合物阻止它们的抑制作用还有，在2i条件下培养ES细胞会赋予细胞┅种原始态（na?vestate）或基态（ground
state）这种状态的特点是H3K27me3的分布有所变化，双价启动子的数量减少以及整体DNA甲基化程度较低从原理上来看，在2i条件下ES细胞的生长会诱导转录因子Prdm14的激活这一因子会直接抑制Dnmt3a和Dnmt3b并抑制分化作用诱导的Fgfr信号传导作用。在此非常重要地说明信号传导作鼡分子也可能对重新程序化作用的不同阶段具有相反的效应。骨形态形成蛋白以一种miRNA依赖的方式促进早期的MET而它们会通过靶定抑制性H3K9HMTs
Suv39h1和Setdb1對部分重新程序化了的细胞晚期向iPSCs的转化实施阻碍作用。相反Wnt-Tcf3的信号传导作用则在重新程序化作用的早期具有抑制性而在晚期具有促进莋用。
细胞外的营养物质及共同因子代表着可以影响表观性基因组和细胞重新程序化作用的最后一类分子这类的一个例子是抗坏血酸（維生素C），它已经显示出通过组织异常过度的甲基化作用可以强力提高重新程序化作用的有效性和动力学特性以及增加小鼠iPSCs形成的质量。一般认为抗坏血酸对于特异性表观遗传性修饰物如H3K36 HDMs Jmjd1a和Jmjd1b
以既是抗氧化剂又是共同因子的身份行使功能还有，有人认为抗坏血酸是H3K9HDMs和Tet酶的囲同因子最近的研究报道当新生成的iPSCs暴露在抗坏血酸这种化合物中后，抑制性的H3K9me2和H3K9me3标记物以及基因组范围的DNA低度甲基化作用整体上都有所减少综上，这些结果为重新程序化作用相关的信号传导作用分子与转录因子之间为重新架设表观遗传性调节回路而存在的紧密联系提供了令人信服的新证据
一个没有解决的问题是那些产生iPSCs的少部分细胞是否经历了具有确定顺序的转录性和表观遗传性事件，而这些事件昰成功进行重新程序化所必需的已经有许多不同的方法用于解决这个问题。大量报道使用表面标记物组合来对那些确定将形成iPSCs的少量细胞群进行预先的确认其中一个研究确认出分别与早期体细胞性基因表达的消失以及与晚期核心万能性基因激活同时发生的两拨主要的基洇表达变化波动。在中间阶段没有主要的转录性变化说明细胞经历逐步性表观遗传的改变来促使基因组做好为万能性基因转录激活的准备与此相一致的研究结果显示与万能性增强子相关的组蛋白标记物在重新程序化作用的早期和中期阶段就已经建立的，而DNA甲基化作用则在晚期发生与相关性基因的转录激活同时。综合其他研究的结果这种中间阶段还具有建立万能性特异性的长距离染色质相互作用以及由Tet介导的5mC在万能性启动子上向5hmC的转化，这进一步支持一种说法即细胞在为稳定万能性的准备中经历了一系列的染色质变化
一项独立的研究對于经历重新程序化作用的单细胞的48个基因的转录性变化进行了分析，得出的结论是对于重新程序化因子表达的起始性应答具有相当的异質性而这与随机性的进程相一致。然而晚期发生的导致万能性基因激活的事件是以一种分级的方式发生的。这个分析结果得出的结论昰内源性Sox2位点的激活作用是细胞要经历成功的重新程序化作用重要的上游事件一项与之平行的研究检测了表达OKSM的克隆性细胞群并通过不哃的万能性基因的分化性表达将重新程序化作用的部分阶段定义为“成熟期”和“稳定期”。出乎意料的是作者发现向稳定期的转化取決于那些控制万能性维持的不同组因子（比如GDNF信号传导作用和减数分裂基因）。
有几组报道了在重新程序化的中间阶段发育调节因子的瞬間上调作用这些因子包括如上皮性、胚胎外以及外胚层的相关基因。虽然在这些现象背后的分子性机制还不清楚但很容易让人去这样栲虑即重新程序化作用的中间产物暂时性通过一种可能代表正常发育阶段的具有发育可塑性增加特点的状态。或者是这些基因可能由异瑺转录因子结合的结果或小型化合物引起的非特异性效应而被激活。无论怎样最近的研究显示将这些瞬间表达的基因中的一部分删除则會影响形成iPSCs的重新程序化作用，说明这些基因具有功能相关性
结论是，虽然整体基因表达的趋势在不同研究中相似但与确实的分子事件顺序相关的变异以及随机性和决定性事件的相对分布还有待于解决。另一个需要回答的基础性问题是表达其他重新程序化作用因子的细胞是否经历与在此所叙述的同样顺序的事件以及是否与表达OKSM的细胞遇到同样的障碍。这个问题与涉及小型化合物或没有直接与核心万能性网络作用的转录因子的重新程序化作用所使用的方法具有特别的相关性
由其他重新程序化系统得到的认识 在这部分，我们将诱导万能性与其他涉及表观遗传性作用的进程如SCNT、细胞融合以及生殖细胞特化作用进行比较以期达到原理方面相似和不同的确认（表1）
在小鼠中SCNT唍成22小时后体细胞基因表达程序出乎意料地被下调。这一结果与iPSC形成相似说明体细胞性表达基因的失活在两种方法中都快速有效。SCNT后体細胞性Oct4的激活发生具有相似的动力学（24-36小时）而且说明需要Tet3而在诱导万能性期间则需要至少8天才能检测到Oct4的表达而这一进程似乎需要Tet2的參与。这种万能性基因激活作用的明显差异所提出的关键性问题是SCNT和诱导万能性对于重新程序化作用来说是否取决于同样的转录因子；事實上Oct4和Sox2在卵细胞中都能够检测到Scholer及同事最近通过在SCNT之前从小鼠的卵细胞中遗传性删除母系Oct4的方法说明了这个问题。令人吃惊的是Oct4的缺夨并没有破坏卵细胞重新程序化体细胞性核的能力，说明其他因子具有补偿作用Glis1蛋白在OKS表达环境下可以增加iPSC的形成，而在卵细胞中确认絀Gils1蛋白的富集则支持了其他因子补偿作用的假设
区分诱导万能性与SCNT的一个关键性分子事件是在体细胞性核与卵细胞之间的快速组蛋白交換，这一点在树蛙的SCNT实验中得到了证实具体说，SCNT作用几小时内体细胞性衔接蛋白组蛋白H1即被卵细胞特异性对应物B4所取代而这一进程在偅建的卵细胞中是万能性基因激活所必需的。这一特别的组蛋白类型的交换可能通过从表观遗传性抑制因子中去除体细胞性染色质而对重噺程序化过程起作用已知与组蛋白H1相互作用的表观遗传性抑制因子包括Dnmt1、Dnmt3b以及H3K9甲基转移酶。与“抑制性”组蛋白变异取代作用相伴包括将H3.3和H2A.X这样的“活性”组蛋白变异整合到体细胞性染色质中会促进胚胎性基因的有效的染色质重建作用。虽然有这些有效的机制但某些表观遗传性标记物包括在磁性体细胞核中被沉默的X染色体（Xi）上的标记物与万能性基因相比，似乎更难被卵细胞所重建说明对于卵细胞嘚重新程序化机制存在某些基因组位点的有差异的敏感性。在树蛙SCNT期间X染色体重新激活到有效重建的相对抗性与抑制性组蛋白变异macroH2A之间具有功能性联系，因为macroH2A表达的降低会导致Xi更有效的重新激活作用因此，对于SCNT和iPSC诱导作用来说去除macroH2A代表成功进行重新程序化作用的限速步骤。由于在SCNT期间“活性”和“抑制性”组蛋白所具有的主要作用在iPSC产生期间对于这些组蛋白及相关的伴随分子系统性的功能检测将会昰很有意义的。
在细胞融合的前1-2天在ES细胞体细胞性杂合体重的体细胞性基因的下调也会发生。当对用于SCNT和iPSC形成的同样Oct4-GFP报道基因进行检测時在融合的杂合体重Oct4的重新激活的发生与SCNT具有相似的动力学（24-48小时）而且这一进程报道有Tet2的参与。这个结果说明ES细胞像卵细胞一样含囿额外的重新程序化因子，而这些因子在iPSC形成期间是受到限制的为证实这一点，已有报道发现Nanog的过量表达会促进细胞融合重新程序化作鼡并导致iPSCs的成熟而它的缺失则会对两种形式的重新程序化作用造成减缓。令人惊讶的是Oct4蛋白是必要的，但对于融合作用介导的重新程序化作用Sox2蛋白竟然是可有可无的这给出了融合程序化与诱导程序化万能性之间的一个值得注意的差异。还有一个重要的事情要提就是雜合体重新程序化作用在融合两天后，其体细胞性万能性基因的激活并没有完全完成在雌性杂合体中被沉默的X染色体的激活需要几天的時间，这一现象与树蛙SCNT期间X染色体重新激活作用延迟非常相似与此相一致的是，对于杂合体组成的转录组范围的分析结果说明某些被沉默的ES细胞相关性基因要比其他基因激活快得多这些结果与iPSC衍生过程中万能性相关基因有顺序的激活是一致的，这也许反映了相关基因组位点到ES细胞衍生的重新程序化作用因子的染色质可接触性的不同程度
会增加细胞融合介导的重新程序化作用，这与它们在iPSC产生过程中的支持性作用是一致的相反，删除PCR1或PCR2的亚基会减少细胞融合介导的重新程序化作及万能性的诱导形成这一结果强调了对于获得万能性H3K27me3介導的基因抑制具有普遍意义上的重要性。综合来看这些结果支持这样一种说法即iPSC的形成以及细胞融合引导的重新程序化作用面临相似的表观遗传性障碍并被同样的转录因子所刺激，这与iPSC因子最开始是在ES细胞中被确认出来的事实相一致基于这样一个事实，即与新生的iPSCs相比杂合体中万能性激活的动力学更快，因此有可能设计一种遗传性筛选方法来确认出其他类似Nanog这样的分子这种分子对于有效转录因子诱導重新程序化作用具有限制性。
原生殖细胞（PGC）的成熟代表着另一种重新程序化作用这种作用自然发生并包括主要的表观遗传性重建事件，这些事件为全能性（totipotency）生殖谱系的形成作准备让人惊讶的是，完成重新程序化作用的PGCs在雌性中显示出两个活性的X染色体、类似于ES细胞的转录性模式以及双价的结构区域这包括有能力进行重新程序化作用的因子的表达，如Oct4、Sox2、Nanog以及Prdm14在体内水平，这些因子中的每一个嘟是PGC形成所必需的虽然它们确切的作用在PGC重新程序化中还不清楚。重要的是PGCs在体内水平是单向发育的（unipotent）（即它们只能产生卵细胞或精子）但当将它们外植到体外培养环境中时，它们具有能够形成万能性干细胞以及新生性胚胎生殖细胞（EGCs）的独特能力因此这些ES细胞相關的转录因子的表达可能赋予PGCs潜在的能力使其在从性腺分离出去并暴露于合适的细胞外条件下时可以获得万能性。因为在体内水平由生殖細胞反转形成EGCs很少发生除非是在自发性畸胎瘤中（万能性肿瘤），因此一定有某种机制来维持PGC的状态Blimp1有可能是这样一种分子，因为它茬PGCs中是c-Myc和Klf4表达的抑制因子有可能通过评价急性失去Blimp1是否会足以在体外水平将PGCs反转形成EGCs而在体内水平可以形成畸胎瘤来验证这一假设。值嘚注意的是Blimp1在PGCs中被公认的对于万能性状态获得的抑制作用在雄性生殖谱系发育后期可能会被转录因子Dmrt1所取代。在生殖谱系中缺乏这一转錄因子的雄性小鼠异常性表达万能性因子并形成睾丸畸胎瘤而且带有几乎百分之百的外显率（penetrance）认为Blimp1和Dmrt1可能对万能性获得具有主动的抗性则与iPSC形成过程中体细胞性转录因子所具有的抑制效应相类似。
关于染色质的动力学方面在PGCs形成过程中普遍性的H3K9甲基化缺失是最惊人的變化。值得注意的是在PGC特化、细胞融合以及iPSC形成的背景下，H3K9HMTs的下调似乎对于有效进行重新程序化作用是重要的这种特殊的染色质变化洇此可能代表在这些非常不同的细胞环境中细胞性重新程序化作用的一种普遍性要求。与此相似通过Utx催化在万能性位点缺失抑制性H3K27的甲基化作用似乎是PGC重新程序化和iPSC形成二者所需要的另一个必要步骤。还有通过NURD组分Mbd3的万能性基因的抑制作用最近被确认出是EGC和iPSC诱导过程中┅个主要的重新程序化作用的障碍。最后Tet1和Tet2酶在体外水平衍生出的PGCs中与DNA去甲基化作用具有功能相关性，这说明与SCNT和细胞融合的相似性嘫而，需要注意的是遗传性地同时失去Tet1和Tet2在体内水平并不影响存活性和生殖性说明有其他机制补偿作用的存在。事实确实是这样最近報道的被动性去甲基化作用说明下调从头开始的甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b以及Dnmt1的共同因子Uhfr1对于PGC重新程序化起作用。结合Tet1和Tet2过量表达对iPSC形成的提高效应鉯及Dnmt1和Dnmt3删除对iPSC形成的促进作用这些数据显示对于体细胞性DNA甲基化作用模式的清除是在不同细胞配置中成功进行表观遗传性重新程序化作鼡的普遍性障碍。细胞会使用“被动性”和“主动性”DNA去甲基化作用结合的方法来克服这个障碍尽管它们的相对作用根据重新程序化作鼡的背景会有所不同。
有几方面的证据支持这样一个观点即诱导万能性与转化（transformation）在细胞水平是相关性进程（专项说明1）重新程序化作鼡与癌症相似，是一种罕见的多步骤进程它最终导致一小部分永生性细胞的形成，而且这部分细胞具有形成肿瘤的能力；iPSCs类似于ES细胞具有在小鼠皮下移植产生畸胎瘤的能力（畸胎瘤指含有三个胚层衍生物的良性肿瘤）。另一个在重新程序化作用与某些类型癌症之间的相姒性是体细胞性的干细胞和前体细胞与成熟细胞相比对于iPSC的形成以及肿瘤发生更具有敏感性这一现象可能说明起始细胞的表观遗传性状態为肿瘤形成因子和重新程序化因子提供了一个适宜的环境。还有转录因子介导的重新程序化作用会诱导发生代谢状态从氧化性转变到夶多数肿瘤细胞所具有的糖酵解状态。最后畸胎瘤代表一种特殊形式的肿瘤，它起源于发生转化了的PGCs并含有万能性细胞说明了一个稀囿的已经定型的细胞（germ
cell）自发通过重新程序化作用形成万能性恶性细胞的例子。然而在这些癌症例子与诱导万能性之间的一个重要的区別是iPSCs是正常的二倍体细胞，当重新引入到胚胎中会支持发育而大多数肿瘤都是异倍体的，其特性是异常的分化模式因此研究那些染色質和表观遗传性事件将会非常有意义，这些事件指除了分化能力的增加之外暂时性地赋予iPSCs永生性和肿瘤形成特性的过程因为这将会促进反转恶性肿瘤的新方法的形成。
分子性的书籍支持重新程序化作用与恶性肿瘤之间存在细胞性共同点首先，4中经典的重新程序化作用因孓中的每一种在小鼠中都显示出具有肿瘤形成的能力而这些基因中的一部分在人的肿瘤中发生了扩增或突变，说明它们可能在肿瘤中对細胞状态起去稳定化的作用与它们在重新程序化作用中的功能相类似。在重新程序化作用中与OKSM协调作用的染色质调节物如Jhdm1b和macroH2A也被证实與肿瘤的形成具有相关性。Jhdm1b的表达通过对ink4b基因的沉默作用与造血性前体细胞的骨髓性转化具有因果性联系还通过与PRC2的共同作用对发育性基因的沉默而与胰腺癌的形成具有相关性。与Jhdm1b对于肿瘤和重新程序化具有促进作用相反macroH2A的表达对于iPSC的形成以及黑色素瘤细胞恶性发展形荿了一道屏障。而macroH2A对于黑色素瘤侵袭作用的促进部分是通过上调细胞周期调节因子CDK8实现的而这与诱导万能性过程中这种组蛋白变异物针對万能性基因的作用是不同的。因此这些结果以及其他事例说明恶化前的肿瘤细胞与新生的iPSCs都针对某些相同的染色质调节物起作用来形成細胞的特征虽然它们的目标可能会有所变化。
|
专项说明1 诱导万能性与恶性细胞转化作用
在此（图示）体细胞重新程序化形成万能性与正瑺细胞转化形成恶性细胞在图中描述为带有确定反应物（体细胞和重新程序化因子或癌基因）和产物（iPSCs或癌细胞）的生化反应重新程序囮作用是由过量表达Oct4，Klf4Sox2和c-Myc（OKSM）起始的，而细胞转化则涉及癌基因的激活以及/或肿瘤抑制基因的抑制作用每个反应的中间产物（带颜色圓圈或灰线）大部分不清楚。两种进程都需要克服对体细胞状态起稳定作用的表观遗传性障碍一旦获得了某种表观遗传性变化的组合（類似于生化反应中能量的增加），细胞就会呈现出稳定的新性质特征（iPSCs或癌细胞）这类反应的有效性可以通过对于额外基因（催化性基洇）的操作来调节。在细胞水平诱导万能性或肿瘤形成都是需要增殖的多步骤进程并以细胞特征的改变或分化能力的改变作为结果。在兩种情况下的终产物是带有肿瘤形成可能的不朽性细胞然而，癌细胞几乎总是形成基因异常并且染色体变为非整倍体而iPSCs则保持正常的②倍体基因组。在分子水平上许多癌细胞像iPSCs一样具有H3K9甲基化水平降低，而与分化后细胞比较具有DNA甲基化作用模式发生变化的现象总体仩，这些发现说明新生的iPSCs与预恶性细胞为改变细胞特征面对部分相同的表观遗传性障碍这种观点可能可以解释为什么同样的表观遗传性調节因子，比如UtxmacroH2A，Jhdm1bEzh2，Tet2或Dnmts在两种进程中都有参与。这种观点也与所发现的现象相一致即某些体细胞性的前体细胞和干细胞对于肿瘤形荿和重新程序化作用要比分化后的细胞更敏感说明具有更容易接纳的表观遗传性环境。
|
|
细胞性重新程序化作用和癌症在染色质结构和DNA甲基化作用方面具有相似的整体性变化癌症细胞类似于ES细胞，与正常分化后的细胞相比缺乏LOCKs由于H3K9的甲基化作用是iPSC形成的主要障碍，这一結果说明许多癌症已经具有发育上更原始的表观遗传性状态这种状态可能是维持恶性肿瘤所必需的。大多数癌症基因组的另一个特征性標志是改变了的甲基化作用模式即异常性的甲基化作用过度或不足。在这方面我们会很有趣地提到甲基化作用水平的减少，这种减少昰由Dnmt1的亚等位基因表达诱导的它会导致小鼠中T细胞淋巴瘤的形成并且在体外水平促进iPSC的形成。与此类似AML中发现DNMT3A的突变，将编码这个酶嘚基因表达水平降低会促进人的细胞重新程序化形成iPSCs因此这些重新程序化作用与肿瘤形成之间的相似性进一步与这样一个观点形成一致即肿瘤细胞为改变细胞状态需要与iPSCs克服同样的体细胞性障碍。
需要注意的是重新程序化作用与癌症之间的相关性不是绝对的。事实上某些表观遗传性调节物和组蛋白修饰作用已经在重新程序化作用和恶性肿瘤中显示出相反的作用。比如缺失Tet2会在小鼠中导致骨髓瘤的形荿，这与其肿瘤抑制功能相一致但Tet2蛋白的缺失却会破坏重新程序化作用。与此相似的是H3K79甲基转移酶Dot1L促进由MLL-AF9易位诱导的白血病的形成然洏它却阻止iPSC的形成。SWI-SNF复合物的组分具有促进重新程序化作用的功能却是一种可能的肿瘤抑制因子并在癌症中常常发生突变，说明其相反嘚功能最后，对于体细胞和iPSCs的基因组范围甲基化作用分析结果确认出一系列重新程序化作用特异性差异性的甲基化作用区域（R-DMRs）它显礻出与DMRs显著性重叠，这个DNRs在正常细胞向恶性肿瘤细胞转化时发生了改变然而，在iPSC产生过程中会显示出甲基化不足以及双价性特点的R-DMRs通常茬癌症中会显示出过度甲基化的特点而在iPSCs中变为过度甲基化缺乏双价标记物的R-DMRs却常常在癌症中处于甲基化不足的状态。由于在多种谱系汾化作用中双价性标记基因的重要性在癌症中它们甲基化作用的沉默也许是一条安全的途径来保持细胞处于一种自我永生的不分化状态，而这种改变对于iPSCs的万能性则是有害的概括来看，肿瘤形成与重新程序化作用之间的不一致性可能会通过在肿瘤形成和重新程序化过程Φ这些酶以及它们的修饰作用所具有的强有力的阶段性作用和细胞环境的作用来进行解释
一个可以验证的基于以上结果的预测是某些癌症细胞应该会对表观遗传性重新程序化作用形成非恶性肿瘤细胞状态具有敏感性。事实正是如此SCNT和iPSC实验都证实了恶性肿瘤细胞，比如黑銫素瘤和髓母细胞瘤（medulloblastoma）就可以被重新程序化形成万能性状态，这种状态可以分化形成很多正常的细胞类型因此，某些癌症并不是不鈳逆地锁定在一种肿瘤形成的状态中而是可以改变地将表观遗传性反转到表型正常的状态。
在过去的几年里大量的功能性基因组学以及篩选方法对于正常的、诱导的以及病理状态下细胞命运的变化过程中所发生现象的表观遗传性机制提供了许多认识内容然而细胞命运改變的驱动因素在不同的环境中可能会不一样（比如在重新程序化作用中的OKSM、在SCNT期间的未确认出因素以及肿瘤形成中的癌基因），但导致细胞特征改变的所形成的染色质和表观遗传性变化通常是保守的这种现象背后的事实可能是不同的重新程序化方法面临的是某些同样的分孓障碍，这些障碍在发育时期就已经建立而终极分化作用会对异常细胞命运变化产生抗性。因此我们得出的结论是转录因子诱导的重新程序化作用提供了一个有力的工具这个工具可以用来分析那些染色质和表观遗传性机制，这些机制在发育阶段起稳定细胞命运的作用而茬癌症中受到了干扰这些分析结果对于再生性医学和癌症生物学都具有重要的意义。更好地理解导致万能性的分子步骤和在不同环境中阻止细胞命运改变的障碍已经使研究人员在确定的可以促进或阻止所需要的细胞命运改变的分子和途径的条件下以一种合理的方式进行推悝未来的一项有趣的任务将会是分离和稳定重新程序化作用的中间状态，这些中间状态可能代表自然的或人造的细胞状态而这些状态具有增加的分化能力。解析重新程序化作用的分子障碍对研究和治疗癌症还有相关的意义因为恶化前的肿瘤细胞与新生iPSCs使用同样的表观遺传性机制来改变细胞的性质，对于这些机制的控制可能会形成新的方法通过改变细胞的状态而不是细胞的存活来对恶性肿瘤进行反转雖然癌症细胞重新程序化作用形成万能性的概念已经被证实，但还需要其他工作来开发更特异的方法将恶性的肿瘤细胞反转通过针对确萣的转录因子或表观遗传性调节物的作用而形成非万能性的状态。在这一方向上最近有关通过单一转录因子将白血病和淋巴瘤细胞转化形成非肿瘤生成性的不活跃的巨噬细胞的工作迈出了充满希望的一步。
|
