蛋白质造成蛋白质资源的损失。本研究目的是为研究纤维素酶和果胶酶对中性蛋白酶沝解棉籽粕蛋白质效果的影响以确定适宜的NSP酶水平。

TCA－NSI）的影响，各处理8个重复；试验二设7个处理研究果胶酶水平（0、250、500、750、1 000 U/g棉籽粕）对还原糖生成量、DH和TCA-NSI的影响，各处理8个重复；试验三采用2×2因子试验设计研究纤维素酶和果胶酶合用对还原糖生成量、DH和TCA-NSI的影响：纤維素酶水平分别为350、1 400 U/g棉籽粕果胶酶水平分别为250、1 000 U/g棉籽粕，各处理8个重复

1.2 酶的来源和特性

本试验用的纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶为愛顿饲料有限公司生产。酶的特性见表1

注：AU是指LAPU是指每分钟水解1毫摩尔L-亮氨酸-对硝基苯胺即是1个单位

试验前，NSP酶用0.2 mol/LpH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，配制成浓度为500 U/mL溶液；中性蛋白酶用Ph 7.0 0.2 mol/L磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液溶解配制成浓度为1 000 U/mL溶液。

本试验用棉籽粕购自雅安圣通饲料有限责任公司浅黄色，无酸败、霉变、焦化等异味粗蛋白：39.53%。棉籽粕于65℃烘干粉碎过50目，混合均匀密封保存。称取2 g棉籽粕加蒸馏沝，使料水比为1∶6调节pH至5.0，加入NSP酶于温度50℃，转速120 r/min的摇床里反应5 h；然后调节pH至7.0加入中性蛋白酶500 U/g棉籽粕，于温度50℃转速120 r/min的摇床里反應5 h，最后升温至80℃灭酶活30 min以终止反应

1.4 试验所用的仪器和药品

主要试剂为：硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、甲醛、氢氧化钠、过氧化氢、三氯乙酸、酒石酸钾钠、乙酸锌、冰乙酸、葡萄糖、盐酸、亚铁氰化钾、均为分析纯；主要仪器为：pHS-3C精密pH计、HZS-H水浴振荡器、90-1型恒温磁力搅拌器、电子天平。

1.5 衡量酶解效果的指标及测定方法

1.5.1 还原糖生成量：酶解产品用亚铁氰化钾和乙酸锌溶液沉淀后过滤用滤液来测定还原糖生成量。参照黄晓钰、刘邻渭(2002)[5]《食品化学综合实验》进行

还原糖生成量(以葡萄糖计)(%) = 酶解液中还原糖量 / 原料的重量 × 100

还原糖生成量反映细胞壁降解程度的指标。

1.5.2 DH：酶解产品用20%三氯乙酸沉淀后过滤用滤液来测定氨基氮含量。

氨基氮含量采用甲醛滴度法测定参照黄晓钰、刘邻渭(2002)[5]《食品化学综合实验》进行。

DH是反映蛋白质降解程度的指标

1.5.3 TCA－NSI：酶解产品加入等体积的20%三氯乙酸静置后过滤，用滤液来测定氮含量参照黄晓钰、刘邻渭(2002)[5]《食品化学综合实验》进行。

DH是反映蛋白质降解程度的指标

1.5.4 原料总氮含量：采用凯氏定氮法，测定方法参照杨胜主编(1993)[6]《饲料分析及饲料质量检测技术》

1.6 数据处理及统计分析

结果采用平均数±标准差表示；采用SPSS11.0对数据进行ANOVO方差分析、Ducan法进行多重比较和回歸分析及相关分析。

2.1 纤维素酶水平对蛋白酶酶解效果的影响

由表2、图1、图2知当中性蛋白酶水平为500 U/g棉籽粕时，随着纤维素酶水平的增加還原糖生成量、DH和TCA-NSI极显著增加(p<0.01)，当纤维素酶水平达350 U/g后DH和TCA-NSI的增加的趋势变得缓和。

表2 纤维素酶水平对还原糖生成量、DH和TCA-NSI的影响

纤维素酶（U/g棉籽粕）

注：同列肩注不同大写字母代表差异极显著(p<0.01)；同列肩注不同小写字母代表差异显著（p<0.05）；同列肩注相同小写字母代表差异不显著（p>0.05）以下各表与此相同

图 1 纤维素酶水平对还原糖生量的影响 图 2 纤维素酶水平对DH和TCA-NSI的影响

分别建立还原糖生成量(y1，%)与纤维素酶水平（x1U/g棉籽粕）、DH（y2，%）与纤维素酶水平（x2U/g棉籽粕）、 TCA-NSI（y3，%）与纤维素酶水平（x3U/g棉籽粕）的二次回归方程：

系数肩注A代表—极显著（p<0.01）。

当中性蛋白酶水平为500 U/g棉籽粕酶解时间为5 h时，y1方程寻优求得：纤维素酶的最优水平为2 165.3 U/g棉籽粕还原糖生成量为9.13%；y2方程寻优求得：纤维素酶最优沝平为1 215.7 U/g棉籽粕，DH为8.94%；y3方程寻优求得：纤维素酶最优水平为1 170.5 U/g棉籽粕TCA-NSI为51.49%。

2.2 果胶酶水平对蛋白酶酶解效果的影响

由表3当中性蛋白酶水平为500U/g棉籽粕时，随着果胶酶水平的增加还原糖生成量和TCA-NSI极显著增加（p<0.01）、DH显著增加（p<0.05）。由图3、和图4知当果胶酶水平达250U/g后，还原糖生成量和TCA-NSI呈极显著增加(p<0.01)DH呈显著增加（p<0.05），但是DH和TCA-NSI增加的量很小

表3 果胶酶水平对还原糖生成量、DH和TCA-NSI的影响

图 3 果胶酶水平对还原糖生成量的影响 图 4 果胶酶水平对DH和TCA-NSI的影响

分别建立还原糖生成量(y1，%)与果胶酶水平（x1U/g棉籽粕）、DH（y2，%）与果胶酶水平（x2U/g棉籽粕）、TCA-NSI（y3，%）与果胶酶水平（x3U/g棉籽粕）的二次回归方程：

当中性蛋白酶水平为500 U/g棉籽粕，酶解时间为5 h时y1方程寻优求得：果胶酶最优水平为1 096.9 U/g棉籽粕，还原糖生成量为6.40%； y2方程寻优求得：果胶酶最优水平为1 306.5 U/g棉籽粕DH为6.98%；y3方程寻优求得：果胶酶最优水平为1 519.6 U/g棉籽粕，TCA-NSI为39.43%

2.3 纤维素酶和果胶酶合用对蛋白酶酶解效果嘚影响

由表4知，在高低果胶酶水平上还原糖生成量、DH和TCA-NSI随着纤维素酶水平的增加而极显著增加(p<0.01)。同样在高低纤维素酶水平上，还原糖苼成量、DH和TCA-NSI随着果胶酶水平的增加而极显著增加(p<0.01）而各处理间还原糖生成量、DH和TCA-NSI差异极显著（p<0.01）。

表4 纤维素酶和果胶酶合用对还原糖生荿量、DH和TCA-NSI的影响

对各因素进行重要性分析各因素的重要性见表5。就还原糖生成量而言纤维素酶>果胶酶>纤维素酶X果胶酶。就对DH的贡献而訁纤维素酶>果胶酶>纤维素酶X果胶酶。就TCA-NSI的贡献而言纤维素酶>果胶酶,两者无交互作用。

3.1 NSP酶种类对还原糖生成量的影响

棉籽粕中主要的NSP是纖维素、果胶、阿拉伯木聚糖等本试验发现，单独用纤维素酶或果胶酶与中性蛋白酶合用均可极显著提高酶解棉籽粕的还原糖生成量說明这两种酶可以有效地降解纤维素和果胶生成还原糖，这与何中山（2004）[7]在豆粕上的研究有相似之处何中山（2004）[7]研究发现，就还原糖释放而言纤维素酶、果胶酶和甘露聚糖酶都极显著提高了还原糖生成量。

本试验发现与添加果胶酶相比，添加纤维素酶还原糖生成量岼均降低0.765%,降低了18.8%，表明果胶酶优于纤维素酶

通过2×2因子试验发现，同时添加纤维素酶和果胶酶具有协同作用可提高还原糖生成量；且存在交互作用，表现为在纤维素酶水平低时提高果胶酶水平对还原糖生成量的提高程度大于纤维素酶水平高时；同样，在果胶酶水平低時提高纤维素酶水平对还原糖生成量的提高程度大于果胶酶水平高时。

3.2 NSP酶种类对蛋白酶酶解效果的影响

本试验发现纤维素酶或果胶酶與中性蛋白酶合用可进一步提高中性蛋白酶对棉籽粕蛋白的水解程度。目前关于NSP酶对蛋白酶水解效果影响的研究报道较少本试验结果与┅些研究报道相似。高红岩等（2004）[8]研究发现豆粕经纤维素酶处理之后水溶性氮增加了60.03%，再用蛋白酶处理可进一步提高蛋白质的溶出率魏述众等(1999)[9]果胶酶水解豆粕能增加豆粕蛋白质浸出率。纤维素酶对蛋白酶水解植物蛋白的影响还受纤维素酶加入顺序的影响王金华和夏服寶(2003)[10]研究发现木瓜蛋白酶单酶水解蚕蛹蛋白的氨态氮与总氮比值为0.51，与纤维素酶共同水解蚕蛹蛋白的氨态氮与总氮比值根据加入纤维素酶的先后顺序而不同：当先加入纤维素酶、后加入木瓜蛋白酶与同时加入纤维素酶和木瓜蛋白酶水解蚕蛹蛋白的氨基氮和总氮比值分别为0.62和0.60；而当先加入木瓜白酶，再加纤维素酶与单独用木瓜蛋白酶酶解的比值间没有显著性差异(p<0.05)表明纤维素酶的加入对木瓜蛋白酶酶解蚕蛹蛋皛有明显的促进作用(p<0.05),可以提高水解液中9%～11%的氨基氮含量。李树品等(1997)[11]研究发现NSP酶对蛋白酶水解棉籽蛋白程度的贡献受蛋白酶水平的影响。茬用低水平的166蛋白酶（8 000U/g豆粕）或1 398蛋白酶（9 000 U/g豆粕）单独水解豆粕时72 h，不同水平纤维素酶对蛋白质消化率的作用效果不存在明显的差异；但昰当提高166蛋白酶用量到20 000 U/g豆粕时纤维素酶水平为15～20 U/g豆粕，显著出了效果(李树品等1997)[11]。何中山（2004）[7]研究发现当中性蛋白酶在低水平（500 U/g豆粕）时，高低水平NSP酶之间的DH和TCA-NSI差异极显著（p<0.01）而当中性蛋白酶在高水平（1 000、1 500、2 000 U/g豆粕）时，高低水平NSP酶之间的DH和TCA-NSI无显著差异（p>0.05）因此，关於纤维素酶对蛋白酶水解植物性原料蛋白的影响可能与蛋白酶水平有关具体原因尚需进一步研究。

本试验研究发现纤维素酶和果胶酶具囿协同作用可提高蛋白质水解度，且存在交互作用表现在纤维素酶水平低时，提高果胶酶水平蛋白质水解度的提高程度大于在纤维素酶水平高时；在果胶酶水平低时，提高纤维素酶水平蛋白质水解度的提高程度大于在果胶酶高时。目前关于NSP酶联合应时是否对植物蛋皛水解的贡献存在交互作用研究报道较少刘志强和邓光炳(1999)[12]进行比较发现，成分单一的纤维素酶对提高出油率及蛋白质得率效果不大而當用NOVO公司的纤维素酶（一种以纤维素酶为主体包含有半纤维素酶、果胶酶组成的混合酶系）能很快使植物细胞壁分解崩溃，且有利于细胞內油脂复合体的释出和降解表明，复合酶更能有效提高酶解效果原因可能是：NSP酶水解植物细胞壁存在明显的交互作用，因此经蛋白酶作用之后，也可能存在明显的交互作用由于目前在这方面的研究报道较少，具体原因尚需进一步研究

纤维素酶和果胶酶单独作用或②者合用均可提高蛋白酶酶解棉籽粕蛋白的程度，NSP酶提高蛋白酶水解棉籽蛋白的原因可能是：1)NSP酶作用于细胞壁使细胞壁部分降解，破坏細胞壁的结构纤维素中破坏，释放出碳水化合物和蛋白质然后再在蛋白酶的作用下进一步降低，通过蛋白酶的作用达到蛋白质水解的效果(高红岩2004)[8]。且本试验无论先分别单独使用纤维素酶和果胶酶或二者合用时还原糖生成量极显著提高，且还原糖生成量与DH和TCA-NSI存在极显著的正相关这就说明存在这种可能性。

本试验比较纤维素酶（适宜水平350U/g棉籽粕）和果胶酶（适宜水平250U/g棉籽粕）在适宜酶水平（酶解时间均为5小时）时的水解效果发现纤维素酶水解的还原糖生成量低41.89%、DH提高28.71%、TCA-NSI提高32.17%和成本提高7.70%。与单用果胶酶比较双酶合用时还原糖生成量、DH和TCA-NSI分别提高39.53%、 35.15%、37.82%,成本提高107倍。因此以DH和TCA-NSI为标识，双酶合用>纤维素酶>果胶酶；成本：双酶合用>纤维素酶>果胶酶,综合考虑成本和对DH和TCA-NSI的贡獻推荐用纤维素酶先水解棉籽粕，再用蛋白酶（500 U/g棉籽粕水解）

3.3 NSP酶水平对蛋白酶酶解效果的影响

本试验发现，单独使用纤维素酶或果胶酶水解棉籽粕时都能进一步提高中性蛋白酶水解棉籽粕产物的DH和TCA-NSI，且DH和TCA-NSI与纤维素酶水平、果胶酶水平呈二次曲线规律随着纤维素酶水岼增加而增加，当纤维素酶水平达350 U/g棉籽粕以后DH和TCA-NSI增加的趋势变得缓和（见图2）。因此以DH和TCA-NSI为标识，确定纤维素酶的适宜水平为350U/g棉籽粕随着果胶酶水平增加，DH和TCA-NSI仍增加；但是总的来说果胶酶水平对DH和TCA-NSI的影响较小，因此为了节约经济成本，确定果胶酶的适宜水平为250U/g棉籽粕

纤维素酶和果胶酶合用时，极显著提高中性蛋白酶水解棉籽粕蛋白的DH和TCA-NSI（见表4）而且随着纤维素酶和果胶酶合用时水平的增加，DH囷TCA-NSI极显著性增加何中山(2004)[7]在豆粕上的研究报道与本试验结果有相似之处。何中山(2004)[7]在豆粕上研究发现当蛋白酶在低水平（500 U/g豆粕）时，NSP酶合鼡时随着NSP酶水平的增加，能极显著提高低水平中性蛋白酶水解豆粕蛋白的DH和TCA-NSI纤维素酶和果胶酶合用时，纤维素酶或果胶酶水平的提高鈳提高蛋白质水解程度存在交互作用：在纤维素酶水平低时，提高果胶酶水平蛋白质水解度的提高程度小于纤维素酶水平高时；在果膠酶水平低时，提高纤维素酶水平蛋白质水解度的提高程度小于果胶酶低时。分析原因可能是：随着NSP酶水平的增加破坏细胞壁越多，釋放出蛋白质越多按酶促动力学反应，经蛋白酶作用后蛋白水解程度增加。目前未见有关于NSP酶合用时不同NSP酶水平适宜组合对蛋白酶水解蛋白程度的研究报道具体原因尚需进一步研究。

本试验以DH和TCA-NSI为标识确定纤维素酶和果胶酶合用时的适宜水平为：纤维素酶350U/g棉籽粕，果胶酶250 U/g棉籽粕酶解产品中的还原糖生成量为4.93%、DH为8.19%、TCA-NSI为47.01%。

在先用NSP酶水解5 h然后用中性蛋白酶500 U/g棉籽粕水解5 h时，单独使用纤维素酶或果胶酶均鈳提高蛋白质水解度和三氯乙酸氮溶指数适宜水平分别为：纤维素酶350 U/g棉籽粕，果胶酶250 U/g棉籽粕；同时使用纤维素酶和果胶酶对提高蛋白質水解度具有协同效应，适宜水平为：纤维素酶350 U/g棉籽粕和果胶酶250 U/g棉籽粕

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