&p&我应该算是兼职老司机了，从高中毕业之后就踏上了兼职之路，大学除了学费，基本没找家里要过钱。首先说明我是一个学历不高，也没有在某方面有特长的一个普通人，所以这里说的兼职都是我做过、适合普通人，没有什么门槛的。兼职的路上肯定会遇到很多骗子，但好在没被骗成功过，所以当遇到天上掉馅饼这种事的时候，还是看看这馅饼有没有毒吧！&/p&&p&我做过哪些兼职：&b&服务员、促销员、发传单、黄牛党、开过宿舍小卖部，卖过护肤品，还开过淘宝店，做过人力资源中介等&/b&，记住的就这些，有的已经想不起来了。&/p&&p&希望我踩过的坑你们别踩，也给大家提供一些思路。&/p&&p&我高中没有好好读书，上了个专科学校，学费还不低，一年要一万五左右。所以怀着愧疚和要强的心情，在高考完的当天，我就拉着行李箱跟同桌借了400块钱，从我们那个小县城直奔成都了。&/p&&p&到了成都东站，看着这个繁华的城市，我懵逼了。除去到成都的路费，身上只有350块了，这钱住旅馆也只能住2天，想了想只有跟在成都的发小打了电话，她接到电话就立马从茶店子到成都东站来接我了，然后我就在她家住下了。第二天起床我就慌着出去找工作了，虽然发小和她家人都很热情，但是我性格很要强，觉得一直住别人家也不太好。&/p&&p&所以当时找工作就想着能找一个包住的，再加上我读书读的小，高中毕业都还没有满18岁，所以留给我的选择非常少，无非就是服务员、茶楼小妹。可是就算是去找这类工作，我还是一直被拒绝。很多人都因为未满18这个原因不敢要，还有很多觉得我就是去打暑假工的懒得培养，（我确实是去打暑假工的）。&/p&&p&找了整整一个星期都没有人要我，后来在又面试了一家餐馆服务员被拒之后，我鼓起勇气跟老板说，能不能让我试一天，你觉得我行就让我留下，要是不行我就走人也不要工资。老板上下打量了我一番问：“你这么小是不是还在读初中？不是来打暑假工的吧？”我学乖了，赌咒发誓跟老板保证：我初中毕业都好几年了，初中毕业就出来打工了，怎么可能是来打暑假工呢。于是我就这样开始了我人生中的第一份工作。&/p&&p&服务员的工作，就是招呼客人、点菜、收拾桌子、打扫卫生。因为我太想得到这份工作了，所以我去试用的那天，花了一个小时就记住了所有桌子的号牌和位置，以及菜单的价格。这在老板看来简直不可思议，因为他招的服务员起码要三天才能记下这些，其实我就是个学渣，不然也不会只考了个专科，只是服务员的整体水平偏低所以让老板觉得我很聪明，再看我干活也麻利于是愉快的留下我了。1500块一个月，酒水提成另算(一瓶纯生提成1元，一瓶勇闯提成5毛），包吃住，当时真是开心的不得了，现在觉得真是剥削啊，越是下层劳动人民被剥削的越惨，所以还是要多读书增长见识！是不是写的太啰嗦了？那后面我尽量简略说重点。&/p&&p&从6月15号做到9月1号，一共两个半月的时间，最后拿到手也就3500元左右，因为最后走的时候老板找了各种理由扣了我800、900的工资。当时刚踏进社会，哪里斗得过这种黑心老板。于是我就踹着这笔巨款开始了我的大学生涯。&/p&&p&ps，当时工作的那个餐馆，叫田园印象，在成都还有很多分店，味道还是可以的，我当时是在金牛店，好像现在没这家分店了&/p&&p&&br&&/p&&figure&&img src=&https://pic2.zhimg.com/50/v2-de2c230a8a561f8a59192_b.jpg& data-caption=&& data-size=&normal& data-rawwidth=&750& data-rawheight=&1334& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&750& data-original=&https://pic2.zhimg.com/50/v2-de2c230a8a561f8a59192_r.jpg&&&/figure&&p&&br&&/p&&p&&br&&/p&&p&--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------分割线，刚到公司打开电脑就看到你们这么多回复，很多评论来不及一一回复，很抱歉啊各位。先更完再一一解答，说我打广告的朋友，下次去田园印象吃饭把这篇文章给老板看看，让他给你打个折就算是我的广告费了。&/p&&p&&br&&/p&&p&上大学之后，我就跟父母说不会再找他们要生活费了，所以一开学我就开始忙着找各种兼职。不知道你们有没有遇到，刚开学就会有许多学姐来寝室推销你办兼职卡，200元一张，说办了以后就会收到各种兼职信息，我当时是很心动的，不过由于200元对当时的我来说是笔“巨款”，我还是没买。后来证明这个决定是正确的，因为这种确实是假的。&/p&&p&于是我就在网上到处搜集兼职的信息，那时候只知道58同城、赶集网，一搜学生兼职就会出来一大把。&/p&&p&&br&&/p&&figure&&img src=&https://pic4.zhimg.com/50/v2-ff662daa6f3f6e9a6a7321_b.jpg& data-caption=&& data-size=&normal& data-rawwidth=&911& data-rawheight=&762& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&911& data-original=&https://pic4.zhimg.com/50/v2-ff662daa6f3f6e9a6a7321_r.jpg&&&/figure&&p&很多都是这种，看上去薪酬很高，如果你联系的话会发现很多都是同一家公司发的。在春熙路附近就有一家这样的公司，58赶集上很多他们发布的信息，名字我记不住了，叫什么人力资源公司。都是把你约到公司去，然后就要让你花200块钱左右办卡。至于办卡后到底有没有工作给你，我不清楚，不过我不推荐这种兼职。&/p&&p&&b&所以我总结了三种比较辛苦但是踏实挣钱的兼职渠道。&/b&&/p&&p&&b&第一种：发传单、促销员&/b&&/p&&p&发传单这一类的工作，可以在QQ群里面去找，直接搜关键词，比如成都兼职、成都大学生兼职&/p&&p&&br&&/p&&figure&&img src=&https://pic2.zhimg.com/50/v2-6bd5bfea39dab_b.jpg& data-caption=&& data-size=&normal& data-rawwidth=&904& data-rawheight=&588& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&904& data-original=&https://pic2.zhimg.com/50/v2-6bd5bfea39dab_r.jpg&&&/figure&&p&&br&&/p&&figure&&img src=&https://pic3.zhimg.com/50/v2-ea874afaba83576a7fca74_b.jpg& data-caption=&& data-size=&normal& data-rawwidth=&896& data-rawheight=&591& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&896& data-original=&https://pic3.zhimg.com/50/v2-ea874afaba83576a7fca74_r.jpg&&&/figure&&p&就会出来很多这样的群，根据群规模和人数去选择性加。在这些兼职群里面发布的消息同样有真有假，大家注意分辨，我一般只在这种群里做发传单这一类工作，而且去之前一定要问清楚是不是日结，做完就能拿到钱！如果是周结和月结大家还是要谨慎选择，发传单这一类工作，工资一般一天在60——80块左右。&/p&&p&促销员&/p&&p&促销员这类工作，一般工作地点都是在超市卖场，不过这个有一定局限性，很多都只要女生，有的对外貌还会有一定的要求。一般要招促销员的公司，就是饮料、洗衣液、牛奶这些快消品公司。像成都的新希望公司就是长年都在招促销员，而且是成都各个区域的卖场都在招人。遇到薪资待遇还可以的公司，可以长期合作，平时周末可以去做，放寒暑假还可以接着做。&/p&&p&这一类的工资一般是在每天90——120之间，有的还会有单独提成，能力强一天150也能挣到。我之前就是帮一个公司卖果汁，98一瓶的果汁！卖一瓶提成5元，有一天我卖了20瓶，突破了那个公司单天单店最高销量，然后那个公司负责人就说提成变成了1元1瓶！真是坑。&/p&&p&促销员这一类工作，直接去你附近的超市卖场问那些促销的阿姨有没有要招兼职促销的就可以了，嘴巴放甜一点，或者花点小钱买阿姨的促销商品，她们都会很热情帮你的。不要放不下面子，挣钱就是要厚脸皮才能挣到钱。在做兼职的过程中，多留意跟你一样兼职的朋友，打听一下她们的工资待遇，遇到比你好的，可以跟她要公司负责人联系方式，慢慢积累你就会发现有很多工作可以做了。&/p&&p&&b&第二种：会展活动兼职&/b&&/p&&p&别的城市我不是很清楚，但是成都现在已经算是会展之都了。每年都会举办各种展会，车展、糖酒会、婚博会、房交会、还有年货节等等。展会期间都需要大量的兼职，有的是在现场发传单、有的是举牌、有的是促销、还有的是礼仪模特。一般会展兼职工资都是在80——120元之间，如果是礼仪模特工资会高一些。&/p&&p&这类工作，大家直接去会展场地问就可以了，成都会展场地好像在世纪城，听说现在新建了一个会展中心准备投入使用了。一般在开展前一天或者前几天去问，很多商家会提前去装修场地，我是大一寒假去的，遇到年货节，一天80块，包中午饭。不包饭的工资会多10元。&/p&&p&&b&第三种：连锁门店小时工&/b&&/p&&p&很多大型连锁门店都会招小时工，比如星巴克、屈臣氏、HM、GAP等，不同的公司小时工的职务也是不一样的，有的负责收银、有的负责整理门店。这些公司价格都不会太低，我之前是在屈臣氏做收银员，最开始1个小时12块6元，后来涨到了14.6，现在应该在15元以上了吧。HM工资一直都比较高，之前好像就是16左右。这类公司工资都是月结，打到你银行卡，也会要求你每周最少有2、3天的空余时间，每天工作时间6——7小时，不会超过8小时。会根据情况排早中晚班。你把课表给店长，或者告诉店长你什么时候有空，店长会根据你的时间和门店情况来进行排班。&/p&&p&以上三种就是我总结的比较辛苦但是靠谱的挣钱方法&/p&&p&&b&接下来就是说一些比较“高效“，挣快钱的办法。&/b&&/p&&p&我粗略算了一下，大学三年挣了10万是有的，去年毕业的时候银行卡余额还有3万多接近四万的样子。&/p&&p&--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------&/p&&p&上面忘记说连锁门店小时工这类工作去哪里找了，连锁门店小时工这类工作直接去你要做的门店去问就可以了，因为大学生考虑到住宿问题，建议大家找学校附近的门店，有时候要上晚班，要到晚上9、10点左右，离学校太远不安全回去也不方便。除了这个，电影院也会招小时工，之前我问过万达影院，大概是11元一个小时，现在价格不清楚了。&/p&&p&很多人在问学业和兼职怎么平衡。可能是我上的那个学校太差劲了，大一的话，一周五天只有四天有课，有一天是没有课的。再加上周末两天，我每个星期有三天都会在外面兼职，还有就是寒暑假和各大法定节假日。至于社交聚会基本上是没有的。我大学三年，每个学期都有拿学校的奖学金，不过学校奖学金也不多，分成好几等，最高也就1000元。大学三年奖学金总共应该有5000元。&/p&&p&我上大学之后就很后悔高中没有好好读书，所以大学专业课还是挺用功的从来没逃过课，专业课成绩在班上也算是数一数二，但是公开课像毛概、高数这种我就会偶尔逃课，也不怎么花心思。有一年差点拿国家奖学金8000元，专业课成绩很高，但是加上综合素质拓展成绩就被PK下去了，因为我基本上是没有怎么参加学校组织的活动，综合素质拓展成绩很低。‘&/p&&p&-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------&/p&&p&分割线，上面那三种类型兼职，基本上就是我大一这一年在做的&/p&&p&&b&接下来就说你们最感兴趣的，轻松快速挣钱的！&/b&&/p&&p&&b&第一种：社群&/b&&/p&&p&之前大一在做上面几种兼职的时候，我都会留一点心眼，比如会问一起兼职的小伙伴是怎么找到兼职的，工资待遇怎么样，如果遇到靠谱长期招人的我都会要公司负责人的联系方式。会展遇到专门做会展活动的广告公司也会主动去搭讪，要联系方式。一年慢慢累积下来，手上也有很多稳定靠谱的兼职资源，所以身边的同学朋友有的想做兼职就会找我，让我帮忙介绍一下，我也没想太多，觉得有个熟人一起做兼职还挺好的。&/p&&p&后来找我推荐兼职的人越来越多，我就建一个群，有靠谱的兼职信息都会发群里，让她们自己联系。刚开始群也就几十个人，后来一个拉一个，慢慢就有100多人了，都是室友啊、同学这些。后来发展到快200人的时候，群里面除了发兼职信息，开始出现找人帮忙代课，帮忙点名、帮忙买饭取快递的。如果是代课，一节课20元左右。取快递买饭一次跑腿费2、3元。于是就这样越来越多的人加入了这个群。&/p&&p&很快群就到了极限500人，我是个没有什么生意头脑的人，到这种时候我还没意识到可以靠这个挣钱。后来很多人都跟我抱怨相加群加不进来，我咬咬牙，买了个VIP把群升级成了2000人的大群。当有了500人的基础之后，你会发现群成员增长速度是非常快的。我不得不佩服那些很有商业头脑的同学，很快就嗅到了商机。开始在群里卖自己家做的冷吃兔、卖流量、卖手机支架、卖美瞳、卖丝袜还有卖凉面盒饭的，甚至学校周边的奶茶店、培训班都跑到了这里面打广告！&/p&&p&那时候我压根没有社群营销、社群运营这些概念，根本不知道怎么管理群，只会保证里面不出现虚假骗人的信息，其它都随便大家怎么发。直到我看到这些广告以后，我想我也可以卖东西啊，可是我想了半天没有什么货源，也没有产品可以卖。后来看群里实在太混乱了，每天广告消息刷屏，真正需求反而被刷掉了。所以为了管理群（其实是为了钱），我决定开始收广告费，一个月20元，每天在规定的时间发广告，不交广告费被发现在里面打广告的，直接被踢出群。&/p&&p&我是不是很良心，一个月才20元，广告主们都觉的这价格很合适，大家也都很配合。我没有具体算过一个月有多少人交广告费，但是50个肯定是有的，一个月1000元收入没问题。&/p&&p&后来这个群我在大三搬校区的时候以3000块钱卖给了学弟，我知道很多人要问我为什么卖。&/p&&p&因为这个群里面2000个人，至少有二分之一是跟我一个年级，专科大三都会出去实习，再加上我们搬校区。很多人在学校待的时间不多，用到这个群的时间也很少，群里肯定活跃的人越来越少，毕业了很有可能大家都退了。事实证明这个决策确实是很正确的，后来这个群人数从2000降到了1200左右。&/p&&p&不过学弟比我有经济头脑多了，从一个群变成了四个群，每个群的人数平均在1000左右，我以前是一个月广告费20，他是一次广告费就20，不过可以帮你在四个群同时发。&/p&&p&&b&第二种：黄牛党&/b&&/p&&p&这个黄牛党不是演唱会这一类的黄牛党，是医院挂号的黄牛党。你们都知道很多专家的号很难挂到，很多都直接被黄牛给截断了。有的专家是需要去医院现场排队挂号，有的可以在网上预约，还有的可以打电话挂号。我做的就是打电话挂号这种，这个机会也是大一做兼职的时候留下的，因为留了这个老板的联系方式，我只知道他是在成都做跑腿代办业务的。&/p&&p&大二上学期快期末的某一天突然联系我，说有个兼职可以做，问我有没有兴趣。我问他什么兼职，他说就是打电话挂号，挂到一个号就100块！我防备心还是很强的，我觉得这么简单的工作就100块，该不会是骗人的吧。但是我一想他又没让我交钱也没见面，能骗我啥，所以就报着试试的心态。&/p&&p&说一下这种电话挂号的操作流程，就是病人把就诊卡信息发给这个老板，然后这个老板每天把病人的信息汇总发给我们，我们打医院挂号电话，告诉接线员要挂哪个医生的号，然后报病人的就诊卡信息，挂号成功以后病人拿着就诊卡直接去医院取号就行了。一般每天电话挂号只有20个名额，抢完就没有了。不同的医生挂号的时间段也不同。&/p&&p&后来我就开始自己做这个做了一个多星期，每天下午1点钟打电话，一般5分钟之内所有的号就会被抢完，只能不停的打，一个多星期就打进去了一个。我想这钱听着容易赚，其实还真的一点都不好挣。&/p&&p&然后我终于机智了一回，我想我可以发动寝室的妹子还有一些关系比较好的朋友，让她们一起打电话啊，不过由于这个是灰产我胆子还是比较小，所以也就只发动了20人左右帮我打电话。她们挂号成功一个我给50元，我从中间赚50元。平均每天能打进4个电话，每天收入就是200元，只有周一到周五才能挂号，一个月下来能赚,。&/p&&p&不过好景不长，做了半年左右，医院发现了这个BUG，后来就要求打挂号热线的电话号码要跟就诊卡信息上的电话号码一致，否则就不给挂。于是这个赚钱渠道就这么破碎了！&/p&&p&&b&第三种：宿舍小卖部&/b&&/p&&p&这个我相信很多人都做过，利润有多高就不用多说了吧。只是这个真的很辛苦，要去食品批发城拿货，再搬回寝室，然后做好价目表留好联系方式，挨个寝室发传单，10元起送！卖的比较多的就是方便面、薯片、饼干、饮料这些。刚开始我自己一个人干，跑勤快一点，一天赚个70、80没问题，后来订单越来越多，经常在上课的时候都收到短信哪个宿舍要什么东西。于是我就召集了两个小伙伴一起做，谁知道合伙生意真的不好做，涉及到利益的问题很容易伤感情，三个月之后把货清空宿舍小卖部就关门了。&/p&&p&&b&上面这三种就是我大二在做的&/b&&/p&&p&&b&下面说大三做的兼职&/b&&/p&&p&&b&第一种：护肤品销售&/b&&/p&&p&到了大二期末搬校区的时候，手里一点赚钱的渠道都没有了，心里那叫一个着急啊。于是刚搬完校区我就到处打听哪里能够实习，当时是想找一个跟专业相关的岗位大三去实习一年，找了一圈都没有遇到合适的。之前不是说过我在屈臣氏做过收银嘛，所以认识了很多卖化妆品和护肤品的姐姐，那些姐姐也很关照我。有个姐姐知道我在找工作，就给我介绍了一个国产知名护肤品公司去做销售，很多大学生妹子都会用这个品牌，具体哪个品牌大家自己猜。因为当时这个公司旗下又推出了一个新品牌，为了推广新品牌是砸了重金，所以给的待遇很好。&/p&&p&销售工资有两种，一种是底薪加提成，一种是裸提没有底薪，我选择了后一种，提成比例是22%——25%，也就是你卖100块就能有22到25元的提成。底薪加提成的待遇我记不住了，但是只要对钱渴望的都会选后一种。之所以选择这个工作，除了工资高，还有就是上班时间是上一天休一天，每天早上10点上到晚上10点，第二天就可以休息。相当于一个月有一半时间是自由的。虽然大三课很少，但是还是需要偶尔回学校，所以这个工作的时间也让我很满意。这个工作我做了差不多一年，拿到毕业证才辞职的。每个月平均工资7000——8000，我知道很多人想问我怎么做到的，不过这写下来又能写一篇文章了，这里就简单代过。&/p&&p&&br&&/p&&p&&b&第二种：人力资源中介&/b&&/p&&p&这个是大家比较关心的，我尽量说详细点。&/p&&p&我说了之前做兼职积累到很多需要兼职的公司，很多公司都不会自己亲自去找兼职，很麻烦，而且兼职的流动性强，有的做了今天明天就不做了。所以很多公司都会把兼职需求发出来，给兼职领队，让兼职领队安排。&/p&&p&所以我这个应该也算兼职领队，就是接活然后交给手里的兼职去做。怎么赚钱？一般是直接抽成，很多公司给兼职领队的工资不会很低，比如给到兼职领队是120元每人每天，兼职领队给手下兼职100元每人每天，每个人头赚20元左右。&/p&&p&还有一种叫做校园活动外包，很多公司都在抢占高校这块市场，都想去学校里面做活动，有的要求要在学校摆点一天，需要多少个学生兼职，要在寝室扫楼发传单，还要在学校拉横幅。一套打包价格一个学校是4000左右,高的会给到5000。如果你能找到学校场地，能满足活动方的要求，你就能接这种活。按我之前的经验这种活的成本一个学校不会超过2000。所以一所学校你就能挣2000，很多公司都是在很多所高校依次摆点，所以你能拿到的场地越多，越能挣钱。&/p&&p&不过这种有很多限制，很多学校不准外面的公司在学校做活动。所以接的时候尽量不要接太商业化的，能跟公益或者服务学生挂边的最好。申请场地最好是通过学校里面的组织，学生会各部门、社团这些，直接找学校，场地费你都给不起。一般专科职业技术类学校场地都会比较好搞定，重点院校就很麻烦。&/p&&p&&b&第三种：淘宝店&/b&&/p&&p&淘宝店这个真的没有赚到钱，还亏了，所以这里就不说了，过程也是很曲折的。&/p&&p&这三种在我毕业之后都没有做了，说一下我不做的原因。&/p&&p&第一种销售护肤品，虽然这个工资还可以，但是不利于我的个人成长，我不想一辈子都做销售。虽然很多人会反驳我说很多厉害的人都是从销售做起，但是我不认为自己能成为其中一个，销售也不是我喜欢的工作，挣钱是很重要，我觉得能找到自己喜欢的工作投入其中更重要，所以我果断辞职了。&/p&&p&第二种人力资源中介，这个其实争的就是信息不对称的钱，准入门槛非常低，只有你手里有学生资源、有商家资源你就能做，没有任何竞争壁垒。而且现在做的好的大平台非常多：斗米兼职、久坡兼职、兼职猫，有的都融资好几轮了。如果你想做这一类的工作，也可以考虑和这些大平台合作，它们会需要很多校园领队。有时候还能从它们这里接到一些校园活动的活。还有就是做校园活动，有时候拿场地需要找关系也很心累。&/p&&p&第三种淘宝店，这个都没挣钱，当然就没做了。不过吃过一次亏，我对淘宝还是了解一些，要是有想开淘宝店的朋友可以跟我交流。&/p&&p&--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------&/p&&p&以上就是我大学的兼职经历，我自己看都觉好长。谢谢你们这么有耐心看完还给我点赞。&/p&&p&很多朋友问我现在在干嘛，我现在从事互联网运营方面的工作，我非常喜欢我现在的工作，我大学学的是会计专业，至于如何转行？又怎么选择了互联网运营的工作？这个要说的话又要写好长一篇。&/p&&p&我也面临过很迷茫，不知道自己该做什么工作，自己要过怎样的人生。我以后也会慢慢写关于职场、人生规划我的一些经历。如果你对互联网运营行业感兴趣，我也可以跟你聊聊互联网运营，因为我也是一个才入行不久的新人，我现在也在努力学习，让自己不停的成长。现在我觉得我每一步都走的很踏实，能够看得见未来！&/p&&p&&br&&/p&&p&最后我想说，在大学期间如果真的不是逼不得已，不要去浪费时间做兼职。大学几年空闲时间是很多的，好好学习，让自己有立足于社会的一技之长。或者在大学里，好好想想自己的人生规划、职场规划，给自己定目标，努力让自己变得更优秀，成为自己喜欢的模样！特别是考上好大学的同学们，你身边的导师、同学这些都是巨大的财富，和兼职挣的钱比起来，最后的回报是完全不一样的。&/p&&p&对于那些逼不得已需要做兼职的同学，我表示很心疼。不是所有的父母都愿意为了孩子倾其所有，也不是所有的父母为了孩子倾其所有就能让孩子过上舒服的生活。100个人有100种人生，你永远都不知道别人的生活正在经历什么，所以有的人不用站在道德的制高点指责别人，多点包容和平和心。我很喜欢的一句话送给这一类朋友：&b&我从阴影处来，往光亮处走，所以生命的底色，一直充满着希望&/b&&/p&&p&还有那些跟我一样学历不高的朋友，不要因为学历低就觉得低人一等，遇到自己喜欢的工作也不敢去做，保持不断学习，提升自己的能力，慢慢积累，有朝一日量变也会引发质变。谢谢那些鼓励我的朋友，有机会我也会努力提高我的学历的&/p&&p&大家如果愿意跟我交朋友，想跟我一起学习成长，可以关注我的公众号。不定期分享职场、人生规划、读书学习的方法、如何提升个人能力等。&/p&&p&非常非常感谢大家，谢谢你们！&/p&&p&&br&&/p&&p&-----------------------------------------------------------------------------------------&/p&&p&大家别再私信我怎么找兼职什么的了，我已经把我知道所有关于找兼职的方法都写在文章里了。还有啊，不是逼不得已真的别浪费时间做兼职啊，多学知识，早点考虑清楚自己以后想做什么、职业规划方向，你就会比同龄人领先很多啊！&/p&&p&&br&&/p&&p&很多人问我现在在做什么，要是有耐心，您可以去看我这篇回答：&a href=&https://www.zhihu.com/question//answer/& class=&internal&&你是如何转行的，转行容易吗？&/a&，要是没耐心，我就大概说下吧。&/p&&p&从2016年7月毕业到2016年11月，干了四个月的会计工作，平均工资2200&/p&&p&2016年12月——2017年2月裸辞在家学习&/p&&p&——，正式转行互联网运营，开始我的第一份互联网工作，工资3000&/p&&p&——，跳槽到另一家互联网公司，负责内容运营，工资税后5k&/p&&p&——至今，杭州一家互联网公司，负责内容运营，工资税前10000，税后还没拿过工资&/p&
我应该算是兼职老司机了，从高中毕业之后就踏上了兼职之路，大学除了学费，基本没找家里要过钱。首先说明我是一个学历不高，也没有在某方面有特长的一个普通人，所以这里说的兼职都是我做过、适合普通人，没有什么门槛的。兼职的路上肯定会遇到很多骗子，但…
&p&号更新。只要有点水平不嫌麻烦，月入3000零花钱应该不成问题。来长期做兼职的老司机带你飞。先上&/p&&figure&&img data-rawheight=&1280& src=&https://pic2.zhimg.com/50/v2-02fc624d4bc5d4eeb28e08e54c5225cf_b.jpg& data-rawwidth=&719& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&719& data-original=&https://pic2.zhimg.com/50/v2-02fc624d4bc5d4eeb28e08e54c5225cf_r.jpg&&&/figure&&p&&br&&/p&&p&&b&一、接字的初中论文&/b&&/p&&p&首先来个技术含量不那么高的，简单易上手滴。&/p&&p&我从去年开始接初中的杂志论文，100大洋的一篇论文只要1200左右的字，我现在只需不到两个小时就能完成一篇。主要是这些论文的要求都不高，只需要在网上找3至4篇主题相同的论文，组合改编就好，可以说很符合下班的闲时就可以小挣一顿大餐了。&/p&&p&&br&&/p&&figure&&img data-rawheight=&93& src=&https://pic3.zhimg.com/50/v2-cc448e1f19ddcc3ad7dce3d8a995e676_b.jpg& data-rawwidth=&515& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&515& data-original=&https://pic3.zhimg.com/50/v2-cc448e1f19ddcc3ad7dce3d8a995e676_r.jpg&&&/figure&&p&最开始写的时候还存档了几篇，后来都没保存了。今天早上起来才写了一篇《苏教版初中英语的有效研究》，这类论文真的轻松又简单，比较闲的小伙伴可以做这类兼职，毕竟早上起来一两个小时坐着不太需要脑子、不需要文采，顺便写写就和在外面做超市促销价格一样了。&/p&&p&想接论文的小伙伴们不要再私聊我啦 。我朋友的任务没有这么多，已经给了十几二十个小伙伴了。 想做的可以自己在第二点的豆瓣银行里面找找，里面也有这样的任务。&/p&&p&&br&&/p&&p&&b&2.豆瓣稿费银行&/b&&/p&&p&肚子里有点墨水的小伙伴除了这种论文，可以挣钱的机会更多了。我觉得这个时代对于码字的小伙伴真的有太多机会。&/p&&p&强烈推荐一个豆瓣小组给大家，因为里面的需求大多真实有效，而且很多长期有效，有些几年前在发的需求，现在依然有人在接。我知道这个小组也是在一个公号里看到她说她的一个小伙伴在里面接任务能达到月入30000+！&/p&&p&除了这种金额很大，字数很多，能力要求高的写作需求外，还有十几个字、几十个字，要求不高就可以搞定的。里面的任务超级多，给大家推荐一个小妙招，因为量太大可能看不过来，可以先看后面的回复数，回复数越多的，越靠谱&/p&&figure&&img data-rawheight=&1334& src=&https://pic4.zhimg.com/50/v2-d421dd64f69cad0f33e42fe_b.jpg& data-rawwidth=&750& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&750& data-original=&https://pic4.zhimg.com/50/v2-d421dd64f69cad0f33e42fe_r.jpg&&&/figure&&p&&br&&/p&&p&&b&3.自由人协作平台&/b&&/p&&p&这个网站上的需求是比较靠谱的，里面任务有难有易，除了一般的接文写作，还有ps，翻译，设计等，我觉得给的报酬还是相当合理的。大家没事可以翻翻有没有适合自己的。唯一不好的这需要竞标，不过只要你会营销自己就能得到好的任务。遇到合适的，可以长期合作，或许能成就自己的第二职业呢！网页图片就是刚才的第一张图。&/p&&p&&br&&/p&&figure&&img data-rawheight=&1280& src=&https://pic2.zhimg.com/50/v2-02fc624d4bc5d4eeb28e08e54c5225cf_b.jpg& data-rawwidth=&719& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&719& data-original=&https://pic2.zhimg.com/50/v2-02fc624d4bc5d4eeb28e08e54c5225cf_r.jpg&&&/figure&&p&4.爱标客&/p&&p&去年有一段时间我闲赋在家，我朋友给我介绍了一个兼职。他室友做了快两年了，就是每天下课回去抽一个小时批改一下作文，每个月挣一千多。作文水平就是初中生写的小作文，主要是检查单词拼写错误和一些基本的语法错误。但是对于批改者的要求必须要六级550分以上。（爱标客接任务需要提交身份证，收工资的银行卡这些，对于自己隐私信息保护较高的小伙伴自己好好斟酌一下。我室友当时就担心没做这个任务。还有现在爱标客的任务也不多啦，大家不要都跑去接这个任务。）&/p&&p&英语不好的也没关系，里面还有各种方言翻译啊、改数学题啊各种兼职&-&
我也不懂这些是搞什么鬼的！我也只做过英语作文批改，所以保证的也只有这个啦！这个英语批改是要加群的，咨询我的人太多了，加群的人也太多了。爱标客不需要这么多人。所以在此改为值乎提问，我可以回复英语和数理化批改的联系方式，或在值乎里听我给别人的回答。&/p&&p&5.猪八戒网&/p&&p&这是一个比价大众的兼职平台了，大伙儿应该都了解，我就上个图给大家看看，有能力的小伙伴快去竞标吧！我再来补充一下玩猪八戒网需要注意的问题。因为猪八戒网是一个需要竞标的兼职网站。网站大了就会有不良发布骗标。评论里就有小伙伴说他被骗过。所以我们要学会鉴别。猪八戒网站规则是发布需求－接需求－竞标－中标，一个好的标可能有很多人竞争，你努力后可能没中标，最倒霉的可能被骗方案。所以你可以绕过这些复杂的程序，直接联系发布者，告诉他你有多牛x，然后发作品链接给她，直接私下达成协议。（虽然不符合网站规定，但你必须学会维护自己的利益和收益。这个方法也是一个老司机告诉我的，我深以为然，特来分享给大家，愿大家都能搞自己的努力挣到money）&/p&&p&&br&&/p&&figure&&img data-rawheight=&1280& src=&https://pic4.zhimg.com/50/v2-cfe327dfc9b6fbe7e5e885_b.jpg& data-rawwidth=&719& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&719& data-original=&https://pic4.zhimg.com/50/v2-cfe327dfc9b6fbe7e5e885_r.jpg&&&/figure&&p&&br&&/p&&p&6、简书&/p&&p&上面介绍了很多兼职平台，不过都是自己写了给他人做嫁衣的感觉。在这个个人品牌越来越重要的时代，写作能力强一点的小伙伴，除了接以上兼职练练手随便挣一点外快以外，可以把自己的专注力放在简书等写作平台上。首推简书是我觉得这是一个对于纯粹的写作爱好者比较好的平台。你可以先尝试一下各种主题，最后找到适合你的风格。只要你写的可以，写不了多久就会有各种编辑来找你约稿了。&/p&&figure&&img data-rawheight=&119& src=&https://pic1.zhimg.com/50/v2-f6cfb520b5818a5eedb8_b.jpg& data-rawwidth=&623& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&623& data-original=&https://pic1.zhimg.com/50/v2-f6cfb520b5818a5eedb8_r.jpg&&&/figure&&p&这是我在简书写了第四篇影评后收到的约稿。但是他要首发，我当时正调到总公司太忙就没写了。&/p&&p&除了被约稿外，简书还有很多有奖征文。一些主题群里，群主会发有奖征文，获奖的除了奖金外还有可能出书哦！除了这些群主的小征文外，还有简书主办的有奖征文，比如之前的对话文章，头奖一万！还有七夕征文那些，都是有奖金哒！慢慢练习，小伙伴们，向签约作者前进！！！&/p&&p&7、抱大腿&/p&&p&我在漫长的找兼职的遇见不少大牛，像接初中论文那个是以前的学长，他现在创业做学术杂志，知道我喜欢码字所以发单给我。所以还是那句话，个人品牌特别重要，因为我的个人品牌打造的其中一点就是爱码字，现在我周围朋友都会有偿邀请我写东西，最厉害的是我凭这点，入公司不到一年就被调到总公司去负责公司公众号运营。&/p&&p&&br&&/p&&p&8.公众号投稿。有很多大号都开通了投稿，而且稿费相当客观。一般一篇有200-500左右。有些号是根据阅读量给稿费，有些还能给到千字千元
大家都知道现在写公众号文章有相当多的技巧。如果不了解的可以关注我的公众号：鹿十七（lushiqi0017）&b&回复“投稿”还可以收到我目前收集的可以投稿的大号哦！回复“兼职”可以收到我收集的最新一期兼职信息。&/b&&/p&&p&&b&目前分享的各种兼职给小伙伴们带来了不是额外收入～大家都很积极参与&/b&&/p&&br&&figure&&img data-rawwidth=&750& data-rawheight=&1334& src=&https://pic1.zhimg.com/50/v2-aa20bc3db4c2_b.jpg& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&750& data-original=&https://pic1.zhimg.com/50/v2-aa20bc3db4c2_r.jpg&&&/figure&&br&&p&&b&&br&&/b&&/p&&p&&b&扫描二维码关注了解更多，爱你哟！&/b&&/p&&p&&p&&a href=&//link.zhihu.com/?target=http%3A//weixin.qq.com/r/zzj373HETiwxrTWM923d& class=& external& target=&_blank& rel=&nofollow noreferrer&&&span class=&invisible&&http://&/span&&span class=&visible&&weixin.qq.com/r/zzj373H&/span&&span class=&invisible&&ETiwxrTWM923d&/span&&span class=&ellipsis&&&/span&&/a& (二维码自动识别)&/p&&/p&&p&&br&&/p&&p&补充：第二次回答获得这么多赞好惶恐啊！由于觉得关注这个的朋友可能学生和初入社会小伙伴比较多。所以在最后我有几句话觉得该说一下。大学生们不要把你的时间都花费到做兼职上面来了，如果喜欢自己的专业就好好学习，如果不喜欢自己的专业就找到自己热爱的方向。就算是你喜欢旅游，我身边也有很多把旅游做成自己的工作，甚至开公司的。所以，大家在做兼职之外一定要有磨炼自己技能，加强自己的特色这个意识。最后一次补充啦，最后愿大家早日财富自由。你一定要努力，但千万不要着急，么么哒。&/p&
号更新。只要有点水平不嫌麻烦，月入3000零花钱应该不成问题。来长期做兼职的老司机带你飞。先上 一、接字的初中论文首先来个技术含量不那么高的，简单易上手滴。我从去年开始接初中的杂志论文，100大洋的一篇论文只要1200左右的字，我…
&h2&勇气和运气：生物钟的分子研究｜饶毅深度解读2017年诺奖&/h2&&p&&i&&/i& &a href=&//link.zhihu.com/?target=https%3A//mp.weixin.qq.com/s%3F__biz%3DMzIyNDA2NTI4Mg%3D%3D%26mid%3D%26idx%3D1%26sn%3Dc9870ffc8a69bdeb127e598%26chksm%3Df3afc23ef4ea8dc4ea3accc52e84f931%26scene%3D0%26key%3D2bcf5ce5a13cfb5fad519b6f471edeef34fd9d4ccdc5d7cc082a68c65e41e2de0cffba0bb61a3ccf7e94ddbc19bdbc7b22%26ascene%3D1%26uin%3DMjQ3Mjg5OTEyMA%253D%253D%26devicetype%3DWindows%2B10%26version%3Dpass_ticket%3DJwYcUhqPjOpIS7WpJTgunFzhJ4Sx%252F%252BKKnchhC8VShzyU75JNn6TCuxVjKBl0wYNd%26winzoom%3D1%23%23& class=& wrap external& target=&_blank& rel=&nofollow noreferrer&&知识分子&/a&&/p&&p&&br&&/p&&figure&&img src=&https://pic4.zhimg.com/50/v2-4bcdb6c586cc98a6a8abfc8_b.jpg& data-rawwidth=&484& data-rawheight=&493& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&484& data-original=&https://pic4.zhimg.com/50/v2-4bcdb6c586cc98a6a8abfc8_r.jpg&&&/figure&&p&&br&&/p&&p&&b&?&/b&2017年诺贝尔生理学或医学奖授予杰弗理·霍尔（Jeffrey C Hall）、迈克尔·罗斯巴希（Michael Rosbash）、迈克尔·杨（Michael W Young）。&/p&&p&&br&&/p&&p&&br&&/p&&p&三位科学家的获奖理由是：因发现控制昼夜节律的分子机制。&/p&&p&&br&&/p&&p&&b& 获奖人简介
&/b& &/p&&p&&br&&/p&&p&&b&杰弗里.霍尔(Jeffrey C. Hall)&/b&杰弗里.霍尔(Jeffrey C. Hall)，美国遗传学家，1945年出生于美国纽约。1971年在西雅图华盛顿大学获得博士学位，1971年至1973年在加州理工学院担任博士后研究员。1974年，他加入了布兰迪斯大学任教职。杰弗里.霍尔现已退休。 &/p&&p&&br&&/p&&p&&br&&/p&&p&&b&迈克尔·罗斯巴什（Michael Rosbash）&/b&&/p&&p&迈克尔·罗斯巴什（Michael Rosbash），美国遗传学家，1944年出生于美国堪萨斯城。他于1970年获得美国剑桥的麻省理工大学博士学位。后在苏格兰的爱丁堡大学做了三年博士后研究。1974年以来，在美国沃尔瑟姆的布兰迪斯大学任职。&/p&&p&&br&&/p&&p&&br&&/p&&p&&b&迈克尔. 杨（Michael W. Young）&/b&&/p&&p&&br&&/p&&p&迈克尔. 杨（Michael W. Young），美国遗传学家，1949年出生于美国的迈阿密。1975年，他在奥斯丁的德克萨斯大学（University of Texas）获得了博士学位。在年间，他在Palo Alto的斯坦福大学担任博士后研究员。1978年后，他在纽约的洛克菲勒大学（Rockefeller University）任职。&/p&&p&&br&&/p&&p&&br&&/p&&p&&br&&/p&&figure&&img src=&https://pic1.zhimg.com/50/v2-c8b9e22bce1_b.jpg& data-rawwidth=&455& data-rawheight=&437& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&455& data-original=&https://pic1.zhimg.com/50/v2-c8b9e22bce1_r.jpg&&&/figure&&p&&br&&/p&&p&? 生物的生命活动受内在生物节律调控&/p&&p&&br&&/p&&figure&&img src=&https://pic2.zhimg.com/50/v2-9dbdb15d58e199f3245c3c_b.jpg& data-rawwidth=&640& data-rawheight=&366& class=&origin_image zh-lightbox-thumb& width=&640& data-original=&https://pic2.zhimg.com/50/v2-9dbdb15d58e199f3245c3c_r.jpg&&&/figure&&p&&br&&/p&&p&? 人体在一天中的不同生理活动也受生物钟调控 &/p&&p&&br&&/p&&p&&br&&/p&&p&&b&《知识分子》主编饶毅历时4年撰写两万字长文深度解读生物钟的分子研究历史，在十一长假与各位读者分享智力的愉悦。&/b& &/p&&p&&b&勇气和运气：生物钟的分子研究&/b&&/p&&p&&br&&/p&&p&&b&撰文｜饶毅（《知识分子》主编、北京大学讲席教授）&br&&/b&&/p&&p&&br&&/p&&p&● ● ●&/p&&p&&br&&/p&&p&运气，外在而缥缈；&/p&&p&勇气，内生而实在。&/p&&p&运气不会寻找勇气；&/p&&p&勇气可能碰到运气。&/p&&p&&br&&/p&&p&在研究生物钟基因的过程中，事先难以预料能否取得突破，事后分析发现勇气足以成功，而运气是锦上添花，虽然花开的特别灿烂。&/p&&p&&br&&/p&&p&生物钟是生物体内周而复始的节律，如人们熟知的：动物的昼行夜伏、植物的春华秋实…。常见的近24小时昼夜节律（circadian rhythm）是典型的生物钟之一。&/p&&p&&br&&/p&&p&生物钟现象看似简单，其实不尽然。人们熟知的向日葵朝向太阳，并非每天太阳先出来、向日葵后转向，而是向日葵先朝向、而后才有太阳姗姗来迟。&/p&&p&&br&&/p&&p&生物钟的本质难以入手，研究不容易。人们用电生理方法研究而不得入门，1971年从果蝇的一个基因出发开启了生物钟的基因研究，23年后才发现哺乳动物第一个生物钟基因的突变，26年后明确哺乳类的生物钟基因与果蝇的类似，30年后才发现同果蝇一样的基因也控制人类生物钟。&/p&&p&&br&&/p&&p&驱动生物钟的内在机理随着一个一个基因的发现和研究，逐渐明朗，从果蝇到人存在同样一批控制生物钟的基因，它们编码的蛋白质合作共事，节律性地调节细胞内的基因转录，都采用了负反馈模式，并与光和温度等外界因素协调，从而对应于地球自转的近24小时节律。&/p&&p&&br&&/p&&p&研究生物钟最重要的六位科学家都在美国，其中五位研究果蝇，一位研究小鼠。加州理工学院的Seymour Benzer（）和Ronald Konopka（）开创生物钟的基因研究，发现第一个生物钟基因&i&period&/i&（&i&per&/i&）。两个团队克隆&i&per&/i&基因：洛克菲勒大学的Michael Young（1949-）领导的实验室，Brandeis大学的Michael Rosbash（1944-）和Jeffrey Hall（1945-）两个实验室合作的团队，他们都还发现调控生物钟的更多基因。哺乳类生物钟基因研究的突破来自当时在美国西北大学、现在西南医学中心的Joseph S Takahashi（高桥,1951-）。&/p&&p&&br&&/p&&p&一百多年来，科学家们因研究果蝇而获、年四次诺贝尔奖。如无意外，生物钟的研究将让果蝇再度引人瞩目。&/p&&p&&br&&/p&&p&生物钟的研究历程，出现过有趣和尴尬的故事？&/p&&p&生物钟的研究是否终结，没有重大问题、只剩细节了？&/p&&p&生物钟研究逾四十年，为何迄今尚未出现有效的应用成果？&/p&&p&&br&&/p&&p&行为研究的范式变化&/p&&p&&br&&/p&&p&生物钟可以看成一种行为模式。&/p&&p&&br&&/p&&p&行为是可以被其他动物和人类研究者所观察到的动物外在动作表现。行为研究的范式在1960年以前比较简单，以描述性为主。&/p&&p&&br&&/p&&p&因研究消化系统而获1904年诺奖的俄国科学家巴甫洛夫（Ivan Pavlov, ），后来却以条件反射的研究更为一般人所熟知。狗见到喜爱的食物会分泌唾液，而原本铃声不会诱导狗分泌唾液，但在铃声与食物多次同时出现后，单独出现铃声可以诱导狗分泌唾液，说明声音刺激与食物刺激之间可以建立联系。巴甫洛夫称食物为无条件刺激，铃声为条件刺激，&b&对条件刺激的反应为条件反射&/b&。这种简单的行为学实验是20世纪初行为学的重要进展。&/p&&p&&br&&/p&&p&行为学既与生理学和神经生物学相关，也与心理学很近。美国的行为主义开创者John B. Watson（）于1913发表《行为学主义者宣言》，提出人和动物的行为都很简单，由后天经历所塑造。1920年他用11个月的男孩Albert做实验，试图说明只要后天刺激建立他的恐惧行为，把他本不怕的鼠与铁棒声音偶联后，他见鼠和兔狗等其他动物都哭，认为这是条件反射塑造其行为。&/p&&p&&br&&/p&&p&美国著名心理学家B. F. Skinner（）推广行为主义，提出所有动物和人一样，其行为都由后天刺激所塑造，是极端行为主义的代表。他发明了具体的实验设计：&b&操作性条件反射&/b&。巴甫洛夫的条件反射只看动物的反应、不看其动作。Skinner用鸽子做实验，在鸽笼装两个钮，鸽子碰一个钮会得到吃的奖赏，触另一钮无奖。一段时间后，鸽子会经常去碰有奖钮，这种条件反射可以由它主动的行为表现出来，而不是流唾液这种被动反应，称为操作性条件反射，它迄今仍为研究学习记忆的重要模型。&/p&&p&&br&&/p&&p&1973年诺贝尔生理学或医学奖授予研究行为的科学家：奥地利的Konrad Lorenz （）和Karl von Frisch（）、荷兰的Nikolass Tinbergen（）。他们的研究既不是生理学、更不是医学，而是通过观察动物行为作出推论，接近十九世纪的博物学。&/p&&p&&br&&/p&&p&von Frisch研究蜜蜂的行为，有多个发现如蜜蜂有内在的生物钟、有超乎人类的识别偏振光的能力。他得奖是因为发现蜜蜂通过舞蹈传送信息：一只蜜蜂发现食物后，飞回蜂巢告诉其他蜜蜂食物所在地的远近和角度、食物的多少。这是一个奇妙的社会行为，刺激科学界讨论动物是否合作、能否交流、以及语言是什么等问题。&/p&&p&&br&&/p&&p&Tinbergen的哥哥是1969年诺贝尔经济奖得主。Tinbergen研究动物的本能行为。本能的行为是天生（并不一定是幼年表现的）、到一定时候动物会表现的行为，比如生殖行为无需教导、也无需观察。Tinbergen和Lorenz发现动物有刻板动作，如一对鹅在交配后，公鹅要做一套特定动作；而一些刺激可以诱导特定动作，如有些特征可刺激鱼视之为敌而攻击。Lorenz也做过本能实验，但他更著名的研究是行为的印迹（imprinting）。他用灰腿鹅做实验，在刚从蛋孵化后一段时期内，如果小鹅见到的移动物体只是Lorenz本人，那么以后这些鹅视Lorenz为母亲，他走到哪里，它们跟到哪里，甚至长大后碰见真鹅，它们犹豫再三还是跟着Lorenz本人。印迹只能在特定时期产生，称为临界期。&/p&&p&&br&&/p&&p&1951年Tinbergen提出研究行为有四个方面，两个近端原因（proximate causes）：&b&发育&/b&（行为如何在个体发育过程中形成），&b&机理&/b&（个体行为的原理）。两个终极原因（ultimate causes）：&b&进化&/b&，和&b&功能&/b&（如打架为了抢配偶或食物）。&/p&&p&&br&&/p&&p&行为的研究现在都还有很多停留在描述的程度。如2009年von Bayern等的论文，描述乌鸦如何被迫用小石头帮助自己获得嘴巴够不着的食物。主要的行为学的教科书《动物行为学》超过这篇文章的内容也不多。&/p&&p&&br&&/p&&p&生物钟研究的突破缘于遗传学的应用。遗传学从孟德尔经摩尔根到1960年代初主要研究的核心是遗传的原理，揭示个体和群体的遗传规律。而1960年代末开始，遗传学作为重要的工具，提供研究生物现象的途径。通过突变观察到基因异常导致的表型，推论基因正常的功能，了解生物学机理。美国生物学家Leland Hartwell（1939-）研究酵母细胞分裂的遗传突变，推论参与细胞分裂的基因，最后有助于理解人类的癌症。&/p&&p&&br&&/p&&p&通过异常现象了解正常规律，通过个别例外发现普适原理，是遗传学的核心之一。&/p&&p&&br&&/p&&p&生物钟的存在和意义&/p&&p&&br&&/p&&p&生物节律与其他节律一样，有震荡的幅度、周期、相位。&/p&&p&&br&&/p&&p&节律是生物钟的外在表现，生物钟是内在的定时机理。生物钟本身是自我维持的生理和行为节律发生器（pacemaker），可以受外界环境因素（zeitgebers）所导引、从而同步化。&/p&&p&&br&&/p&&p&生物有多种节律，不同的生物有着不同的节律，同一生物也有多种节律。有些动物每年一个周期的冬眠、有些植物每年一个周期的长叶落叶，动物还有更快的周期如呼吸和心跳…，而人们熟知的节律是昼夜节律。不仅大家熟悉的睡眠有昼夜节律，很多其他行为和生理指标也有昼夜节律。&/p&&p&&br&&/p&&p&公元4世纪，Androsthnenes知道罗望子树树叶的运动有昼夜差别（McClung, 2006）。意大利的Santorio Santorio（）前后30年记录自己从早到晚的摄食量、排泄量和体重变化，发现有昼夜规律。但他们未能区分外界影响的节律与生物自主的节律。1729年，法国天文学家Jacques Ortous de Mairan（）用含羞草做材料，观察其叶片和花的变化，将它放置在全暗处一段时间，叶片仍然有张有合，不依赖阳光，但他当时没敢提出植物的昼夜节律是内在的（de Mairan， 1729；Szymanski，1918）。达尔文也研究过植物的节律，并提出昼夜节律的可遗传性（Darwin and Darwin，1880）。常见的向日葵好像围绕阳光的方向转向，但通过红外照相机可以看到向日葵朝向东方的行为早于日出，所以也是内在节律所驱动。昼夜节律并不依赖于地球自转：放到太空，节律照常（Sulzman et al., 1984）。&/p&&p&&br&&/p&&p&Aschoff 和Wever （1976）总结人的昼夜节律，德国大学生待在二战留下的堡垒中，灯光恒定、食物恒定、温度恒定、声音控制。在外界环境线索缺乏的情况下，人们仍然保持昼夜节律，只是在十几天后相位滞后。&/p&&p&&br&&/p&&p&现在知道，从简单的单细胞蓝绿藻（cynobacteria）细菌到多细胞的人，很多生物有生物钟的存在，但并不清楚是否所有地球上的生物都有昼夜节律。昼夜节律周期接近24小时（常见22至25小时）。在环境线索缺乏时可以继续维持，节律的相位由最后一次环境线索（如光、或温度等）所确定。在环境噪音中，节律照常运行。在一定范围内，节律周期并不随温度的改变而剧烈改变，有温度补偿机制，这不同于一般生化反应：如温度每上升10℃，酶的催化活性提高一倍。&/p&&p&&br&&/p&&p&昼夜节律的生物学意义目前仍不清楚。当然在进化过程中，生物活动与地球自转相匹配，也许可以节省能量、或提高效率。但如果没节律又会怎么样呢？蓝绿藻有昼夜节律，把正常的蓝绿藻与生物钟周期异常的细菌在一起长期培养，发现最后生物钟正常的细菌占了绝大多数，由此可见生物钟对生物体有利（Ouyang et al., 1998；Woelfle et al., 2004）。拟南芥的研究也观察到，周期缩短或延长的拟南芥，其固碳量、生长、存活都是与环境设定昼夜周期相吻合的拟南芥最适合，即：短周期突变株在20小时昼夜环境下生活得更好；而长周期突变株在28小时的模拟环境下更好（Dodd et al., 2005）。这些观察，反映了只有当内外源周期保持一致时才最有利于植物生长。观察到周期正常有利于植物，不等于能够解释为什么，所以我们仍然是知其然、不知其所以然。&/p&&p&&br&&/p&&p&生物钟研究的新途径&/p&&p&&br&&/p&&p&怎么研究生物钟？&/p&&p&&br&&/p&&p&能看到动物、植物的变化，是外在表现，而不知道生物钟的核心：振荡发生器。&/p&&p&&br&&/p&&p&可以看到钟的长针、短针运动的轨迹，不等于理解了指挥它们运动的机械装置。&/p&&p&&br&&/p&&p&早期科学家用电生理研究生物钟，插电极到细胞观察电活动，曾观察到脑内特定部位SCN（视交叉上核，suprachiasmatic nucleus）的电活动有昼夜周期。用解剖学研究，可以了解哪个器官、组织、部位对于个体的生物钟至关重要。这一类研究中，在鸟类发现松果体很重要（Gaston and Menaker，1968；Zimmerman and Menaker，1979），而哺乳类动物的主钟（master clock）被认为是SCN。确定主钟的实验有三类，以SCN为例：损毁它导致动物失去昼夜节律（Moore and Eichler，1972；Stephan and Zucker，1972）；将它加回损毁后的动物可恢复昼夜节律（Lehman et al., 1987）；在捣毁后，移植其他动物的SCN，新节律与移植物来源的动物节律一样，例如，如果移植物来自周期22小时的动物，那么接受移植的动物周期也是22小时，而如果移植物来自周期20小时的动物，接受移植的动物也获得20小时的周期（Ralph et al., 1990）。&/p&&p&&br&&/p&&p&如果用遗传学研究生物现象，特别是用前馈遗传学（forward genetics）——随机筛选影响特定生物现象的突变——无需假设机理；这有别于通常采用的转特定基因、敲除特定基因的反向遗传学（reverse genetics）。这是遗传筛选的优点，但当时和现在都有人认为遗传筛选有很大的缺点：很多行为恐怕不是单个或几个基因所决定的，复杂的行为需要有很多基因参与，用遗传筛选对单个和少数基因有效，对更多基因参与的行为可能效果很差。&/p&&p&&br&&/p&&p&对于果蝇的行为，Jerry Hirsch就认为不能用单基因解释、也就不能通过遗传筛选的方法研究行为，只能同时改变很多基因进行代间选择来推断。而本哲（Seymour Benzer，）认为果蝇的行为可以用突变单个基因的前馈遗传学来进行研究。1970年代，他们曾发生激烈争论，Hirsch甚至给本哲所在加州理工学院的每一个教授写信称本哲的研究是伪科学。&/p&&p&&br&&/p&&p&本哲&/p&&p&&br&&/p&&p&纽约出生的波兰犹太裔美国科学家本哲的大学是物理专业，1945年至1953年任教于普渡大学物理系，先研究过当时的热门：锗（Benzer, 1946）。1948年他开始通过参加暑期课程、访问实验室来学生物。1953年转到生物系任教，研究分子生物学，有两个很重要的工作：遗传突变就是DNA碱基序列的变化（Benzer, 1955）；基因的顺反子定义（Benzer, 1959）。&/p&&p&&br&&/p&&p&&br&&/p&&p&&b&?&/b&本哲与果蝇模型。图片来源：wikipedia&/p&&p&&br&&/p&&p&在分子生物学做出诺贝尔程度的工作后，本哲与英国科学家、DNA双螺旋共同发现者Francis Crick（），南非犹太科学家、mRNA发现者Sydney Brenner（1927-）等认为，分子生物学的重要问题已解决、框架已建立，以后只有细节给后辈填空，而他们应该找下一个重要的领域。他们都选了神经生物学：Crick决定研究意识；Brenner决定需要新的模式生物研究神经生物学，他挑选了秀丽线虫，开发了线虫的遗传学，带出一批学生用线虫研究了发育生物学和神经生物学,虽然失去了mRNA应该获得的诺奖，但于2002年因为研究线虫获奖；本哲学习神经生物学后，决定用果蝇研究神经生物学。1967年，本哲转到加州理工学院，并开始发表果蝇行为的遗传学研究论文（Benzer，1967）。&/p&&p&&br&&/p&&p&本哲自1967年至2007年一直研究果蝇的行为。他转而研究神经生物学的初期，不仅同事笑他（研究脑袋愚蠢的果蝇，是不是研究者脑袋有毛病），而且“聪明”的学生一般不乐意跟他（你已经功成名就，不怕掉进陷阱，我们可年轻赔不起，不能舍命陪君子）。这一幕在他和Brenner身上都发生过。早期他们的学生要么不求功利、要么不懂生物、要么……总之大多都不是想安安稳稳的人。&/p&&p&&br&&/p&&p&结果，四十年中，本哲和他的学生们研究的很多方面都领先世界，包括学习记忆、性行为、离子通道、眼发育、人类神经退行性疾病的果蝇模型、痛等。他带出的几批学生和博士后成全世界神经生物学的重要一支。&/p&&p&&br&&/p&&p&本哲的分子生物学研究达到了诺奖程度，而他研究生物钟也明显达到诺奖程度。&/p&&p&&br&&/p&&p&偷懒是创新之母&/p&&p&&br&&/p&&p&1971年和1972年出现三篇文章，用遗传学研究生物钟。Konopka和Benzer（1971）发现影响果蝇生物钟的突变、Feldman和Wasar（1971）发现影响真菌（粗糙面包霉）生物钟的突变、Bruce（1972）发现影响绿藻生物钟的突变。突变是DNA序列的变化，位于特定基因内部、或者旁边的DNA变化，可能影响基因的功能。有突变就有基因，这是那以前的遗传学常识。&/p&&p&&br&&/p&&p&早在1935年就知道果蝇有生物节律。因为果蝇的研究者多，其研究工具多于真菌和绿藻。当然研究果蝇生物钟的科学家前赴后继也很重要。最终，果蝇的研究对生物钟的理解起到的推动作用不仅多于真菌和绿藻，也多于其他任何生物。&/p&&p&&br&&/p&&p&生物钟的课题为当时还是研究生的Ronald Konopka（）所提出（Rosbash，2015），在本哲用遗传研究行为的总体框架之中。&/p&&p&&br&&/p&&p&&br&&/p&&p&&b&?&/b&Ronald Konopka（）&/p&&p&&br&&/p&&p&遗传筛选的实验设计是：建立检测表型的方法，用致变剂诱导特定生物的不同基因发生突变，检测不同突变种的表型。具体到果蝇的生物钟，就应该是建立检测生物钟的方法，用化学诱变剂诱导不同基因突变，然后一只一只检测果蝇，以便发现改变了昼夜节律的突变种。&/p&&p&&br&&/p&&p&当时没人知道果蝇有约两万个基因，化学分子诱发随机突变，只做两万只果蝇不够，其中部分突变在相同基因，所以应该加几倍，才可能大部分基因都突变过一次。因行为有漂移，一个基因的突变种，不能仅检测一只果蝇，应该检测几只到几十只。果蝇是二倍体，每个基因有两套，一套坏了可以被另一个等位基因所代偿，所以最好不要做子一代（F1）的筛选，而最好是F2代，传代后再筛选，而F2代只有四分之一是同一基因突变的纯合子那么需要筛选的数量应一两百万，才算做过全基因组的筛选。&/p&&p&&br&&/p&&p&检测果蝇昼夜节律的标准方法，是将单只果蝇放到透明的管中，管子只容一只果蝇来回走动。一束光射过小管的中央，凡是果蝇走过管中央，计算机就记录果蝇运动了一次。以此检测果蝇活动的变化，发现确实有昼夜规律。如检测很多果蝇，工作量比较大。&/p&&p&&br&&/p&&p&Konopka和Benzer用了两个偷工减料方法来加快速度。其一是果蝇遗传学特有的attached X，可以快速检测X染色体的突变。其二是他们决定不筛选昼夜节律，而筛另一节律：果蝇羽化。果蝇受精卵成为胚胎，发育成为幼虫，三次蜕皮后成为蛹，蛹经过羽化成为成虫。&/p&&p&&br&&/p&&p&昼夜活动节律是果蝇成虫每天经历一次、几十天周而复始的循环。而果蝇一生仅羽化一次。羽化一般在黎明前，最迟也在上午。三十年代到五十年代的研究明确提出羽化为独立于温度的生物钟所控制（Kalmus，a，1940b，Pittendrigh，1954）。但是，一生一次的羽化的生物钟与成虫每天的活动生物钟，是否有关，当时并不清楚。&/p&&p&&br&&/p&&p&Konopka觉得羽化作为筛选方法很容易操作。用单只果蝇做经典的昼夜活动规律检测比较慢。如果用羽化作为筛选方法，就很便当：化学诱变处理得到各种突变的果蝇猴，Konopka每天上午不来上班，午后到实验室把所有羽化的果蝇倒掉，留下其他蛹，下午到晚上再羽化的就是影响节律的突变种，因为它们的羽化时间不同于正常（所谓“野生型”）果蝇。这样的方法大大简化了检测、加速了筛选。&/p&&p&&br&&/p&&p&&b&偷懒，依赖人脑的偷懒，（有时）是创新之母。&/b&&/p&&p&&br&&/p&&p&生物钟研究的突破&/p&&p&&br&&/p&&p&对于一个研究生来说，用如此简单的方法，不难筛选几万只、几十万只、几百万只果蝇。但Konopka只筛选了不到两百种品系的果蝇就得到第一个突变品系，继续筛选不到两千种品系的果蝇再得到两个突变品系。&/p&&p&&br&&/p&&p&他们用羽化筛到突变品系后，更重要的是用标准检测运动的昼夜节律之方法看个体的昼夜活动是否变化，结果发现确实突变果蝇的运动昼夜节律异常。有趣的是，他们发现的三种品系的突变果蝇在表型上并不相同：一种没有节律，一种节律周期长短加快到19小时，一种节律变慢到28小时。他们进一步将突变种与已有的其他突变交配，确立三种突变在染色体图谱的大概位置，结果发现很近，他们进一步把三种突变相互交配，进行本哲发明的顺反检测，试图确立它们是否同一基因，他们根据得到的结果推测三种突变可能是同一个基因的不同突变。&b&他们把这个基因命名为&i&period&/i&（简写&i&per&/i&）&/b&，无节律的为&i&per0&/i&（per zero）、节律短的为&i&pers&/i&（per short）、节律长的为&i&perl&/i&（per long）。这里需要说明，他们进行的顺反检测并不严格，只做了反位（trans）的检测没做顺位（cis）的检测，所以只从1971年的文章不能完全断定三个突变是否同一基因，虽然当时的结果支持这一可能。&/p&&p&&br&&/p&&p&他们筛选的果蝇数量不多，却得到了一个基因的三种不同方向的突变，因此显得特别有运气。&/p&&p&&br&&/p&&p&各种筛选和检测生物钟的方法，都有可能在一些非生物钟关键的基因导致的突变而有所影响。同一个基因可以出现三个方向的突变，不仅是运气，而且对于这个基因的功能也提供了很好的支持：很难设想不参与驱动生物钟的基因可以导致三个不同方向的突变表型。如果三个突变确为一个基因的三种突变，那么&i&per&/i&基因很可能是生物钟的关键基因之一。&/p&&p&&br&&/p&&p&本哲于1940年代末期学生物的老师、1969年诺奖得主、德国物理学家转为美国生物学家的Max Delbrück（），这时也在加州理工学院，他听本哲说结果后，并不信找到了生物钟的基因：&/p&&p&&b&Max Delbrück: “I don’t believe it”&br&&/b&&/p&&p&&b&Benzer: “But Max, we found the gene!” &/b&&/p&&p&&b&Delbrück: “I don’t believe a word of it.”&/b&&/p&&p&&br&&/p&&p&克隆&i&per&/i&基因：竞争的好处&/p&&p&&br&&/p&&p&1971年，因为技术缺乏，不可能得到&i&per&/i&基因的DNA（“克隆基因”）。重组DNA技术于1973年才发明，而克隆果蝇DNA的技术还要等到1978年在斯坦福大学的David Hogness和加州理工学院的Tom Maniatis等人的工作推动下才能进行。待所有技术都成熟以后才开始研究较容易，也容易成为跟风；不待技术成熟就开始研究是开拓，但有很大的危险，如果领先几十年，可能开拓者一生也用不上。&/p&&p&&br&&/p&&p&1980年代是基因克隆的烽火连天时代。两个团队竞争克隆果蝇的per基因：洛克菲勒大学的Michael Young（杨迈克）；Brandeis大学的Jeffrey Hall（霍尔）与Michael Rosbash（罗斯巴希）。杨迈克是研究果蝇出身，博士后的老师为克隆果蝇DNA的先驱David Hogness。霍尔是本哲的博士后，懂果蝇，到Brandeis后与分子生物学专长的同事罗斯巴希合作。这些科学家都还有其他研究课题，杨迈克同时在与耶鲁大学的希腊裔生物学家Spiros Artavanis-Tsakonas竞争克隆&i&Notch&/i&基因，霍尔还在研究果蝇性行为的fruitless基因，罗斯巴希多年用酵母研究mRNA剪接机理。&/p&&p&&br&&/p&&p&&br&&/p&&p&&b&?&/b&左起分别为，迈克尔·杨（Michael W Young）、杰弗理·霍尔（Jeffrey C Hall）、迈克尔·罗斯巴希（Michael Rosbash），三人曾获得2013年第十届邵逸夫奖生命科学与医学奖。 &/p&&p&&br&&/p&&p&1984年，杨迈克和霍尔—罗斯巴希两个团队都拿到&i&Per&/i&基因附近的基因组DNA（Bargiello and Young，1984；Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984）。这段DNA可以产生4.5kb和0.9kb两种mRNA，所以可能对应两个基因。霍尔—罗斯巴希组观察到0.9kb之mRNA的含量有昼夜变化（Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984），认为相应的DNA为&i&per&/i&基因。杨迈克认为4.5kb对应的基因是&i&Per&/i&基因。后来两个团队都确认4.5kb对应的是&i&per&/i&基因（Bargiello et al., 1984； Hamblen et al., 1986; Lorenz et al., 1989）。将编码4.5kb mRNA的基因组DNA转入果蝇，可以使&i&per&/i&突变种果蝇的昼夜节律恢复正常。进一步发现改变导入的&i&per&/i&基因表达的相位可改变果蝇昼夜节律的相位（Edery et al., 1994）。&/p&&p&&br&&/p&&p&在两个团队的竞争过程中，一个组出现错误（霍尔—罗斯巴希组最初错认了&i&per&/i&基因），被另外一个组纠正，这是竞争对科学界的好处。&/p&&p&&br&&/p&&p&两组科学家都确定了per基因在最初三种突变株的DNA变化：&i&per0&/i&、&i&pers、perl&/i&分别是提前终止、和两个不同部位的碱基变化（Baylies et al., 1987; Yu et al., 1987a）。&/p&&p&&br&&/p&&p&霍尔—罗斯巴希组的中国留学生俞强还发现，缺失per蛋白质特定一段区域，昼夜活动节律不受影响，只影响求偶时果蝇翅膀有节律的歌唱（Yu et al., 1987b）。霍尔实验室在1980年发现果蝇求偶时的翅膀振荡有节律（Kyriacou and Hall，1980），其后有争议，近年有人正式提出商榷（Stern, 2014; Kyriacou et al., 2017; Stern et al., 2017）。&/p&&p&&br&&/p&&p&霍尔—罗斯巴希组早期参与生物钟研究的中国留学生有：复旦大学本科毕业的俞强，北京医学院的刘欣（Liu et al., ），复旦的黄佐石 （Huang et al., 1993），武汉大学的曾红葵（Zeng et al., 1996）。&/p&&p&&br&&/p&&p&&i&per&/i&的功能：竞争的坏处&/p&&p&&br&&/p&&p&拿到基因，令人鼓舞。&/p&&p&&br&&/p&&p&但是，拿到基因不一定就能够立即知道机理。正如测序人类基因组只是工具，而不是美国总统等政治人物在一些羞耻感比较弱的科技工作者诱导下称测序人类基因组就是揭示人类奥秘。&b&今天对人类的奥秘还远远不清楚，单纯测序本身也没有自动解开人类奥秘。&/b&&/p&&p&&br&&/p&&p&同理，拿到了&i&per&/i&基因的DNA，并不知道它所编码产生的蛋白质的功能，也不能推导出生物钟的机理。有时，拿到基因后很长时间都不能理解其功能，也就不能理解生物学过程或者人类疾病的机理。比如，莱－尼（Lesch-Nyhan）综合征，病人自残，是很特殊的疾病，其基因已经知道多年，编码HGPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶），是核酸代谢的一个酶，但知道基因、知道蛋白质都不能告诉我们为什么病人会自残，也不能告诉我们有残害他人能力的人们绝大多数都不会自残的生理学原因。&/p&&p&&br&&/p&&p&要推出基因编码蛋白质的功能，如果其预计的氨基酸序列与其他某种蛋白质有相似性，那么功能就可能相似，从而可以提供研究的着手点。两个组都看到per蛋白质有部分序列是重复的，杨迈克实验室还以为它相似于小鼠的序列（Shin et al., 1985），后来发现并非如此。&/p&&p&&br&&/p&&p&1986年，两个课题组都发表文章称per蛋白质是蛋白多糖（Jackson et al., 1986; Reddy et al., 1986）。这次两个课题组都错了，竞争的课题组错成一样是咄咄怪事。&/p&&p&&br&&/p&&p&1987年，杨迈克课题组与爱因斯坦医学院的David Spray实验室合作，进一步发表文章（Bargiello et al., 1987），称Per影响了细胞间交流（提示per可能起缝隙连接相关的功能，比如缝隙蛋白），这一结果很可能是从猜测per是蛋白多糖——可能是膜蛋白——所以可能是缝隙蛋白的潜意识造成。但这一结果不能重复，1992年杨迈克和Spray合作团队不得不道歉并收回1987年令人瞩目的《自然》文章（Saez et al., 1992）。霍尔—罗斯巴希组于1993年也发表文章说明Per不参与细胞间连接（Flint et al., 1993）。&/p&&p&&br&&/p&&p&从，在激烈竞争的过程中，两个课题组都错了两次：各自分别错了一次，同时错了一次。同一项研究错过两次的比较少，出一样的错不免尴尬。&/p&&p&&br&&/p&&p&&i&per&/i& mRNA的研究：仔细不是坏事 &/p&&p&&br&&/p&&p&克隆获得了基因，再看基因的表达是自然的延伸。&/p&&p&&br&&/p&&p&分子生物学的“中心法则”：DNA—RNA—蛋白质。DNA承载遗传信息，可以复制和遗传；在DNA指导下，遗传信息转录为信使核糖核酸（mRNA）；在mRNA指导下合成蛋白质，蛋白质再起各种功能。不同基因转录产生不同mRNA、得到不同蛋白质，产生不同功能。&/p&&p&&br&&/p&&p&检测基因表达可以检测mRNA的表达，也可以检测蛋白质的表达。一般来说，一个动物的大部分细胞含有同样的DNA，而含有不同的mRNA和蛋白质。霍尔—罗斯巴希组、杨迈克组都检测&i&per&/i&的mRNA和蛋白质表达在什么时间和空间（James et al., 1986；Saez and Young, 1988；Liu et al., 1988；Siwicki et al., 1988；Zerr et al., 1990；Liu et al., 1992），其中费了很大的劲制造per蛋白质的抗体，因为mRNA只能抗基因表达的区域和细胞，帮助理解哪些区域和细胞可能是果蝇的生物钟。但mRNA不能看到其产物蛋白质所在的亚细胞定位，而抗体可以识别蛋白质而确定per蛋白质在细胞内的位置。per蛋白质好像既可以存在于细胞核、也可以存在于细胞质（Saez and Young，1988；Siwicki et al., 1988）。到1992年，刘欣的文章才确认per蛋白质存在于细胞核（Liu et al., 1992）。&/p&&p&&br&&/p&&p&既然&i&per&/i&基因参与昼夜节律，那么&i&per&/i&的基因表达（mRNA或者蛋白质）是否也有时间调控，例如昼夜差别？ 1988年，霍尔—罗斯巴希组提出per的蛋白质有昼夜变化（Siwicki et al., 1988）。&i&per&/i&的mRNA是否有昼夜变化？理论上，研究RNA变化比研究蛋白质容易，因为不依赖于获得好的抗体，而只要得到基因的DNA就很快可以通过普通的分子生物学方法研究mRNA的表达。但最初未见&i&per&/i&的mRNA昼夜变化。一个可能是做实验的人技术不好、或不仔细，一个可能是偶然的：传说最初检测&i&per&/i& mRNA的人，是从果蝇全身获得RNA，只分昼夜时间、不分身体部位。而出现突破的1990年，是从果蝇头部提取RNA，避免其他部分（如腹部）所含RNA掩盖了头部mRNA。&/p&&p&&br&&/p&&p&为什么需要专门研究头里的&i&per&/i&基因?这与昼夜节律的关键部分存在于身体什么部位有关。在得到&i&per&/i&基因突变后，Handler和Konopka专门在不同突变型的果蝇之间进行局部细胞的移植，以便确定哪个部位起决定性作用。从pers果蝇取得脑组织，移植到per0果蝇腹腔中，发现&i&per0&/i&变成了&i&pers&/i&，显示脑确定节律（Handler and Konopka，1979）。1983年，离开加州理工学院在Clarkson大学的Konopka等再用遗传嵌合体做实验，让果蝇部分区域的细胞含突变的&i&per&/i&（如&i&pers&/i&），而其余部分仍然正常，结果发现：如果脑含&i&pers&/i&，果蝇的生物钟就变短（Konopka et al., 1980）。所以，移植实验和嵌合体实验皆支持&i&per&/i&基因在脑中控制全身的昼夜节律。&/p&&p&&br&&/p&&p&1990年，霍尔—罗斯巴希组的博士后Paul Hardin终于每个小时取果蝇的头得到mRNA，再检测&i&per&/i&的mRNA，发现它呈昼夜变化（Hardin，Hall，Rosbash，1990）。在&i&pers&/i&中，&i&per&/i&的mRNA昼夜周期也缩短。他们提出简单的模型：&i&per&/i&的基因转录&i&per&/i&的mRNA、翻译产生per蛋白质的过程存在负反馈，&i&per&/i&的mRNA或蛋白质产生后，可以影响&i&per&/i&基因自身的转录。他们当时不能排除&i&per&/i&调节昼夜节律这一行为之后，行为再通过更复杂的反馈作用于&i&per&/i&基因转录。这里需要用Occam剃刀原则，既首先检测最简单的可能性。这一简单解释提供了生物钟机制的理论突破，是迄今为止仍被公认的“转录—翻译负反馈环路（transcription-translation feedback loop, TTFL）”的基础，罗斯巴希称赞提出这一模型的博士后Hardin。&/p&&p&&br&&/p&&p&如果这一假设正确，那么per蛋白质就是基因的转录调节因子。而对于转录因子，1980年代有很多进展，从而可以为研究per和生物钟的机理提供很好的借鉴。&/p&&p&&br&&/p&&p&不久，霍尔—罗斯巴希组的Zerr又用抗体检测提出per蛋白质的表达，在部分脑区也有昼夜节律，这种节律的长短也被per本身所调节，因为在生物钟缩短的果蝇突变种&i&pers&/i&中，per的蛋白质昼夜周期也缩短（Zerr et al., 1990）。mRNA的昼夜节律与蛋白质昼夜节律之间有一定的间隔，也就是相位不同。几年之后知道不仅per蛋白质含量变化，而且其亚细胞定位变化：昼夜周期中，per蛋白质进入细胞核的时间有昼夜周期变化（Curtin et al., 1995）。&/p&&p&&br&&/p&&p&基因转录调控&/p&&p&&br&&/p&&p&1990年，研究果蝇生物钟的Hardin等提出per蛋白质可能调节基因转录，依据的是间接证据。&/p&&p&&br&&/p&&p&1991年和1992年，其他途径的研究发现了几个与per有相似性区域的蛋白质。研究果蝇胚胎发育的Crews实验室发现一个基因&i&single minded&/i&（&i&sim&/i&），其缺失导致果蝇胚胎腹侧中线的神经细胞缺乏（Nambu et al., 1990）。研究环境致癌物的Hoffman等和Burbach等，发现一个被致癌物二恶英(dioxin)作用的受体Ah R（Hoffman et al., 1991；Burbach, Poland, Bradfield, 1992）。per、Ah R和sim三个蛋白质都相似的区域称为PAS区域。&/p&&p&&br&&/p&&p&因为AhR确定是转录因子，而且有专门调节转录的区域bHLH，所以提示per和SIM也是转录调节因子，但per缺AhR具有的转录调节区域，只有PAS区域。1993年，罗斯巴希实验室的黄佐石证明，PAS区域是蛋白质—蛋白质相互作用区域，PAS和PAS可以偶聚化（Huang, Edery and Rosbash，1993）。进一步研究提出，具有bHLH和PAS区域的蛋白质可能是转录激活因子，而只有PAS但缺乏bHLH的per蛋白质不能激活转录但可以抑制能够激活转录而同时有bHLH和PAS区域的蛋白质（Lindebro, Poellinger and Whitelaw，1995）。&/p&&p&&br&&/p&&p&Hardin自己独立实验室后，证明per蛋白质调控&i&per&/i&基因转录，依赖于&i&per&/i&基因在蛋白质编码区域之上游（分子生物学称为5’端）的DNA序列（Hao, Allen and Hardin, 1997）。以后有更多证据表明，per参与转录调节，而且与多个基因有关。&/p&&p&&br&&/p&&p&更多参与果蝇生物钟的基因&/p&&p&&br&&/p&&p&影响生物钟不可能只有一个基因。&/p&&p&&br&&/p&&p&1971年发现第一个影响果蝇生物钟的基因&i&per&/i&。&/p&&p&&br&&/p&&p&1983年，Jackson发表了影响果蝇生物钟的其他基因（Jackson，1983），但无果而终。&/p&&p&&br&&/p&&p&1990年，霍尔—罗斯巴希组发表“新”的果蝇昼夜节律基因“&i&钟&/i&”&i&（Clock）&/i&（Dushay et al., 1990），不够他们于1992年发现这不是新的基因而仅为per基因的另一突变而已（Dushay et al., 1992），辛勤努力化为一江春水。&/p&&p&&br&&/p&&p&1991年Konopka 等发表第二个影响果蝇生物钟的基因&i&Andante&/i& （Konopka, Smith and Orr，1991）。注意这一基因的人不多，到2003年它才被Tufts大学的Rob Jackson实验室所克隆（Akten et al., 2003）。&/p&&p&&br&&/p&&p&1991年洛克菲勒大学杨迈克实验室的Sehgal等在会议上报道她们筛选影响果蝇生物钟的新基因（Sehgal et al., 1991）。&/p&&p&&br&&/p&&p&1994年，杨迈克实验室报道他们发现了&i&timeless&/i&基因（“&i&无时间&/i&”，简称&i&Tim&/i&），这次Seghal等通过筛选7千多个突变种找到第三个影响果蝇生物钟的新基因（Seghal et al., 1994）。他们用了转座子插入诱导突变，以利克隆基因，而最初的检测也是羽化，其后用活动节律核实确实影响了昼夜节律。她们还发现&i&tim&/i&的突变也影响&i&per&/i&的RNA昼夜变化，所以与&i&per&/i&基因相关。杨迈克实验室的研究生Leslie Vosshall发现Tim影响Per蛋白质出入细胞核（Vosshall et al., 1994）。&/p&&p&&br&&/p&&p&杨迈克实验室很快克隆到&i&tim&/i&基因（Myers et al., 1995）。虽然预计的tim蛋白质序列看不出它是怎么作用的蛋白质，但因为它可以结合per，那么估计也是转录因子。罗斯巴希实验室的研究生曾红葵发现tim与per两个蛋白质的相互作用有昼夜节律，而光可以调节tim蛋白质的稳定性，从而提供了光对生物钟的调节的分子机理（Zeng et al., 1996）。&/p&&p&&br&&/p&&p&调节其他生物昼夜节律的基因&/p&&p&&br&&/p&&p&多种生物，从细菌、植物到包括人在内的动物，都有节律、有昼夜节律。存在于多种生物的生物钟，是否用同样的分子？是否用同样的机理？ &/p&&p&&br&&/p&&p&粗糙面包霉（neurospora）的生物钟基因Frequency （&i&frq&/i&，“&i&频率&/i&”）于1989年被克隆，当时以为它与&i&per&/i&有部分序列相似（McClung, Fox, Dunlap，1989），后来发现不相似。&/p&&p&&br&&/p&&p&控制有些细菌生物钟的基因也纷纷被克隆（如，Liu et al., 1995）。&/p&&p&&br&&/p&&p&1995年，调节植物（如拟南芥）生物钟的基因被克隆（Millar et al., 1995）。&/p&&p&&br&&/p&&p&很多人关心的是：哺乳类的生物钟，用什么基因？&/p&&p&&br&&/p&&p&千呼万唤始出来：哺乳动物的生物钟基因&/p&&p&&br&&/p&&p&调节哺乳动物生物钟的第一个基因&i&tau&/i&的突变种于1988年被偶然发现（Ralph and Menaker，1988），但基因克隆需要等到2000年（Lowrey et al., 2000），它编码一个蛋白激酶（CKIε）。&/p&&p&&br&&/p&&p&在克隆了果蝇&i&per&/i&基因的1984年至1997年，有很强烈的希望找到哺乳类生物钟基因，明显应找类似&i&per&/i&的基因，但这一途径费尽九牛二虎之力，并无显著成果。曾找到了蚕的&i&per&/i&基因（Reppert et al., 1994），但它无助于找哺乳类的&i&per&/i&。&/p&&p&&br&&/p&&p&时代呼唤英雄，找到哺乳类生物钟基因的英雄。&/p&&p&&br&&/p&&p&在美国芝加哥北郊西北大学工作的日裔科学家高桥决定不再依赖容易的方法，而用老鼠做遗传筛选。&/p&&p&&br&&/p&&p&果蝇很小、生活周期短，方便且便宜。用要贵很多。如果通过筛选找基因，那么除了如果蝇一样算数量，还要考虑经费。为了在一定范围省时间和经费，高桥实验室不筛选纯合体突变种，而筛杂合体。不过筛杂合体虽然省了工作量，但也降低了突变检出率。即使这样，也需要超过十万只的老鼠才能筛一遍。有个笑话：做这种实验，类似把豪华旅馆献给老鼠。&/p&&p&&br&&/p&&p&1994年，可能世界上没一个实验室认为自己有足够的经费。很可能用完了经费还找不到影响老鼠生物钟的基因，所以没人敢做。&/p&&p&&br&&/p&&p&高桥带领实验室是发愤图强、还是铤而走险?&/p&&p&&br&&/p&&p&他们的勇气遇到了运气。他们当时一共只研究了304只小鼠，第25只就是影响生物钟的突变体，他们从而发现了影响老鼠生物钟的基因，他们命名为“&i&钟&/i&”（&i&Clock&/i&）（Vitaterna et al., 1994）。正常老鼠生物钟的周期是23.7小时，&i&Clock&/i&杂合的突变鼠昼夜节律为24.8，变化可谓微妙，需要可靠的检测才能发现。从杂合体检测出微小但可靠的变化后，高桥实验室很容易通过交配小鼠而获得&i&Clock&/i&基因突变的纯合体，其表型很强：完全丧失节律。&/p&&p&&br&&/p&&p&1997年，高桥实验室在《细胞》杂志发表两篇论文，报道他们克隆的老鼠&i&Clock&/i&基因（King et al., 1997；Antoch et el., 1997）。&/p&&p&&br&&/p&&p&老鼠Clock蛋白质不仅有与蛋白质相互作用的PAS区域，而且有直接结合DNA的bHLH区域（King et al., 1997），从而更容易理解它如何调节基因转录。&i&Clock&/i&基因本身也表达于SCN。他们还发现人、鸡、蜥蜴、蛙、鱼也有&i&Clock&/i&基因（King et al., 1997）。&/p&&p&&br&&/p&&p&果蝇与哺乳类是否有类似的分子机理?&/p&&p&&br&&/p&&p&如果果蝇的&i&per&/i&基因只是在果蝇和昆虫起作用，那么意义就有限。如果找到高等动物的&i&Per&/i&并因此开启研究高等动物生物钟的分子机理，那么意义就较大。&/p&&p&&br&&/p&&p&果蝇的&i&per&/i&基因在1984年被克隆后，长期有人（如麻省大学伍斯特校区的Steven Reppert）试图在高等动物中找到&i&Per&/i&基因，但无果。一般来说，一个基因在低等动物中发现后，在高等动物中比较容易找到，有多种方法可以通过DNA序列相似性找到。找不到有几种可能：&i&Per&/i&在高等动物不存在，例如果蝇的生物钟可能高等动物的生物钟不同，也可以是果蝇和高等动物生物钟大体类似但其中有分子不同（如果蝇用&i&per&/i&但高等动物不用）；另一可能是研究者技术上的问题，在高等动物存在&i&Per&/i&基因，但未被找到。从1984年到1997年的努力都找不到哺乳动物的&i&per&/i&基因的情况下，很多人灰心地认为恐怕哺乳类无&i&Per&/i&。&/p&&p&&br&&/p&&p&1997年，两个实验室歪打正着，找到老鼠和人的&i&Per&/i& （Tei et al., 1997；Sun et al., 1997）。美国华人科学家在研究其他问题的时候，发现一个基因与&i&per&/i&有序列相似性（Sun et al., 1997）。比较它们后知道，以前没找到的原因是哺乳类的&i&Per&/i&与果蝇的&i&per&/i&基因在整个基因的相似性不很高，而局部很高。以前用整体去找很难找到，而用局部的困难在当时并不知道哪段是保守的。&/p&&p&&br&&/p&&p&哺乳类的Per基因有三个 ：&i&Per1、Per2、Per3&/i&（Shearman et al., 1997），&i&Per&/i&基因表达在SCN（Shearman et al., 1997），其表达随昼夜节律变化而变化，这一节律受&i&Clock&/i&基因的调节（Jin et al., 1999）。&/p&&p&&br&&/p&&p&1998年，霍尔—罗斯巴希组通过遗传筛选，也在果蝇找到&i&Jrk&/i&基因，发现就是果蝇的&i&clock&/i&基因（Allada et al., 1998）。有趣的是，Steve Kay实验室发现clock蛋白可以激活带有&i&per&/i&基因启动子片段E-box驱动的荧光素（luciferase）报告基因的表达，这一激活能被per自身所抑制，从而较好地实现负反馈环路的闭合（Darlington et al., 1998）。&/p&&p&&br&&/p&&p&首先在果蝇发现的&i&per&/i&基因终于在哺乳类找到了，而首先在老鼠发现的基因&i&Clock&/i&也在果蝇中发现了，从昆虫到哺乳类，生物钟的基因看来高度保守。这虽然是基因水平，但提示机理也保守。&/p&&p&&br&&/p&&p&从研究来说，钻研果蝇生物钟的科学家们就不用再担心是自己怪癖，而确实可能是探讨和揭示动物相通的普遍机理。&/p&&p&&br&&/p&&p&果蝇遗传筛选对生物钟研究的重要性&/p&&p&&br&&/p&&p&在生物钟的基因研究过程中，果蝇一马当先，科学家从中发现了&i&per&/i&（Konopka and Benzer，1971）、&i&andante&/i& （Konopka, Smith and Orr，1991）、&i&tim&/i&（Sehgal et al., ）。&/p&&p&&br&&/p&&p&用果蝇研究生物钟，在速度、价格、工作量上都优于哺乳类。用细菌、真菌、植物研究生物钟，也可以有这些优势，但它们的生物钟基因与动物的不同，研究它们不能揭示哺乳类的生物钟机理。&/p&&p&&br&&/p&&p&当然，在从各种生物得到答案之前，人们无法预料生物钟的机理保守的范围。但事后可以总结果蝇对于生物钟研究的重要性。&/p&&p&&br&&/p&&p&并非所有低等生物的研究都适用于高等生物，有些相通、有些不同。例如：细胞周期的原理从酵母到人都保守，而性别确定的机理从果蝇到人类并不保守。虽然研究低等生物特有的生物学原理也有科学意义，但人偏于关注对高等生物适用的分子和规律。&/p&&p&&br&&/p&&p&在发现&i&per、andante、tim&/i&等基因之后，科学家们还多次用果蝇继续筛选影响生物钟的基因。&/p&&p&&br&&/p&&p&霍尔实验室建立用荧光素接在&i&per&/i&基因位点，用酶活性间接报告&i&per&/i&的转录情况（Brandes et al., 1996；Stanewsky et al., 1997； Plautz et al., 1997），筛选了5137株影响荧光素表达的果蝇突变种，发现&i&chryptochrome&/i& （&i&cry&/i&）基因参与果蝇生物钟（Stanewsky et al., 1998）。用果蝇的遗传研究发现&i&cry&/i&的作用在于介导外界的光调节身体内在的生物钟（Stanewsky et al., 1998）。生物钟在没有外界环境影响的情况下，可以自行运转。在外界环境作用下，生物钟与外界相配合。虽然其他如声音、温度、进食也可影响生物钟，外界的光当然是调节生物钟的关键因素之一。&i&cry&/i&功能的发现解决了一个重要的问题。这里也可以看到，遗传筛选不仅为了找到基因，而且有时可能从基因编码的蛋白质推测出分子机理，而了解机理是生物学基础研究的核心。&i&cry&/i&本身的mRNA表达也有昼夜节律，它也调节&i&per&/i&和&i&tim&/i&表达与光的关系（Emery et al., 1998；Stanewsky et al., 1998）。 &/p&&p&&br&&/p&&p&果蝇有4套染色体。罗斯巴希—霍尔合作筛选第三号染色体，用化学诱变得到遗传突变种，筛选了6千多种以后，发现&i&jrk&/i&基因（Allada et al., 1998）。令人欣慰的是，果蝇的&i&jrk&/i&原来就是小鼠&i&Clock&/i&基因的同源基因。再找到的&i&cycle&/i&基因，也有小鼠的类似基因&i&Bmal&/i&（Rutila et al., 1998）。再度证实从昆虫到哺乳类用同样的基因调节生物钟。&/p&&p&&br&&/p&&p&杨迈克实验室在果蝇的第2和第3号染色体筛选了多于1万5千种突变，发现了他们命名为&i&doubletime&/i&的（“&i&加时&/i&”）基因，而它编码了酪蛋白激酶ε（CKIε）（Price et al., 1998）。它可以调节per蛋白质的稳定性。高桥实验室于2000年克隆了金仓鼠的&i&tau&/i&基因，发现原来也是CKIε（Lowrey et al., 2000）。开始研究蛋白激酶导致磷酸化、磷酸化调节蛋白质稳定性。&/p&&p&&br&&/p&&p&到2001年，已知多个基因在果蝇和小鼠都调节生物钟：包括果蝇的一个&i&per&/i&和小鼠的三个&i&Per&/i&基因、果蝇的一个&i&cry&/i&和小鼠的两个&i&Cry&/i&基因、果蝇的一个&i&jrk/clock&/i&和小鼠的两个&i&Clock&/i&基因（&i&Clock&/i&和&i&Npas2&/i&）、果蝇的&i&cycle&/i&和小鼠的&i&Bmal1&/i&基因、果蝇的doubletime和小鼠的&i&CKIδ&/i&和&i&CKIε&/i&基因（Reppert and Weaver, 2001）。&/p&&p&&br&&/p&&p&筛选生物钟相关基因的其他途径&/p&&p&&br&&/p&&p&在完全不理解分子机理的情况下，用遗传筛选生物钟，是很强的方法。从分子上，称之为“盲筛”，未尝不可。盲筛的优点在于无需事先知道机理，而通过遗传得到突变、DNA克隆得到分子、分子的序列特征或更多研究，再揭示机理，或提供揭示机理的可能性。这是一些人所谓的&b&“遗传学的令人敬畏的力量”&/b&（the awesome power of genetics）。这一途径被用于多个重要问题的研究，生物钟是早期的研究对象之一，但非唯一。&/p&&p&&br&&/p&&p&在有其他线索时，在有其他突破点时，自然也无需假定遗传学是唯一途径。&/p&&p&&br&&/p&&p&在生物钟研究中，当人们知道&i&Per&/i&的mRNA表达有昼夜节律， Per蛋白质与Tim蛋白质有相互作用，蛋白激酶参与生物钟，那么可以通过这些特征找其他基因（Abruzzi et al., 2017）。当技术发展，如分子生物学的RNAi（RNA干扰）技术等之后，也自然可以用新技术研究老问题。&/p&&p&&br&&/p&&p&事实上，早在1995年，哈佛医学院Weitz实验室的Gekakis等通过Per蛋白质寻找与Per直接相