变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, PCR-DGGE）和一样，也是一个常用的分子生物学实验，在环境生物技术领域常用于分析微生物群落的多样性。实验的大体操作流程如下，比较麻烦，影响因素很多，有一段时间我曾经，反复优化各个条件，非常无聊。
1. PCR扩增
与普通不同之处是Primer上要加一个GC夹（GC Clamp)，GC夹的序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC
常用的细菌16S通用引物341fGC/518r的序列如下：
341fGC: 5′-CGCCCGCC GCGCGCGGC GGGCGGGG CGGGGGC ACGGG GGGCCTACG GGAGGC AGCAG-3′
518r: 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′
2.制作凝胶
需要的准备的试剂：
(1)新鲜配制的Ammonium Persulfate Solution（APS） 0.1g in 1ml H2O
(2)四甲基乙二胺(TEMED)
(3)0%和100%变性剂（100%的变性剂不容易溶解，可以用80%的来代替），配制方法见最下面的表格
准备四种不同浓度的凝胶：
顶层胶： 4ml 0%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液
底层胶： 1ml 80%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液
如果DGGE需要的变性剂梯度为40%～60%，需要配制40%和60%变性剂凝胶溶液各约13ml：
40%变性剂凝胶溶液：6.5ml 0%变性剂+6.5ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液
60%变性剂凝胶溶液：3.25ml 0%变性剂+9.75ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液
如需其它梯度，请重新计算。
这几种溶液加在一起后，很快就会凝固，所以混合之前一定要准备好凝胶制作装置。具体制作方法请参考凝胶制作装置的说明书。我们实验室用的是Hofer Gradient Maker，感觉效果还可以。
将PCR产物和Loading buffer混合后加入胶孔，温度设定为60度，然后开始电泳。不同样品需要的电泳的电压和时间可能不同，需要优化一下，根据我的经验，120V, 6h对很多样品都比较和合适。
用万分之一的EB或SYBR Green I染色, 我比较了一下发现EB效果明显优于SYBR Green I。染色时间5分钟～30分钟都可以，染色时间太长效果并不一定好，我通常染5分钟。
染色后小心地将凝胶转移到gel documentation system中拍照，要尽快操作，否则在紫外光的作用下，很快图像的效果就会降低。
6. 结果分析
如果需要对DGGE结果进行定量分析，请参考：
需要说明的是，这种定量方法并不是很准，而且因为进行了PCR，定量有很多问题。
下面PCR-DGGE实验过程中用到的一些溶液的配置方法：
如转载，请以超链接形式注明：转载自： [
] 本文链接地址：
Tags: , , ,豆丁微信公众号
君，已阅读到文档的结尾了呢~~
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤PCR,pcr,PCR八,PCR8,pcr8
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='http://www.docin.com/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口豆丁微信公众号
君，已阅读到文档的结尾了呢~~
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='http://www.docin.com/DocinViewer-.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口关注今日：3 | 主题：292015
微信扫一扫
【原创】血液中直接PCR,无需DNA提纯
页码直达：
这个帖子发布于10年零99天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
由于全血中存在有很多PCR反应抑制物，例如，血红素，蛋白质，盐，抗凝剂等，使得常规的Taq聚合酶不能从全血中直接进行PCR反应。因此，现在临床上往往先要从全血中提取DNA, 但即使这样，也不能完全克服上述抑制物的影响，这也是为什么目前临床上的DNA扩增反应，常常失败的原因 如果在遗传病诊断中，能够从全血中快速有效地进行DNA扩增，可以节省大量的人力，时间，费用，对临床遗传病鉴定，以及亲子鉴定是一个**化的改进。KAPA全血直接PCR：是世界上首个专门为全血PCR改造的高效DNA多聚酶。通过直接分子进化平台改造的，专门为从全血中扩增DNA而设计的多聚酶试剂盒中包括有2x 即用反应混合液，能直接从含有EDTA的全血中，或者含有血液的滤纸或 “Guthrie” cards上，来扩增出DNA,无需DNA提纯。图例中是从人血液中扩增出的18个不同长度的片段。详情请参阅 附：直接分子进化技术
1 什么是直接分子进化（Direct Molecular Evolution）?
直接分子进化又叫高通量分子进化（High-throughput Molecular Evolution）。是通过特殊的工程技术来对蛋白质进行改造，并制造出具有特定功能的蛋白质。
2 为什么要运用直接分子进化
目前生物医药领域所使用的大部分生物酶都只是天然存在形式，即使有些酶经过常规的蛋白工程方法来改造，但是由于酶分子自身的结构和功能限制，要想得到真正满足科研工作人员需要的产品，却是一件费时费力的事情，而且常常达不到预期的要求。因此我们需要一种能在短时间内，改造出符合某种特定功能（比如，能够进行快速PCR的DNA聚合酶，或者对PCR抑制物有耐受性的DNA聚合酶）的生物酶。而直接分子进化就是为了满足这种需要而出现的高通量技术。
3 蛋白质改造工程的方法
为了进一步来了解什么是直接分子计划技术，以及其强大的功能和作用，让我们先来看看基于直接进化的蛋白改造和常规蛋白工程改造法的区别。
常规蛋白改造的步骤：
A. 已知蛋白质的结构和功能。
B. 通过计算机来找出重要的氨基酸，来模拟出这些氨基酸的改变，可能对蛋白质结构所造成的变化。C. 通过点突变得到包含有这些氨基酸改变的蛋白质，然后测试该蛋白质是否有实验者所预测出的某种功能的改变。
显而易见，这种常规的方法具有以下的缺点：
A. 首先要知道蛋白质的晶体结构，而已知结构的蛋白质只占全部蛋白质的一小部分。即使已知蛋白质的机构，这种晶体结构也只是一个粗率的结构。
B. 计算机的模型化本身就是一种不精确的过程。
C. 只能对一个，或很少的几个氨基酸来做变异，而不能对多个变异的协同作用来进行预测。D. 周期长。通过上述过程得到目的蛋白质，大约需要2-3年的时间。大大限制了使用高通量方法在蛋白改造工程中的应用。
4 为什么叫直接分子进化？和自然进化的区别以直接分子进化技术为基础的蛋白质工程改造，是通过高通量途径，在短时间内得到具有特定功能蛋白质的一种方法。在自然进化中，进化压力来自于环境选择。只有那些能适应某种特定环境的变异才能生存下来。这个过程需要几百年，甚至成千上万年的积累。直接进化技术正是针对这一现实情况，运用遗传，基因工程，生物信息学等技术来在分子水平上,设计真正满足不同实际要求的生物酶。在实验室中，进化压力来自于试验本身，大大缩短了时间，可以在很短时间内（2-3个月）来生产出满足实验者个性化的要求。因此，和自然进化相比，我们称之为直接分子进化。5 直接分子进化的成功关键是什么？
直接分子进化成功与否的保证是必须要有一个高效能的筛选技术。一般的文库有108个变异株，而现在世界上最先进的实验室也只能筛选104个，因此会遗漏掉一半的变异株筛选。如果要完全筛选文库里全部的变异株，那么就要建造一个更大的，并且很昂贵的实验室。这在目前的情况下，完全不现实。这个瓶颈问题可以很容易地通过KAPA Biosystems公司的乳状液膜技术（Emulsion Technology）来实现（如图例所示）。
其技术核心是在一个1ml的试管中，将含有表面活性剂和膜溶剂的油相和水相(内水相) 置于容器中,在高速搅拌下制成油包水型乳状液,再将此乳状液分散到另一种水溶液(第3 相)中, 就得到了水包油再油包水型乳状液膜。当乳状液分散到第3 相时,形成数亿万记的乳珠。这样，每个乳珠就变成了一个小的PCR反应室，实现高通量的目的。再通过KAPA专利技术来筛选出具有特定功能(比如，快速，或者超强PCR)的DNA聚合酶。和体积庞大的机械手相比，该技术的筛选过程是在1ml小试管中完成。能够完成对文库中所有变异株的筛选（&108）。在这个基础上，经过几次循环，就可以得到具有特定功能的聚合酶。
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
没看明白，前面说的很多，都看明白了，到了最后关键部分，该说直接进化是怎么回事了，就看不明白了，那个“油包水”似乎跟ABI等公司新出的测序技术比较像，怎么用来筛选聚合酶的？没看明白。楼主能不能详细介绍一下？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
就是指，每个乳珠相当于一个PCR反应室，里面包含大肠杆菌，并能翻译出一种DNA多聚酶（一个乳珠里只能表达出一种多聚酶），然后在模板，引物等PCR反应必需试剂存在的情况下，来进行PCR反应。成千上万个小乳珠里就含有不同的DNA多聚酶，这样来看哪一个乳珠里，PCR反应进行的最彻底，产物最高（一般扩增的PCR产物是荧光蛋白基因，这样经过翻译，可以通过荧光强度来决定PCR的好环）。然后，通过专利技术（保密）筛选出编码性能最好的DNA聚合酶。可以在乳珠里加入血液等，来筛选出能够耐受血液抑制物的DNA聚合酶。可参考一下文章： PNAS April 10, 2001
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢genosonmed，找到原文了。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园PCR问题汇总_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
PCR问题汇总
阅读已结束，下载本文需要
想免费下载更多文档？
定制HR最喜欢的简历
下载文档到电脑，同时保存到云知识，更方便管理
加入VIP
还剩15页未读，
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢