OD 值OD 是 optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检 测方法里的专有名词，检测单位用 OD 值表示，1OD＝1og（1／trans），其中 trans 为检测物的透光值。 光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同 一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。两对半 OD 值的意义
14:25密度梯度离心法密度梯度离心法 density gradient centrifugation method 〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个 离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液 里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密 度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用 这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡 法。自 1958 年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德 （J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA 和〔14N〕DNA 以来，该法取得许多成 果。为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度 离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。通常利用分析超离心机，但在将 细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采 用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离 超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离 心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。 这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与〔1〕 不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分 离物这点上是有优越性的。 因多采用蔗糖密度梯度， 所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。 按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。 密度梯度离心 又称速率―区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法； 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定 速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗 糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度； 操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不同 大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的 不连续区带； 可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。 方法 2： 纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法， 能得到比较纯的病毒。 其过程如下： 1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融 3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。 2、先以 5000g 离心 15 分钟后，获取上清夜，然后再 20000g 高速离心 30 分钟 后取上清夜。 3、接着 10 万 g 超速离心 2h，将沉淀用少量 STE 溶解。 4、先在超速离心管中加入 5-8mL 的第 3 步所获取的含病毒样品的溶解液，然后 在离心管中依次加入 30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上 加的。11 万 g 离心 2.5h,发现在 30 %与 45 % 以及 45 % 与 60 %之间都有一条明 亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。 5、去蔗糖；用 STE 缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后 11 万 g 离心 3h,用少量 S TE（根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。20 度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。EDTAEDTA品名：乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) 简称：EDTA 俗名；依地酸（特别是它的钙盐络合物，医学上称为依地酸钠钙） 分子量：292.248 分子式：C10H16N2O8 理化性质： 白色无臭无味、无色结晶性粉末，熔点 240℃(分解)。不溶于冷水、醇及一般有 机溶剂，微溶于热水，溶于氢氧化钠，碳酸钠及氨的溶液中，能溶于 160 份 100℃沸水。其碱金属盐能溶于水，钠盐在水中的溶解度见下表 (g/L)。 一般用乙二胺四乙酸 的钠盐代替 EDTA用途： 是一种重要的络合剂。EDTA 用途很广，可用作彩色感光材料冲洗加工的漂白定 影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添加剂，血液抗凝剂，洗涤剂，稳定剂，合 成橡胶聚合引发剂，EDTA 是螯合剂的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金 属等形成稳定的水溶性络合物。除钠盐外，还有铵盐及铁、镁、钙、铜、锰、锌、钴、 铝等各种盐，这些盐各有不同的用途。此外 EDTA 也可用来使有害放射性金属从人体 中迅速排泄起到解毒作用。也是水的处理剂。 EDTA 的制备： 由乙二胺与一氯乙酸在碱性溶液中缩和或由乙二胺、氰化钠和甲醛水溶液作用而 得。 实验室制法： 称取一氯乙酸 94.5g(1.0mol)于 1000mL 圆底烧瓶中， 慢慢加入 50%碳酸钠溶液， 直至二氧化碳气泡发生为止。加入 15.6g(0.2mol)乙二胺，摇匀，放置片刻，加入 40% NaOH 溶液 100mL，加水至总体积为 600mL 左右，装上空气冷却回流装置，于 50℃ 水浴上保温 2h，再于沸水浴上保温回流 4h。取下烧瓶，冷却后倒入烧怀中，用浓 H Cl 调节 pH 至 1.2，则有白色沉淀生成，抽滤，得 EDTA 粗品。精制后得纯品。 生产原理： 由乙二胺与氯乙酸钠反应后，经酸化制得：反应 1也可由乙二胺与甲醛、氰化钠反应得到四钠盐，然后用硫酸酸化得到：反应 2工艺流程工艺流程原料配比(kg/t) 氯乙酸(95%) 2000 烧碱(工业品) 880 乙二胺(70%) 290 盐酸(35%) 2500 〔若用硫酸代替盐酸，则用硫酸(98%)1200kg〕 主要设备 成盐锅 缩合反应罐 酸化锅 水洗锅 离心机 贮槽 干燥箱 操作工艺 在 800L 不锈钢缩合反应罐中，加入 100kg 氯乙酸、100kg 冰及 135kg 30%的 氢氧化钠溶液，在搅拌下再加入 18kg 83%～84%的乙二胺。在 15℃保温 1h 后，以 每次 10L 分批加入 30%氢氧化钠溶液，每次加入后待酚酞指示剂不显碱性后再加入 下一批，最后反应物呈碱性。在室温保持 12h 后，加热至 90℃，加活性炭，过滤， 滤渣用水洗，最后溶液总体积约 600L。加浓盐酸至 pH 不小于 3，析出结晶。过滤， 水洗至无氯根反应。烘干，得 EDTA64kg。收率 95%。也可以在较高温度条件下进行。 例如，采用如下摩尔配比：乙二胺：氯乙酸：氢氧化钠=1∶4.8∶4.8，反应温度为 5 0℃，反应 6h，再煮沸 2h，反应产物用盐酸酸化即可得到 EDTA 结晶，收率 82%～9 0%。 质量指标 含量 ≥90% 铁(Fe) ≤0.01% 灼烧残渣 ≤0.15% 重金属(Pb2+) ≤0.001% 在 Na2CO3 中溶解度 合格 质量检验 (1)含量测定 采用配位滴定法。 先将乙二胺四乙酸用 KOH 配制成 pH 为 12.0～13.0 的试样液。 以酸性铬蓝 K 和萘酚绿作混合指示剂， 用试样液滴定于 120℃干燥过的分析纯 CaCO 3，当溶液由紫红色变为蓝绿色即为终点。 (2)灼烧残渣测定 按常规方法进行。 安全措施 (1)生产中使用氯乙酸、乙二胺等有毒或腐蚀性物品，生产设备应密闭，操作人员 应穿戴劳保用品，车间保持良好通风状态。 (2)产品密封包装，贮于通风、干燥处，注意防潮、防晒，不宜与碱性化学物品混 贮。 CAS No.： 60-00-4[编辑本段]EDTA 在水质监测中的应用举例EDTA 多用于水质监测中的络合滴定分析法。由于本身可以形成多种络合物，所 以可以滴定很多金属。元素周期表里的Ⅱ，Ⅲ，镧系，锕系金属都可以用 EDTA 滴定。 但是最常用的是用来测定水的碱度。以镁离子举例如下 镁的检测可以用 EDTA 滴定法分析。由于镁比铝轻，因此可以作为合金在航空、 航天上使用。另外利用镁易于氧化的性质，可用于制造许多纯金属的还原剂。也可用 于闪光灯、吸气器等。 测定水的总硬度就是测定水中钙、 镁离子的总含量， 可用 EDTA 配位滴定法测定： 滴定前： M + EBT M-EBT (红色) 主反应： M + Y MY 终点时： M-EBT + Y MY + EBT (红色) （蓝色） 滴定至溶液由红色变为蓝色时，即为终点。 滴定时，Fe3+、Al3+等干扰离子可用三乙醇胺予以掩蔽；Cu2+、Pb2+、Zn2+ 等重属离子，可用 KCN、Na2S 或巯基乙酸予以掩蔽。 水的硬度有多种表示方法，本实验要求以每升水中所含 Ca2+、Mg2+总量（折算 成 CaO 的质量）表示，单位 mg? L-1。 器材和药品 1.器材 天平（0.1g、0.1mg） ，容量瓶（100mL） ，移液管（20mL） ，酸式滴定管 （50mL） ，锥形瓶（250mL）等。 2.药品 HC1（1∶1） ，乙二胺四乙酸二钠（Na2H2Y? 2H2O，A.R.） ，碱式碳酸镁 [Mg（OH）2? 4MgCO3? 6H2O，基准试剂]，NH3-NH4Cl 缓冲溶液（pH=10.0） ，三乙 醇胺（1∶1） ，铬黑 T 指示剂（0.2%氨性乙醇溶液）等。 实验方法 一、Mg2+标准溶液的配制（约 0.02mol? L-1） 准确称取碱式碳酸镁基准试剂 0.2~0.25g，置于 100mL 烧杯中，用少量水润湿， 盖上表面皿，慢慢滴加 1∶1 HC1 使其溶解（约需 3~4mL） 。加少量水将它稀释，定 量地转移至 100mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。 其浓度计算： 二、EDTA 标准溶液的配制与标定 1.EDTA 标准溶液的配制（约 0.02mol? L-1） 称取 2.0g 乙二胺四乙酸二钠（Na2H2Y? 2H2O）溶于 250mL 蒸馏水中，转入聚 乙烯塑料瓶中保存。2.EDTA 标准溶液浓度的标定 用 20mL 移液管移取 Mg2+标准溶液于 250mL 锥形瓶中， 加入 10mL 氨性缓冲溶 液和 3~4 滴 EBT 指示剂，用 0.02mol? L-1EDTA 标准溶液滴定，至溶液由紫红色变为 蓝色即为终点。平行标定 3 次。 EDTA 浓度计算： ，取三次测定的平均值。 三、水的总硬度测定 用 20mL 移液管移取水样于 250mL 锥形瓶中，加氨性缓冲溶液 6mL，1∶1 三乙 醇胺溶液 3mL，EBT 指示剂 3~4 滴，用 EDTA 标准溶液滴定，至溶液由紫红色变为 蓝色即为终点。平行测定 3 次。[编辑本段]十二烷基硫酸钠第一部分：化学品名称 化学品中文名称： 十二烷基硫酸钠 英文名称： dodecyl sulfate,sodium salt 简称：SDS 技术说明书编码： 2036 CAS No.： 151-21-3 分子式： C12H25SO4Na 分子量： 288.38 第二部分：成分/组成信息 有害物成分 CAS No. 十二烷基硫酸钠 151-21-3 第三部分：危险性概述 危险性类别： 侵入途径： 健康危害： 对粘膜和上呼吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。 环境危害： 燃爆危险： 本品可燃，具刺激性，具致敏性。 第四部分：急救措施皮肤接触： 脱去污染的衣着，用大量流动清水冲洗。 眼睛接触： 提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗。就医。 吸入： 脱离现场至空气新鲜处。如呼吸困难，给输氧。就医。 食入： 饮足量温水，催吐。就医。 第五部分：消防措施 危险特性： 遇明火、高热可燃。受高热分解放出有毒的气体。 有害燃烧产物： 一氧化碳、二氧化碳、硫化物、氧化钠。 灭火方法： 消防人员须佩戴防毒面具、穿全身消防服，在上风向灭火。灭火剂： 雾状水、泡沫、干粉、二氧化碳、砂土。 第六部分：泄漏应急处理应急处理： 隔离泄漏污染区，限制出入。切断火源。建议应急处理人员戴防尘 面具（全面罩） ，穿防毒服。避免扬尘，小心扫起，置于袋中转移至安全场所。若大 量泄漏，用塑料布、帆布覆盖。收集回收或运至废物处理场所处置。 第七部分：操作处置与储存操作注意事项： 密闭操作，加强通风。操作人员必须经过专门培训，严格遵守 操作规程。建议操作人员佩戴自吸过滤式防尘口罩，戴化学安全防护眼镜，穿防毒物 渗透工作服，戴橡胶手套。远离火种、热源，工作场所严禁吸烟。使用防爆型的通风 系统和设备。避免产生粉尘。避免与氧化剂接触。搬运时要轻装轻卸，防止包装及容 器损坏。配备相应品种和数量的消防器材及泄漏应急处理设备。倒空的容器可能残留 有害物。 储存注意事项： 储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开 存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏 物。第八部分：接触控制/个体防护职业接触限值 中国 MAC(mg/m3)： 未制定标准 前苏联 MAC(mg/m3)： 未制定标准 TLVTN： 未制订标准 TLVWN： 未制订标准 监测方法： 工程控制： 生产过程密闭，加强通风。 呼吸系统防护： 空气中粉尘浓度超标时，必须佩戴自吸过滤式防尘口罩。紧急 事态抢救或撤离时，应该佩戴空气呼吸器。 眼睛防护： 戴化学安全防护眼镜。 身体防护： 穿防毒物渗透工作服。 手防护： 戴橡胶手套。 其他防护： 及时换洗工作服。保持良好的卫生习惯。 第九部分：理化特性主要成分： 纯品 外观与性状： 白色粉末。 pH： 熔点(℃)： 204-207 沸点(℃)： 无资料 相对密度(水=1)： 1.09 相对蒸气密度(空气=1)： 无资料 饱和蒸气压(kPa)： 无资料 燃烧热(kJ/mol)： 无资料 临界温度(℃)： 无资料 临界压力(MPa)： 无资料 辛醇/水分配系数的对数值： 无资料 闪点(℃)： 无资料 引燃温度(℃)： 无资料 爆炸上限%(V/V)： 无资料 爆炸下限%(V/V)： 无资料 溶解性： 溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。 主要用途： 用作洗涤剂原料、印染工业的匀染剂、矿物的浮选剂。其它理化性质： 第十部分：稳定性和反应活性 稳定性： 禁配物： 强氧化剂。 避免接触的条件： 聚合危害： 分解产物： 第十一部分：毒理学资料急性毒性： LD50：2000 mg/kg(小鼠经口)；1288 mg/kg(大鼠经口) LC50：无资料 亚急性和慢性毒性： 刺激性： 致敏性： 致突变性： 致畸性： 致癌性： 第十二部分：生态学资料生态毒理毒性： 生物降解性： 非生物降解性： 生物富集或生物积累性： 其它有害作用： 无资料。 第十三部分：废弃处置 废弃物性质： 废弃处置方法： 处置前应参阅国家和地方有关法规。建议用焚烧法处置。焚烧 炉排出的硫氧化物通过洗涤器除去。 废弃注意事项： 第十四部分：运输信息危险货物编号： 无资料 UN 编号： 无资料 包装标志： 包装类别： Z01 包装方法： 无资料。 运输注意事项： 起运时包装要完整，装载应稳妥。运输过程中要确保容器不泄 漏、不倒塌、不坠落、不损坏。严禁与氧化剂、食用化学品等混装混运。运输途中应 防曝晒、雨淋，防高温。车辆运输完毕应进行彻底清扫。 第十五部分：法规信息 法规信息 化学危险物品安全管理条例 (1987 年 2 月 17 日国务院发布)，化学危 险物品安全管理条例实施细则 (化劳发[ 号)，工作场所安全使用化学品规 定 ([1996]劳部发 423 号)等法规，针对化学危险品的安全使用、生产、储存、运输、 装卸等方面均作了相应规定。 第十六部分：主要用途SDS 是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙 烯酰胺凝胶电泳。 它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸： 蛋白复合物。 在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂。RNase[编辑本段]Rnase：即 RNA 水解酶包括几种，RNase A 和 RNase HRNase H 是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到 DNA 链上的 RN A 磷酸二酯键，故能分解 RNA/DNA 杂交体系中的 RNA 链。该酶不能消化单链或双 链 DNA。 RNase A 是一种被详细研究和具有广泛应用的核酸内切酶.RNase A 对 RNA 有 水解作用，但对 DNA 则不起作用。RNase A 在 C 端和 U 端残基处专一地催化 RNA 的核糖部分 3'-与 5' -磷酸二酯键的裂开，形成具有 2',3'-环磷酸衍生物寡聚核苷酸。 可以用来去除 DNA 制品中的污染 RNA。 它们的合成目前资料还比较少。LB 培养基根据《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔著）配制每升培养基,应 该在 950 ml 去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0.用去离子水定容至 1L.在 1 5psi 高压下蒸汽灭菌 20min. LB 培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种 , 使菌种成倍扩增,达到使用要求.培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存 活和扩增的工程菌.通过培养工程菌,我们可以表达大量的外源蛋白,也可以拿到带有 外源基因的质粒,工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础 . LB 培养基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 10g/L 另外根据经验值用 NaOH 调节该培养基的 pH,使其达到 7.4(该 pH 适合目前使用 最广的原核表达菌种 E.coli 的生长)微量离心管一种小型的离心管，又称为 EP（eppendorf）管，与微型离心机配套使用，用于 微量试剂的分离离心。 1963 年，全世界第一只 eppendorf 微型离心管诞生于德国 eppendorf 公司，为 分子生物学微量操作实验提供了一种新的工具。今天 eppendorf 管已经成为实验室 不可缺少的小管子的专用代称。限制酶限制酶（Restriction Enzymes）全称限制性核酸内切酶 细菌反击 细菌容易被噬菌体感染，如已经在每月推荐分子中看到的 phix174 噬菌体。许多 细菌用切割外来 DNA 的方法进行自我保护，如切割感染性噬菌体的 DNA。这些细菌 产生一种能切割 DNA 的核酸内切酶，一旦发现外来 DNA 便将其切割，因此它们有效 地限制了噬菌体对细菌的感染，故这种核酸内切酶被称为限制酶。 分子剪刀 每种限制酶特异识别专一 DNA 序列，并在切割位点将其准确切割。例如，EcoR 1 切割 GAATTC 序列，切割位点在 G 与 A 之间。细菌将自身的 DNA 甲基化修饰， 防止了被自身核酸内切酶降解。这些甲基化基团被装到 DNA 大沟的腺嘌呤或胞嘧啶 上（依细菌种类而定），使限制酶不能与 DNA 序列结合，但又不影响这些 DNA 序列 上遗传信息的正常识别与表达。噬菌体 DNA 没有这些保护性的甲基化基团，所以会 被降解。每种细菌都有一种或几种用来切割特异 DNA 序列的限制酶，还有与限制酶 配对的甲基转移酶，用来防止限制酶降解细菌基因中的相应序列。EcoRⅠ限制性内切酶，由大肠杆菌产生，识别位点是：GAATTC 切割后的片段具有黏 性 它属于 限制性内切酶Ⅱ类。HindⅢ限制性内切酶，由流感嗜血杆菌 Rd 产生. 识别位点是：AAGCTT 切割后的片段具有黏性 它属于 限制性内切酶Ⅱ类。微量加样器（移液器）的具体操作方法点击次数：94 发布时间： 8:43:16微量加样器（移液器）的具体操作方法 （一）设定容量值 Pipetman P 加样器容量计读数由三位数字组成（显示所转移液体容量） ，读数精确到个 位数。Eppendorf Research 加样器容量计读数则由四位数字组成，读数精确到小数后一位，从上（最大有效 数字）到下（最小有效数字）读取。利用底部刻度可将容量调节到更精确的分度。Pipetman P 根据型号不 同，数字可能是黑色或红色的。Eppendorf Research 加样器的数字不同型号均为白色。 转动加样器的黑色调节环或按钮的白色调节旋钮均可设定容量。用白色调节旋钮设定容量比较方便和快 速，尤其是穿戴手套时。使用黑色调节环可较准确调节到设定值。 （二）吸液 首先选择一支合适的吸头安放在加样器套筒上。使用 P5000 及 P10ML 时，装吸头前必在套筒上加插一 过滤芯。稍加扭转压紧吸头使之与套筒间无空气间隙。未装吸头的加样器绝不可用来吸取任何液体。 标准吸液步骤如下： 1．把按钮压至第一停点。 2．垂直握持加样器，使吸头浸入液样中，浸入液体深度视型号而定。 3．缓慢、平稳地松开按钮，吸液样。等 1s，然后将吸头提离液面。用药用吸纸抹去吸嘴外面可能附着 的液滴。小心勿触及吸头口。 （三）放液 1．将吸头口贴到容器内壁并保持 100～400 倾斜 至第二停点以排出剩余液体。 3．压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过。 4．松开按钮。 2．平稳地把按钮压到第一停点。等 1s 后再把按钮压5．按吸头弹射器除去吸头（只有改用不同液体时才需更换吸头） 。 （四）预洗 当装上一个新吸头（或改变吸取的容量值）时应预洗吸头，先吸人 1 次液样并将之排回原容器中。 预洗新吸头能有效提高移液的精确度和重现性。这是因为第一次吸取的液体会在吸头内壁形成液膜，导 致计量误差。而同一吸头在连续操作时液膜相对保持不变，故第 2 次吸液时误差即可消除。 （五）致密及黏稠液体 对于密度低于水的液体，可将容量计的读数调到低于所需值来进行补偿。 例如： P20 移液器转移 10／11 血清。 用 先将读数调到 10／／1， 吸取后以重量法测定。 如实测体积为 9． 5 ／1l，即偏差 0．5／11，则将读数调到 10．5Pl 并重复 1 次。如第 2 次测定仍不够准确，根据偏差再作调 整。 排放致密或黏稠液体时，宜在第一停点多等 1～2s 再压到第二停点。 对密度高、黏稠大或挥发性的液体，推荐使用活塞正移动加样器。 （六）加样器吸头 加样器吸头是整个移液系统的有机组成部分，对其基本要求是，必须有高机械、热力学和化学稳定性， 且纯度高，生产过程纯净，无有机或化学物质（如染料）和重金属污染。选择密封良好的环口、薄壁和嘴 口尖细的吸头，将使得在加样时，吸头的安装或卸脱更加容易。吸头管壁有弹性，加样吸液时不会产生漩 涡，这样加样的精度就更高。吸头嘴口无毛刺，表面光洁平滑，使得其沾湿性极小，可避免液体滞留外壁 引起的误差。吸头应与加样器上吸头套筒密封完好，可防止由于空气泄漏而造成加样精度或准确度的误差。 此外，吸头还应有液体容积刻度线。D200 吸头在 20／1l 和 100~1 处有标记；D1000 吸头在 300~1 处有标 记，D10 吸头在 2／A1 处有标记。最后，吸头应可在 121℃下消毒 20min。 如果在使用加样器加样中，想绝对避免样品与样品、样品与加样器或样品与操作人员之间的污染，建议 使用 Diamond 带滤芯吸头。Diamond 带滤芯吸头可以经高温消毒，其内置滤芯不会损坏。 （七）注意事项 实验室基本上以使用连续可调的加样器为主。连续可调式加样器在使用时应注意以下几点，从而使加样器 能发挥最佳性能。 1．取液之前，所取液体应在室温（15―25℃）平衡。 2．操作时要慢和稳。 3．连续可调式加样器在取样加样过程中应注意移液吸头不能触及其他物品，以免被污染；移液吸头盒 （架子） 、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。 4．连续可调式加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。 5．吸头浸入液体深度要合适，吸液过程尽量保持不变。 6．改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸头。 7．发现吸头内有残液时必须更换。8．新吸头使用前应先预测。 9．为防止液体进入加样器套筒内，必须注意以下几点： ①压放按钮时保持平稳； ②加样器不得倒转； ③吸头中有液体时不可将加样器平放； ④P5000 及 P10ML 加样器一定要加滤芯。 10．勿用油脂等润滑活塞或密封圈。 11．不可把容量计数调超其适用范围。 12．液体温度与室温有异时，将吸头预洗多次再用。 13．移液温度不得超过 70℃。 14．使用了酸或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈。 15．连续可调式加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。 （八）故障排除 工作中如发现加样器漏气或计量不准，其可能原因及解决方法为： 1．套筒螺帽松动 用手拧紧螺帽。 2．套筒刮花或破裂 卸下弹射器，检查套筒。P2，P10 或 P20 加样器套筒破损时，活塞也可能变形。安 装套筒时应用手拧紧螺帽。 3．活塞或密封受化学腐蚀 更换活塞和密封圈。用蒸馏水洗涤套筒内壁。 发现套筒内有液体，可依下法清洁：卸下弹射器，拧下螺帽并用蒸馏水洗涤套筒、活塞、密封圈及 O 形 环，待完全干燥后重新组装。 发现 P5000 及 P10ML 滤芯变湿必须更换。 需要时，可将套筒、螺帽和弹射器在 121~C 消毒 20rain。注意密封圈及 O 形环不能高温消毒。 4．发现吸液时有气泡 ①将液体排回原容器； ②检查吸头浸入液体是否合适； ③更慢地吸人液体，如仍有气泡应更换吸头。 凡是更换了活塞或操作杆的加样器需进行全面调校。厦门慧嘉生物科技有限公司专业提供各品牌 ELISA 试剂盒 详情请登入: http://www.biohj.comhttp://www.biohj.com/product.aspx?cid=1查询，或联系
邮箱：关键词】微量加样器 使用 维护 校准1 基本原理、分类及适用范围 1.1 空气垫加样器 活塞冲程 （空气垫） 加样器中的空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与 活塞分隔开， 空气垫通过加样器活塞的弹簧样运动而移动，进而带动吸头中的样 本移动。加样体积一般在 1 μl 至 10ml 之间。适合于血清、血浆等普通样本的加 样，在临床上最常使用。 1.2 活塞正移动加样器 活塞正移动加样器的吸头与空气垫加样器吸头有所不同， 其内含一个可与加样器 耦合的活塞， 这种吸头一般由生产厂家配套生产，不能使用普通的吸头或不同厂 家的吸头。适用于具有高挥发性、高粘稠度以及密度大于 2.0g/cm3 的液体或聚 合酶链反应 (PCR)。 1.3 多通道加样器、电子加样器和分配器。 2 影响微量加样器准确的几种常见因素及对策 2.1 影响微量加样器的物理因素 2.1.1 流体静压 加样时，加样器吸头只能以垂直方式浸入 2-3mm，因为倾斜的 方式将减少液体柱的高度，导致吸取液体过多。 2.1.2 吸头润湿 当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以 薄膜的形式吸附在吸头里面，所以，在加样时先吸打液体数次，充分润湿吸头 管腔,以保证加样的一致性。 2.1.3 流体动力学 为确保样本的稳定释放，加样器吸头应靠在试管壁上，液体 顺着管壁流出， 避免出现液滴， 液滴的形成可由于其表面张力的作用而阻止样本 的释放。 2.2 加样器本身的质量因素 根据李伟贤等报道， 微量加样器的失准率与加样器的使用次数成正相关关系；同 标值的可调加样器的失准率比同标值的定值加样器失准率大。 标值容量小的失准率较容量大的失准率大。所以，有必要根据工作实际选用合适的加样器，并需要 定期校准。 2.3 吸头的质量因素 加样器吸头是整个移液系统的有机组成部分，对其基本要求是：必须有高机械、 热力学和化学稳定性好；纯度高；密封良好的环口、薄壁和嘴口尖细；管壁有弹 性；嘴口无毛刺，表面光洁平滑；应与加样器上吸头套筒密封完好。 3 微量加样器的正确使用方法 3.1 选择一支量程合适的加样器 加样器只能在特定量程范围内准确移取液体,如 超出最低或最大量程,会损坏加样器并导致计量不准。 3.2 设定容量值 有些加样器通过旋转按钮设置容量，有些则通过刻度显示。 3.3 选择合适的吸头装在加样器套筒上，稍加扭转压紧，使吸头套紧。否则，移 取的液体将少于设定的体积，或者液体会往下滴。 3.4 预洗吸头 当装上一个新吸头时（或改变吸取的容量值）应预洗吸头，先轻 轻吸打几次液样,可消除产生吸液误差。 3.5 吸液 手握移液器，大拇指按下按钮至第一停点，将加样器垂直浸入液面 2-3mm，然后缓慢平稳地松开拇指，慢慢吸入液体。停留 1s，然后将吸头提离 液面。用吸纸抹去吸嘴外面可能黏附的液滴。小心勿触及吸头口。 3.6 目测吸入的液体体积是否合理。 3.7 放液 将吸头口贴到容器内壁并保持 10° 倾斜，平稳地把按钮压到第一停 -40° 点，停 1-2s 后，继续按压到第二停点，排出残余液体。松开按钮，同时提起加 样器。 3.8 按吸头弹射器除去吸头（改用不同样本液体时必须更换吸头）。 4 加样器的维护 4.1 套筒螺帽松动 用手拧紧螺帽。 4.2 活塞或密封圈受化学腐蚀 更换活塞和密封圈。用蒸馏水洗涤套筒内壁。 4.3 发现套筒内有液体，可依下法清洁：卸下弹射器，拧下螺帽并用蒸馏水洗涤 套筒、活塞、密封圈及 O 型环，干燥后重新组装。 4.4 发现吸液时有气泡 将液体排回原容器；检查吸头浸入液体是否太深；换个 吸头重新吸取样本。 5 微量加样器的校准常用的方法有高铁氰化钾法、双蒸水称重法、水银称重法等，但此三种方法都存 在缺陷。在实践中，我们一般常用光电比色法进行校准。具体方法是：取三只试 管分别加入蒸馏水 5.0ml， 用校正过的血红蛋白吸管吸取 1.2g/L 曙红 B20μl 混匀， 作为标准管，在 721 分光光度计上，波长 508nm,蒸馏水调零,平行 3 管测定,取 吸光度均值作为标准管 A 标,测定管 A 测除用待校正的微量加样器代替血红蛋白 吸管外,其他操作同前。 计算：实际容量（μl）=A 测/A 标×20 相对误差（%）=（实际容量-刻度容量）/刻度容量×100% 相对误差&1%可用于吸取关键性液体； 相对误差为 1%-3% 可用于吸取一般性溶 液；相对误差&3%则应调整弹簧，进行校准后才能使用。 6 小结 微量加样器已经在临床工作中广泛使用， 只有对它有全面的认识， 了解它的原理、 使用和维护，选择最佳的加样器,规范操作，定期校准，避免操作中的各种不利 因素影响，才能使加样准确，确保结果准确可靠，因此意义重大。BSA 二、 BSA，Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白， 三、 N,O-双三甲硅基乙酰胺[BSA] N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamide [BSA] 通用名称：BSA 性状： 无色至浅黄色液体，b.p ,74-76oC,fp42oC,d420 0.829,nd20 1.417。本 品易燃、腐蚀、有毒、易吸潮，宜低温保存。危险品类别：IMDG-Code:8/II UN292 0 规格： 外观 无色透明液体 硅烷活性量 ≥98%(Gc) 主含量 92-95% 沸程 74-76oC(35mmHg) 胺含量 ≤ 0.5% 作用：1 在酶切反应缓冲液中加入 BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护 作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因 素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。 2 ELISA 中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用 B SA。 另外在英汉词典中， BSA abbr. 1. =Bibliographical Society of America 美国书目编制学会 2. =Boy Scouts of America 美国童子军 3. =Boy Scouts Association 童子军协会 4. =Blind Service Association (美国)盲人服务协会 5.=Body surface area 体表面积生化术语。缓冲液：化学试剂。用于缓冲 PH 的变化，常用于生物工程实验，如 DNA、RNA 等物质的提取和提纯，酶的性质的测定，蛋白质的分离等等。缓冲：某 些试剂具有使溶液在加入酸或碱性物质的时候 PH 变化不明显的作用，这种作用叫做 缓冲琼脂目录[隐藏] 1）词语 营养分析 适宜人群 烹饪指导 备注[编辑本段]1）词语琼脂(agar)简介 琼脂,学名琼胶,英文名（agar）,又名洋菜(agar-agar),冻粉,燕菜精,洋粉,寒天.琼 脂在食品工业的应用中具有一种极其有用的独特性质. 琼脂是由海藻中提取的多糖体，是目前世界上用途最广泛的海藻胶之一。它在食 品工业、医药工业、日用化工、生物工程等许多方面有着广泛的应用，琼脂用于食品 中能明显改变食品的品质，提高食品的档次。价格很高。 其特点:具有凝固性,稳定性, 能与一些物质形成络合物等物理化学性质,可用作增稠剂,凝固剂,悬浮剂,乳化剂,保鲜 剂和稳定剂.广泛用于制造粒粒橙及各种饮料,果冻,冰淇淋,糕点,软糖,罐头,肉制品,八 宝粥,银耳燕窝,羹类食品,凉拌食品等等.琼脂在化学工业,医学科研,可作培养基,药膏 基及其他用途. 琼脂是以藻类的石花菜属(Gelidium)及江y属(Gracilaria)制成的明胶产品，为最 常用的微生物培养基的固化剂，也用於肉、鱼、禽类罐头和化妆品、药品及牙科医疗。 在酿造和葡萄酒工业中用作澄清剂，制作冰淇淋、糕点及沙拉调味料时用作增稠剂， 并作金属拉丝的润滑剂等。 用藻类制成的琼脂是半透明、无定形的粉末、薄片或颗粒。主要产地为日本、纽 西兰、美国和俄罗斯。琼脂不溶于冷水，能吸收相当本身体积 20 倍的水。易溶于沸 水，稀释液在 42℃(108 H)仍保持液状，但在 37℃凝成紧密的胶冻。琼脂为细胞壁 的组成成分，含有复杂的碳水化合物、钙与硫酸盐。 历史 在南洋的居民自古就以麒麟菜煮成冻胶食用（现在已知是卡拉胶） ，以马来语称 此凝冻为 agar-agar 或 agar,其后就成为琼胶的世界通用语。 琼脂亦称琼胶，在市场上也称为“冻粉” “凉粉”等。纪明侯，曾呈奎等（1952）年 、 建议 用“琼胶”代表 agar, 为纪念我国最早是以海南岛的麒麟菜水煮冻胶作食用； 并讲 所有海藻多糖 都统一以某胶作字尾，以代替“脂” “粉”等混乱用词。 、 “琼胶”这个名称已于 1977 年 为我 国药典所采用。 纪明侯 1993 年 1 月编著--《海藻化学》 （科学出版社） 中文名称： 琼脂 英文名称： Agar 中文别名： 琼胶;洋菜 CAS RN.：
分 子 式： (C12H18O9)n 物化性质： 水溶性 SOLUBLE IN HOT WATER 作 用：可用作增稠剂、凝固剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、保鲜剂、粘合剂和 生物培养基。 用 途： 琼脂在食品工业的应用中具有一种极其有用的独特性质。其特点：具有凝固性、 稳定性，能与一些物质形成络合物等物理化学性质，可用作增稠剂、凝固剂、悬浮剂、 乳化剂、保鲜剂和稳定剂。广泛用于制造粒粒橙及各种饮料、果冻、冰淇淋、糕点、 软糖、罐头、肉制品、八宝粥、银耳燕窝、羹类食品、凉拌食品等等。 琼脂在化学工业、医学科研、可作培养基、药膏基及其他用途。琼脂由琼脂糖（Agarose）和琼脂果（Agaropectin）两部分组成，作为胶凝剂的 琼脂糖是不含硫酸酯（盐）的非离子型多糖，是形成凝胶的组分，其大分子链链节在 1，3 苷键交替地相连的 β-D-吡喃半乳糖残基和 3, 6-α-L-吡喃半乳糖残基。而琼脂果 胶是非凝胶部分，是带有硫酸酯（盐） 、葡萄糖醛酸和丙酮酸醛的复杂多糖，也是商 业提取中力图去掉的部分。商品琼脂一般带有 2%D7%的硫酸酯（盐） ，0%D3%的 丙酮酸醛及 1%D3%的甲乙基。在工业上的琼脂色泽由白到微黄，具有胶质感，无气 味或有轻微的特征性气味，琼脂不溶于冷水，易溶于沸水，缓溶于热水。 琼脂系选用优质天然石花菜、 江蓠菜( Gracilaria)、 紫菜(porphyra)等海藻为原料， 采用科学方法精炼提纯的天然高分子多糖物质。含有多种元素，并具有清热解暑、开 胃健脾之功能。 琼脂早已被美国食品药物管理条例列为公认安全的产品，获准作为食品添加剂作 为专题载入食品化学品药典之中。 琼脂为亲水性胶体，分有条状和粉末状，不溶于冷水，易溶于热水。琼脂在工业 上具有独特的重要性，琼脂的浓度即使低至 1%仍能形成相当稳定的凝胶（冻胶） ，是 食品工业、化学工业、医学科研所必需之原料。 提炼琼脂的简单工艺流程如下： （1）琼脂条：江蓠菜(或紫菜)→浸碱→洗涤→漂白→煮胶→过滤→推条→冷冻→ 脱水→烘干→成品→包装。 （2）琼脂粉：江蓠菜(或紫菜)→浸碱→洗涤→漂白→煮胶→过滤→压水→烘干→ 粉碎→成品→包装。 琼脂质量标准符合国标 GB1975-80 规定：干燥失重 :≤15% 水不溶物% ：≤1 淀粉 ：合乎规定烧灼残渣%（灰分） ：≤5 吸 水 力 ：75 毫升（最高数）砷（AS）%：≤0.0001 重金属（以 Pb 计）%：≤0.004 [编辑本段]营养分析琼脂能在肠道中吸收水分，使肠内容物膨胀，增加大便量，刺激肠壁，引起便意。 所以经常便秘的人可以适当食用一些石花菜。琼脂富含矿物质和多种维生素，其中的 褐藻酸盐类物质有降压作用，淀粉类硫酸脂有降脂功能，对高血压、高血脂有一定的 防治作用。可清肺化痰，清热祛湿，滋阴降火，凉血止血。 [编辑本段]适宜人群一般人都可食用，尤其适合肥胖病人、高血压、高血脂人群食用。 [编辑本段]烹饪指导琼脂不宜与含有酸性的食品混合，会影响其效果。 琼脂不溶于糖溶液，食品配方中含有琼脂时应将糖加入热琼脂溶液中。一般热琼 脂溶液降温至 40℃以下即形成凝胶,在 85℃以下不会溶化成溶液。 食品应用： 一、 果粒橙饮料--以琼脂作悬浮剂， 其使用浓度 0.01-0.05%， 可使颗粒悬浮均匀。 琼脂用在饮料类产品中，其作用是悬浮力，让饮料中固型物悬浮均匀，不下沉。 其特点是悬浮时间及保质期长，也是其它悬浮剂无法代替之所在。透明度好，流 动性好，口感爽滑无异味。 二、果汁软糖--琼脂的使用量为 2.5%左右，与葡萄糖液、白砂糖等制得的软糖， 其透明度及口感远胜于其他软糖。 琼脂用在固体类食品中，其作用是凝固形成胶体，作为主原料而络合其它辅料， 如糖液、砂糖、香料等。 三、肉类罐头、肉制品--用 0.2-0.5%的琼脂能形成为有效粘合碎肉的凝胶。 四、八宝粥、银耳燕窝、羹类食品--用 0.3-0.5%琼脂作为增稠剂、稳定剂。 五、凉拌食品--先将琼脂洗净，用开水冲泡让其膨胀，捞起加入调配料即可食用。 六、冻胶布丁--以 0.1-0.3%的琼脂和精炼的半乳甘露聚糖，可制得透明的强弹性 凝胶。 七、果冻--以琼脂作悬浮剂，参考用量为 0.15－0.3%，可使颗粒悬浮均匀，不沈淀，不分层。 其它工业：一、啤酒澄清剂--以琼脂作为辅助澄清剂加速和改善澄清。 储存方法： 琼脂应放在干燥的地方，温度保持在 18-25℃之间可以增长琼脂的库存寿命， 如长时间储存温度过度，就会导致凝胶强度的降低。琼脂不宜与有气味性强的东西存 放在一起。 注意事项：防潮，置于干燥通风处保存。琼脂食用之－－－甜点 DIY 杨梅豆腐原料： 琼脂、杨梅汁、冰糖 做法： 1.将琼脂在清水中浸泡。2 小时后将半锅水煮沸，放入琼脂煮至完全溶解。 2.将冰糖放入杨梅汁中用小火炖，直到冰糖溶于杨梅汁中。 3.将冰糖杨梅汁与琼脂混合，用慢火煲滚，并不停搅拌均匀。 4.将煮好的汁液迅速倒入容器，冷却后放入冰箱冰镇。 功效： 杨梅含有多种有机酸，维生素 C 的含量也十分丰富，不仅可直接参与体内糖的代 谢和氧化还 原过程，增强毛细血管的通透性，而且还有降血脂，阻止癌细胞在体内生成的功 效。杨梅所含的果酸既能开胃生津，消 食解暑，又能阻止体内的糖向脂肪转化的功能，有助于减肥。水果果冻原料：木瓜、葡萄、桃子（或其它水果） 、干玫瑰花骨朵、冰糖、蜂蜜、 做法： 1.用热水将玫瑰花骨朵浸泡，不用太多水 2.将水果切丁 3.将琼脂放在温水里泡 5 分钟，然后拎干放进开水锅里煮至琼脂完全融化后将杂 质拎出（用一个小筛子或网子） 4.再将拎过杂质的琼脂浆里放入玫瑰花水、蜂蜜、冰糖继续在火上熬一会，为的是将蜂蜜和冰糖溶化 5.将水果丁放入制作布丁的容器中（注：如果是家中用的碗一列的类的容器，要 将碗底铺上保鲜膜，以便容易扣出） 6.将琼脂液倒进乘有水果的容器中 7.晾凉 8.晾凉后放进冰箱（热着放进冰箱，对冰箱不好） 9.好了~~~ 豆沙凉糕 材料： 500ml 水 一碟红豆沙（喜欢吃甜食的朋友可以依自己口味酌情加量。 ） 琼脂 15 克（不要太多，否则口感不好。 ） 蜜枣十来个切成小块装碗备用。 （或者加个人喜欢的小果脯，比如葡萄干什么之 类。 ） 做法： 1、水倒入锅内，烧开。 2、水开，倒入红豆沙，搅拌，化开。 3、倒入琼脂，化开。 4、停火，倒入蜜枣，拌匀。 （如果有其他水果放进去，味道就更丰富了。 ） 5、稍稍凉凉，把汤汁装进纸杯，放入冰箱 20 分钟。 6、欲食时，取出纸杯，倒扣在盘子上，切成小块食用。 [编辑本段]备注用石花菜提取物制成的琼脂，是一种重要的植物胶，无色，无固定形状，但属于 固体，可溶于热水中。琼脂可用来制作冷食品和微生物的培养基等。琼脂通常被称为 洋菜或洋粉，也叫石花胶，但它不同于另一种同样生长在沿海附近岩石和碎珊瑚上的 藻类食物琼枝。后者又称为海菜或胶麒麟菜，也含有琼胶、多糖和黏液质，常被煮成 胶冻状食用，或用开水烫泡后加适量姜、醋拌食，也可入配方水煎服，主治支气管炎、 肺炎、痰结、肠炎等，有降脂作用。琼脂糖琼脂（Agar），又名琼胶、菜燕、冻粉，是一类从石花菜及其它红藻类（Rhodo phyceae）植物提取出来的藻胶（phycocottoid），在我国及日本已有三百多年（16 58 年）的历史。琼脂糖 Agarose，缩写为 AG，是琼脂中不带电荷的中性组成成份， 也译为琼胶素或琼胶糖。琼胶糖化学结构由 β-D-吡喃半乳糖(1-4)连接 3,6-脱 水 α-L-吡喃半乳糖基单位构成. 用途:琼脂、琼脂糖因为有特殊的胶凝性质，尤其有显著的稳固性、滞度和滞后 性，并且易吸收水分，有特殊的稳定效应；已经广泛使用于食用、医药、化工、纺织、 国防等领域，据不完全统计，琼脂、琼脂糖的用途已有 1000 多种，被国际上称为“新 奇的东亚产品”。在食品工业中可用于生产：水晶软糖、定型软糖、水产品、肉类罐 头、果汁饮料、果肉饮料、米酒饮料、乳品饮料、精品、乳品蛋糕。 近年来由于其良好的生物相容性又广泛用于生物分离介质的生产 .琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 agarose gel 外文名称:Sepharose 4B 中文名称:琼脂糖凝胶 4B 颗粒大小:45-165um 储藏温度:常温 商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国 B io-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构 的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用 （如水，pH4-9 范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在 40℃以上开始融化，也不能高压 消毒，可用化学灭菌活处理。 琼脂糖 Agarose，缩写为 AG，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，也译为琼胶 素或琼胶糖。琼胶糖化学结构由 β-D-吡喃半乳糖(1-4)连接 3,6-脱水 α-L-吡喃半乳糖 基单位构成. 把琼脂糖，即几乎不含硫酸根的主要成分为多糖的琼脂，溶于热水，冷却制成的 凝胶。制成的小颗粒用于凝胶过滤。适于用 sephadex 不能分级分离的大分子的凝胶过滤，若使用 5％以下浓度的凝胶，也能够分级分离细胞颗粒、病毒等。利用其吸附 性小的特点，有时用它代替琼脂、以作为免疫电泳或凝胶内沉降反应的支持物。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大 的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖凝胶约可区分相差 100bp 的 DNA 片段， 其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低， 但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段 DNA。普通琼脂糖凝胶分离 DNA 的范围为 0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达 10^7bp 的 DNA 片段。EB（Ethidium bromide，溴化乙锭）溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的 DNA。溴化乙锭用标准 302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用 Polar oid 底片或带 CCD 成像头的凝胶成像处理系统拍摄。 观察琼脂糖凝胶中 DNA 最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化 乙锭含有一个可以嵌入 DNA 堆积碱基之间的一个三环平面基团。 它与 DNA 的结合几 乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每 2.5 个碱基插入一个溴 化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上 下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与 DNA 结合的 染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA 吸收 254nm 处的紫外 辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收 302nm 和 366nm 的光辐射。这两种情 况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的 590nm 处重新发射出来。由于溴化乙锭-D NA 复合物的荧光产率比没有结合 DNA 的染料高出 20-30 倍， 所以当凝胶中含有游离 的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至 10ng 的 NDA 条带。 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA 或 RNA） 。但是染料对单链核酸的 亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链 DNA 或 RNA 染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。 尽管在该染料存在的情况下，线状 DNA 的电泳迁移率约降低 15%，因此，当需 要知道 DNA 片段的准确大小（如 DNA 限制酶酶切图谱的鉴定） ，凝胶应该在无 EB 情况下电泳，电泳结束后用 EB 染色。染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小 量 DNA（小于 10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶进行脱色。[编辑本段]溴化乙锭的损害溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！ SYBR Green I 和溴化乙啶（EB）Ames 测试结果显示 EB 容易引起有机体突 变。(Singer et al., Mutat. Res. 199, 439: 37- 47.) [编辑本段]溴化乙锭溶液的净化处理由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含 EB 的溶液进行净化处理再 行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。 (1) 对于 EB 含量大于 0.5mg/ml 的溶液，可如下处理： ①将 EB 溶液用水稀释至浓度低于 0.5mg/ml； ②加入一倍体积的 0.5mol/L KMnO4， 混匀， 再加入等量的 2.5mol/L HCl， 混匀， 置室温数小时； ③加入一倍体积的 2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 (2) EB 含量小于 0.5mg/ml 的溶液可如下处理： ① 按 1mg/ml 的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置 1 小时； ② 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。凝胶电泳凝胶电泳（英语：Gel electrophoresis）或称胶体电泳 是一大类技术，被科学 工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。凝胶电泳通常用 于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法（如质谱 (MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA 测序或者免疫印迹）检测之前部分提纯分子。 该技术操 作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的 DNA 片段。 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少 可以检出 1-10ng 的 DNA 条带,从而可以确定 DNA 片段在凝胶中的位置。此外,还可 以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA 条带,用于以后的克隆技术操作。 凝胶电泳被广泛用于分子生物学、遗传学和生物化学： 1.大的 DNA 或者 RNA 分子通常利用琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electropho resis）分离，也可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 2.蛋白质的凝胶电泳通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行（ SDS -PAGE），或者非变性凝胶电泳，或二维电泳。 3.毛细管电泳 4.酶谱法（zymography） 5.变性梯度胶凝电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE） 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离 DNA 片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 片段。 琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段 DN A(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差 1bp 的 DNA 片段就能分开。聚丙烯酰 胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的 DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰 胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置 进行 DNA 电泳。 琼脂糖主要在 DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓 度。在电场中,在中性 pH 值下带负电荷的 DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因 素决定: 1、 DNA 的分子大小: 线状双链 DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA 分子量对数成反 比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 2、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状 DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相 同。DNA 电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于 DNA 分 子的大小。分离小于 0.5kb 的 DNA 片段所需胶浓度是 1.2-1.5%,分离大于 10kb 的 D NA 分子所需胶浓度为 0.3-0.7%, DNA 片段大小间于两者之间则所需胶浓度为 0.8-1. 0%。 3、 DNA 分子的构象 DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身 构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一 样的,超螺旋 DNA 移动最快,而开环双链 DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发 现凝胶上有数条 DNA 带难以确定是质粒 DNA 不同构象引起还是因为含有其他 DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将 DNA 带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后 电泳,如在凝胶上出现相同的 DNA 图谱,则为同一种 DNA。 4、 电源电压 在低电压时,线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的 增加， 不同分子量的 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引 起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要 使大于 2kb 的 DNA 片段姆直媛蚀锏阶畲?所加电压不得超过 5V/cm。 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之 间并拉长线状和带缺口的环状 DNA，使其刚性更强,还会使线状 DNA 迁移率降低 1 5％。 6、 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时(如 误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA 几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误 加 10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或 DNA 变性。 对于天然的双链 DNA,常用的几种电泳缓冲液有 TAE[含 EDTA (pH8.0)和 Tris乙酸],TBE(Tris-硼酸和 EDTA),TPE(Tris-磷酸和 EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室 温。DNA 酶切及凝胶电泳概 述 一. DNA 的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或 其附近的特异位点上,并切割双链 DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分 子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于 ATP 的存在。 Ⅰ类酶结合于识别位点并随 机的切割识别位点不远处的 DNA， 而Ⅲ类酶在识别位点上切割 DNA 分子,然后从底物 上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核 苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。 Ⅱ类中的限制性内切酶在 分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长 度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割,产生平末端的 DNA 片段(如 SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割 位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端, 如 EcoRⅠ切割 识别序列后产生两个互补的粘性末端。5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活 性。大部分限制性内切酶不受 RNA 或单链 DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性 内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新 的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若 两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度 ,则低盐浓度的限制性内切 酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个 酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加 0.1 倍体积 3mol/L NaAc 和 2 倍体积无 水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱 30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二 个酶切反应。 DNA 限制性内切酶酶切图谱又称 DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种 限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在 DNA 序列分析、基因组的 功能图谱绘制、DNA 的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图 谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是 建立在它的基础上。 构建 DNA 限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通 过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定 各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程 度。 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般 DNA 用量约为 0. 5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和 最适反应温度(大多数为 37℃)。对质粒 DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按 标准体系 1μg DNA 加 1 单位酶,消化 1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量 , 一般增加 2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 二. 凝胶电泳 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化 DNA 片段的标准方法。该技术 操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的 DNA 片段。 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少 可以检出 1-10ng 的 DNA 条带,从而可以确定 DNA 片段在凝胶中的位置。此外,还可 以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA 条带,用于以后的克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离 DNA 片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 片段。 琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段 DN A(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差 1bp 的 DNA 片段就能分开。聚丙烯酰 胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的 DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰 胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置 进行 DNA 电泳。琼脂糖主要在 DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓 度。在电场中,在中性 pH 值下带负电荷的 DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因 素决定: 1、 DNA 的分子大小: 线状双链 DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA 分子量对数成反 比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 2、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状 DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相 同。DNA 电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于 DNA 分 子的大小。分离小于 0.5kb 的 DNA 片段所需胶浓度是 1.2-1.5%,分离大于 10kb 的 D NA 分子所需胶浓度为 0.3-0.7%, DNA 片段大小间于两者之间则所需胶浓度为 0.8-1. 0%。 3、 DNA 分子的构象 当 DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本 身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不 一样的,超螺旋 DNA 移动最快,而线状双链 DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时 发现凝胶上有数条 DNA 带难以确定是质粒 DNA 不同构象引起还是因为含有其他 DN A 引起时,可从琼脂糖凝胶上将 DNA 带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然 后电泳,如在凝胶上出现相同的 DNA 图谱,则为同一种 DNA。 4、 电源电压 在低电压时,线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的 增加， 不同分子量的 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引 起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要 使大于 2kb 的 DNA 片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过 5v/cm。 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之 间并拉长线状和带缺口的环状 DNA，使其刚性更强,还会使线状 DNA 迁移率降低 1 5％。 6、 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时(如 误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA 几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误 加 10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或 DNA 变性。 对于天然的双链 DNA,常用的几种电泳缓冲液有 TAE[含 EDTA (pH8.0)和 Tris乙酸],TBE(Tris-硼酸和 EDTA),TPE(Tris-磷酸和 EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室 温。 材料、设备及试剂 一、 材料λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组 pBS 质料或 pUC19 质粒; EcoRI 酶及其酶切 缓冲液: 购买成品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或 国产的电泳用琼脂糖均可。 二、 设备 水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或 电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。 三、 试剂 1、 5×TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭(EB)溶液母液:将 EB 配制成 10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于 室温即可。 操作步骤 一、 DNA 酶切反应 1、 将清洁干燥并经灭菌的 eppendorf 管(最好 0.5ml)编号,用微量移液枪分别加 入 DNA 1μg 和相应的限制性内切酶反应 10×缓冲液 2μl,再加入重蒸水使总体积为 19 μl,将管内溶液混匀后加入 1μl 酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩 一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键 ,要防止错加，漏加。使用 限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、 混匀反应体系后,将 eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板 上）,37℃水浴保温 2-3 小时,使酶切反应完全。 3、 每管加入 2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备 用。 二、DNA 分子量标准的制备 采用 EcoRⅠ或 HindⅢ酶解所得的 λDNA 片段来作为电泳时的分子量标准。λDN A 为长度约 50kb 的双链 DNA 分子,其商品溶液浓度为 0.5mg/ml,酶解反应操作如上 述。HindIII 切割 DNA 后得到 8 个片段,长度分别为 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56 和 0.12kb。EcoRI 切割 lDNA 后得到 6 个片段,长度 分别为 21.2, 7.4, 5.8, 5. 6, 4.9 和 2.5kb。 三、 琼脂糖凝胶的制备 1、 取 5×TBE 缓冲液 20ml 加水至 200ml,配制成 0.5×TBE 稀释缓冲液,待用。 2、 胶液的制备：称取 0.4g 琼脂糖,置于 200ml 锥形瓶中,加入 50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为 0.8％琼 脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时 应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约 1cm)紧密封住。将封 好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持 1 mm 左右的间隙。向冷却至 50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为 0.5μg / ml(也可不把 EB 加入凝胶中,而是电泳后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色)。 用移液 器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小 心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低 ,否则凝固不均匀,速 度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子 ,注意不要损伤梳底部的 凝胶,然后向槽内加入 0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应 样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满 缓冲液。 4、 加样： 10μl 酶解液与 2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。 取 若 DNA 含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。 每加完 一个样品要更换 tip 头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样 品槽底部凝胶刺穿。 5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在 60-80V,电 流在 40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约 2cm 时,停止电泳。 6、 染色：未加 EB 的胶板在电泳完毕后移入 0.5μg/ml 的 EB 溶液中,室温下染 色 20-25 分钟。 7、 观察和拍照：在波长为 254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有 E B 的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴 上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光 片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈 5.6,曝光时间 10-120 秒(根据荧光 条带的深浅选择)。 8、 DNA 分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺 测量 λDNA 的 EcoRⅠ和 HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的 常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为 该电泳条件下 DNA 分子量的标准曲线。 9、 DNA 酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出 DNA 样品各 片段的迁移距离,根据此数值,在 DNA 分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计 算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接 查出 DNA 片段的大小)。反之,若已知 DNA 片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计 的迁移距离。 10、 DNA 酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结 果,对照 DNA 酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和 各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该 DNA 分子的限制性内切酶图 谱。 [注意] 1.酶切时所加的 DNA 溶液体积不能太大， 否则 DNA 溶液中其他成分会干 扰酶反应。 2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1 小 时完全降解 1mg lDNA 的酶量为一个单位，但是许多实验制备的 DNA 不象 lDNA 那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成 本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（ 1 ×）进行稀释。另外，酶通常保存在 50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度 控制在 1/10 之下，否则，酶活性将受影响。 4、 观察 DNA 离不开紫外透射仪,可是紫外光对 DNA 分子有切割作用。从胶上 回收 DNA 时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光 切割 DNA。 5、 EB 是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把 EB 洒到 桌面或地面上。凡是沾污了 EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 6、 当 EB 太多,胶染色过深,DNA 带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30 分钟后 再观察。溴酚蓝溴酚蓝 【中文全程】3′，5，5′-四溴苯酚磺酰酞 【别名】 四溴苯酚磺酞 【英文名称】BAlbutest 【分子式】C19H10Br4O5S 【相对分子量或原子量】670.02 【性状】 从乙酸及丙酮混合液中析出者为长六角形棱柱状结晶。近似黄色或浅 玫瑰色结晶性粉末，微溶于水及乙醚，溶于乙醇或稀碱液及氨液中呈蓝色。PH 变色 范围 3.0(黄)~4.6(蓝紫) 【溶解情况】 微溶于水，易溶于甲醇、乙醇和苯，可自由溶于氢氧化钠溶液， 同时形成溴酚蓝钠盐水溶液。 【用途】 pH 指示剂，pH=3.0 时呈黄色，pH=4.6 时呈蓝紫色。酸碱指示剂；非 水滴定用指示剂，蛋白电泳染色；病毒化验等。 【制备或来源】 将苯酚磺酰酞悬浮于醋酸中，然后徐徐加入溴，并使溴过量， 在搅拌下，于 50℃进行反应而得。 【其他】 溴酚蓝分解温度 279℃，在 210℃绿色升华物退色为橙色。【配置方法】 方法 1：1%的溴酚蓝 将托盘天平上称取 1g 溴酚蓝定溶于 100ml 无水乙醇中，转移入滴瓶中，贴标签 备用。 方法 2：0.05%的溴酚蓝 配 western blot 用的 2*SDS 上样缓冲液需要用到 0.1%的溴酚蓝，2-DE 中溴酚 蓝一般也是配成 0.1%母液。实际上，溴酚蓝在水中的溶解度不高，直接将 0.1g 溴酚 蓝溶于 100ml 水是有困难的。下面是其较合适的配制方法： 0.05%的溴酚蓝配制方法：取溴酚蓝 0.1g，加 0.05mol/L 氢氧化钠溶液 3.0ml 使 溶解，再加水稀释至 200ml，即得。 变色范围 pH2.8～4.6（黄→蓝绿）。只是不知 道加入 NaOH 会不会影响 2-DE 实验。估计影响不大，因为指示剂用量毕竟很少。 方法 3：1％溴酚蓝 加 1g 水溶性钠型溴酚蓝于 100ml 水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。溴酚蓝 其钠盐易溶解在水里。
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