我的世界minecraft里面如何切换窗口之后不弹出游戏菜单？在线等！_百度知道
我的世界minecraft里面如何切换窗口之后不弹出游戏菜单？在线等！
应该删除哪个文件还是怎样？新手就这点悬赏了，在线等！
会了会了！感谢楼下这位F3+P的童鞋，原来要按两下F3+P才会显示出来效果，第一下被F3的效果给冲突了！大谢啊~~~
我有更好的答案
就可以去（吃多了）看看为毛线崩溃）F3 + D : 清除聊天记录 (包括以前输入过的消息和指令)（渣机专用）F3 + H 你是要挂机？然后又想这边挂机，这个我也不是太懂这东西，工具的耐久度， 盔甲 颜色 以及 地图 等级（常用，对吧。这样的话你只需要按住f3加p就行了~（为了以防记错我还去wiki上看了下）干脆点，不太常用）F3 + C : 崩溃测试[译者注：长按后游戏会弹出: 显示物品方块ID，弹出崩溃报告] (按住组合键10秒)[3]（这个就是玩着玩着崩了的时候，玩那边，解释的话就不用了吧）F3 + P : 重新加载 区块（就是地图刷错的时候可以试试，不然就是刷怪塔里的怪多得挤出来的时候用，不过会有点卡（看你的电脑性能））F3 + B : 切换 实体碰撞箱的能见度,在1，应该是弄红石所用，不然就是拿来看方块的高度.8中会会用蓝线标示实体所面对的的方向（物体碰撞箱嘛，直接给你一些mc里大部分人都不知道的顺便帮你科普下~F3 + A ，问题是一点另外一边就这边弹出菜单，导致不能挂机
非常抱歉来晚了。。。看你的答案真的好细致~可问题是0.0.。。我特意试了3个不同的客户端，结果。。。f3+p似乎没反应QAQ，只是出现F3的显示信息的效果~好吧应该是我没说清楚，就是怎样才能把MC隐藏到后台然后让后台脚本挂机有效...因为普通隐藏之后会弹出游戏菜单嘛，鼠标模拟点击之类的就没办法使用啦
弹出游戏菜单是指回到主菜单还是暂停
暂停，可是不想让它暂停，该怎么做？
有办法。这是Minecraft自带的，摁E键、打开工具箱、熔炉等会弹出页面的地方是不会停的，不过万一你开困难站在外面，不给你暂停，僵尸、末影人把你打死怎么办？有一次我开在那里，结果被僵尸打死了。。。
关键是游戏菜单出来之后后台脚本鼠标没办法点击了。。。
不给450经验还悬赏
不“狗就好”
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我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。怎么才能切换到pe模式啊_百度知道
怎么才能切换到pe模式啊
怎么才能切换到pe模式啊电脑是戴尔的笔记本，系统是win10
我有更好的答案
选boot哪项，然后找到#0或是#1，把U盘放到第一位，按F10选是保存退出
是哪一个啊
你是Dell笔记本，你开机按F12，选U盘启动
问题是没有
进入到BIOS高级设置界面，使用键盘方向键，将屏幕光标移动到Advanced选项卡上，按下回车键，接着，再将光标移动到SATA Mode选项上，并按下回车选择ATA模式为硬盘模式。.电脑硬盘成功设置为ATA模式后，按下键盘上F10选择Y，按回车电脑将自动保存设置并退出BIOS。然后你开机按F12就行了，选USB的启动
电脑维修技术员
得用系统光盘或者装机U盘。
电脑没有光驱，U盘已经插好了
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中国式PE的几种模式
传递正能量&分享人生智慧中国最大商业智慧分享平台欢迎订阅微信号：JR-51888点击右上角按钮& ··· &，即可“分享到朋友圈”&&PE是股权投资的英文简称，其全称应是Pre-IPO。投资者的目的是通过投资目标公司，获得目标公司一定比例股权，然后通过目标公司上市（IPO）退出获益。由于中国资本市场还不成熟，一些PE者获取了高额的回报，一时间“全民PE”。但是随着大潮逝去，更多的PE深陷泥潭无法退出。美国的PE一旦传到中国，就迅速具有了中国特色，这就是中国式PE。那么实践中，中国式PE又具有哪些模式呢？本文重点介绍实践中发生的中国式PE投资模式及其法律结构。&&&&&&一、境外上市退出的PE模式及法律结构&&&&&1. Citi&模式&&&&2002年底，花旗银行与上海浦东发展银行（下称“浦发银行”）达成结为“具有排他性的战略合作伙伴关系”的协议。由于监管政策的限制，花旗银行对浦发银行的股权投资采取分阶段入股的方式，即协议签订后入股5%；在2008前，在政策允许的情况下，花旗银行可增持至14.9%，最终不超过24.9%。根据该协议，在分阶段入股投资的基础上，花旗银行将通过实质性参与实际控制浦发银行的信用卡业务。&&&经过上述安排，浦发银行信用卡中心名义上设在浦发银行下，实则为按公司化运作的半独立运营中心。一旦政策允许，信用卡中心将独立出来，成立合资公司。而在此之前，双方承担对等的风险、权利和义务。根据协议，花旗银行提供技术和管理，而所有工作人员的工资则计入浦发银行的成本。信用卡中心的首席执行官和四个部门的正职均来自花旗银行，副职则全由浦发银行的人担任，首席执行官向一个由花旗银行和浦发银行各三人组成的“信用卡中心管理委员会”汇报。另外，花旗银行还输出了一支比较有经验的团队，并提供了集团内最新版本的业务系统，所有的数据处理均集中到花旗银行在新加坡的亚太数据处理中心进行。而就与浦发银行在其他业务方面的合作，花旗银行并未投入太大力量，只是提供一些技术援助。&&&花旗银行对浦发银行的这一投资模式，立足于对被投资企业的某项而非全部业务的深度介入和控制，在时机成熟时便可以延展到其他业务层面。通过这种模式，投资者能以最快、最有效的方式直接进入某项具体业务的市场。PE投资者的先进管理理念和经验与被投资企业的本土优势相结合，能够较容易地在竞争中取得优势地位。此外，尽管投资时存在政策限制，但一旦政策形势发生变化，根据协议安排，合作业务的组织结构和企业性质可以第一时间进行切换，并迅速开展业务，而无需经过过渡期。&&&&但是，由于这种模式往往只是将合作与控制限定在一些刚刚起步的新领域，这虽然使得PE投资者能够较顺利地取得该项业务的控制地位，但如何将对被投资公司的控制从一项具体业务渗透到被投资公司整体，则存在一定难度。&&&&&&&&2.红筹模式（大小红筹）&&&&&&&&红筹模式，是指在海外设立公司，由该公司对国内企业进行控股，以该海外控股公司直接申请上市的IPO上市模式。“红筹”可以划分为“大红筹”（国企红筹）和“小红筹”（民企红筹）。&&&“小红筹”的操作模式是，境内居民设立离岸公司，然后通过并购将境内公司的资产或股权转移到离岸公司名下，境内公司变成外商独资企业或中外合资企业。红筹模式的优势在于，除国内公司的生产经营活动须遵守中国大陆法律外，离岸公司的上市程序只须遵守上市地及离岸公司注册地的法律，而不受中国大陆法律的限制。&&&而在上市之前，以上市为目标，以红筹模式的形式实施的私募股权投资，是很常见的PE投资架构。具体如下图所示：&&&&&&&&3.新浪模式（VIE结构）&&&“新浪模式”，是指新浪公司在2000年上市前，为了满足国内监管和公司海外上市的双重要求而设计的一套复杂的交易架构体系。依据中国《电信条例》及外商投资产业指导目录等法律规范，外资是禁止介入电信运营和电信增值服务的，而网络信息服务属于电信增值业务。也就是说，根据有关法规，要继续经营互联网业务，就不能在海外上市。另一方面，当时信息产业部的政策性指导意见是外商不能提供网络信息服务&(ICP)，但是可以提供技术服务。于是在中国的特定政策下，“新浪模式”最终得以问世。&&在“新浪模式”下，外国资本通过投资离岸控股公司（即特殊目的公司）来控制设在中国境内的外商独资企业（WFOE），该外商独资企业&&&不能直接经营增值电信业务，但可以为实际经营增值电信业务的内资公司提供技术服务，外商独资企业与内资公司之间，将通过独家服务合作协议等一系列合同安排紧密地捆绑在一起。由于境外会计师认可这种合同绑定方式，特殊目的公司与内资公司之间虽然不具有股权关系，但报表却能被合并到特殊目的公司，这样，境外特殊目的公司就可以实现在海外上市。&&&新浪模式实际上是红筹模式的一种创新。其超越是，特殊目的公司（SPV）并没有收购内资公司资产，而是通过一系列紧密的合同安排，绑定和控制内资公司。&&这种合同控制一般由多个合同组成：（1）独家技术服务合同—通过合同安排，把实际运营业务的内资公司的主要利润，以服务费的名义转给外商独资企业；（2）运营协议—把一些日常管理方面的重大业务经营管理权也转给外商独资企业；（3）股东表决权委托协议—内资公司的股东的表决权被委托给外商独资企业指定的人行使；（4）股权质押合同—内资公司的股东把他在内资公司的股权质押给外商独资企业，用来担保内资公司和外商独资企业之间签定的利润转移协议；（5）股权购买权协议—内资公司的股东同意在任何时候，根据外商独资企业的要求，将其持有的内资公司的股权无偿转让与外商独资企业指定的人。此外，还有一些会签订借款协议，外资独资企业借款给内资公司，使得利润转移更加真实。&&&以上这一系列合同安排被习惯性地称作“新浪协议”。通过新浪协议，外商独资企业实际上既控制内资企业的经营，也控制其股东权利，又分得利润，外商独资企业成为了内资企业真正的控制人。&&&但是，新浪模式的潜在风险是，当内资公司的股东和外资公司的股东发生矛盾时，双方的利益关系就会出现问题，而合同安排显然不如股权控制更为直接和有力。此外，政策上的变化，也让这种模式饱受潜在风险，尤其是新浪模式至今未得到包括商务部、信息产业部在内的主管部门的明确认可，有法律专家认为这种做法有规避中国法项下关于外资禁止经营增值电信业务的强制性规范的意图，因此一旦出现纠纷，有关协议的效力司法裁判机关会如何裁判，存在相当大的法律风险。&&&需要特别提出的是，2006年8月中旬，信息产业部电信管理局负责人表示，中国增值电信业务市场已对外资企业逐步开放。符合条件的外资企业在按照《外商投资电信企业管理规定》取得信息产业部《外商投资经营电信业务审定意见书》和商务部《外商投资企业批准证书》后，可依法申请增值电信业务经营许可证。[viii]之后多家外商投资企业在按照规定程序向信息产业部提出申请后，已经在规定时限内依法获得了信息产业部颁发的相关增值电信业务经营许可证。由于这方面的变化，我们认为新浪模式会逐渐退出历史舞台。&&&另外VIE结构也存在非常多的其他法律风险。比如在境内可变实体公司进入审批的业务或新型领域需要审批时，可能会被明确做出限制（VIE被视为变相规避中国法律）。由于VIE属于协议控制，其控制力及效力显然低于股权的实际控制，在目标公司原股东随意解除VIE结构的情况下，投资人将不的不面临艰难的维权诉讼。&&&&&&二、境内上市的PE投资模式及法律结构&&&&& 1.&&直接股权投资模式&&&&若目标公司采取在境内上市，则PE采用的最常用投资模式是直接的股权投资模式。有的PE仅仅投资，而有的PE还会采用股+债模式。&&&&& 2.深国投的PE信托投资模式&&&&深国投模式实际上是一种PE信托，即以通过信托募集的资金进行PE投资。在深国投模式中，信托公司负责信托资金募集，其中创投机构以部分资金参与信托计划，实现两者利益一致化。信托公司还负责信托财产的管理运用。在这当中，创投机构主要扮演投资顾问的角色——负责投资项目初期筛选、中后期管理和变现退出等智力支持。在此过程中，信托公司都拥有最终的否决权。创投机构的收入主要由两部分组成：一是每年收取的管理费；二是绩效费，即投资项目获得盈利时所获得的提成。&&&2007年1月，中国银行业监督管理委员会出台了《信托公司集合资金信托计划管理办法》，股权投资信托成为政策明确允许的信托公司集合资金信托计划的运用方式。此后，大批资金开始涌向PE信托。2007年7月，深圳国际投资有限公司与深港产学研创投公司、深圳松禾投资公司合作推出了“深国投·铸金资本1号股权投资集合资金信托计划”。在该模式下，深港产学研创投公司管理团队及松禾投资公司作为该PE信托的投资顾问，以人民币4000万元加入该信托计划，以保证利益的一致性。在投资过程中，投资顾问负责投资项目初期筛选、中后期管理和变现退出等智力支持，而深国投在全部环节中都拥有最终的否决权，发挥监管作用。&&&&日，中国银监会下发《信托公司私人股权投资信托业务操作指引》，对PE信托进行了规范，表明了银监会对信托公司开展这一业务的支持态度。然而，由于信息披露等监管问题，PE信托投资企业上市可能存在一定法律障碍。一方面，信托型PE和所投资的企业是代为持股关系，信托财产委托人、受益人的股东身份比较难以得到直接的确认。另一方面，《信托法》规定，信托公司对委托人、受益人以及信托事务的情况和资料负有法定的保密义务。而这显然不能满足有关上市规范中关于上市企业必须披露企业实际股权持有人的要求。让我们一起分享商业智慧（朋友圈）微金融 私人号：JR888CEO股权决定主权·资本决定命运微金融平台|订阅号：JR-51888&&更多分享微联盟平台|订阅号：ZLM-88851&更多分享
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华东师范大学 硕士学位论文 荞麦Na&'+&/H&'+&逆向转运蛋白基因FtNHX的克隆、功能验证及 表达分析 姓名：李翠 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：夏涛
华东师范大学硕士学位论文摘要摘要盐害是农作物生产与产量的重要限制因素。从分子水平上了解植物的抗盐机 理，克隆抗盐基因并转移到盐敏感的农作物中从而培育抗盐的转基因新品种，对 于有５亿多亩盐荒地的中国来说，具有十分重要的意义。 盐胁迫主要由Ｎａ＋离子引起。过高Ｎａ＋离子浓度引起的离子毒害、渗透胁迫 和Ｋ＋／Ｎａ＋比率的失调使得植物新陈代谢异常，从而对植物各个器官造成极大地 损伤。Ｎａ＋ＡＩ＋逆向转运蛋白依赖水解ＡＴＰ或ＰＰｉ产生跨质膜或液泡膜的Ｈ＋电化 学势梯度提供能量，催化Ｎａ＋和Ｈ＋离子的逆向跨膜运输，是植物抵御盐胁迫的一 种主要方式。对植物Ｎａ＊／Ｉ－Ｉ＋逆向转运蛋白基因的克隆、表达及结构功能分析有 利于进一步在分子水平上了解该基因的作用机制，进而促进植物耐盐转基因工程 的发展。本研究在国内外首次对于养麦（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ Ｇａｅｒｔｎ）Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋 白进行克隆、表达与功能研究。 本研究根据生物中已克隆的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的氨基酸序列，设计简并 引物，通过ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＡＣＥ方法首次从荞麦（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ Ｇａｅｒｔｎ）中克隆出了ＮａⅦ＋逆向转运蛋白基因ＦｔＮＨＸ。序列分析表明，该基因全长２０５２ｂｐ，包括１６６２ｂｐ的开放阅读框（ＯｐｅｎＴｒａｎｓｌａｔｅｄＲｅａｄｉｎｇＦｒａｍｅ，ＯＲＦ），２８７个碱基的５’非翻译Ｉ夏（ＮｏｎＲｅｇｉｏｎ，卜ｒｒＲ），７５个碱基的３’非翻译区ＮＴＲ和２８个碱基的多聚腺苷酸尾。将该基因命名为ＦｔＮＨＸ，ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号为ＧＵ９８４０４５。其中２８８．１９４９ｂｐ 为其完整编码区域，编码的蛋白含有５５３个氨基酸，推测分子量为６１ＫＤａ。 ＦｔＮＨＸ基因编码的氨基酸序列与已克隆的其他Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白具有较 高的同源性。生物信息学研究表明，ＦｔＮＨＸ具有所有Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白共同 的结构特点，即含有疏水的Ｎ末端，８个跨膜区和一个具有调节功能的Ｃ端亲水区，其中ＬＦＦＩＹＬＬＰＰＩ是高度保守的，这是ＮａⅦ＋逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯吡嗪嘧结合位点。同源序列比较及进化关系分析发现，ＦｔＮＨＸ与 ＩＣ．ＮＨＥ即液泡型的Ｉ型Ｎａ＋ＡＩ＋逆向转运蛋白如ＡｔＮＨＸｌ．４、ＺｍＮＨＸｌ的亲缘关 系较近，其氨基酸序列同源性均在５０％以上，该类蛋白定位于液泡膜上，其功能 是将Ｎａ＋区隔化到液泡中。ＦｔＮＨＸ与ＰＥ．ＮＨＥ质膜型的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白如 ＯｓＳＯＳ、ＰＥＳＯＳ亲缘关系较远，其氨基酸序列同源性不足１０％。由此我们可以 推断ＦｔＮＨＸ基因的编码产物是液泡型的Ｎａ＋ａ－ｉ＋逆向转运蛋白。５华东师范大学硕上学位论文摘要我们成功构建了酵母表达载体ｐＹＰＧＥｌ５．ＦｔＮＨＸ，采用乙酸锂法将 ｐＹＰＧＥｌ５－ＦＴＮＨＸ重组载体转入盐敏感型双突变酵母菌株（Ａｅｎａｌ．４Ａｎｈｘ）ｄＰ进 行该基因的功能验证。结果显示，转入该基因的酵母突变菌株分别可以在含有１００ｍＭ ＮａＣＩ、１．５Ｍ ＫＣＩ、２．５ｍＭ ＬｉＣＩ的ＡＰＧ培养基和含有ＨＹＧ（５０／比ｇ／ｍＬ）的ＹＰＤ培养基中恢复生长，能一定程度上恢复突变菌株的抗盐能力，抑制突变 菌株对于潮霉素敏感性，初步证实ＦｔＮＨＸ基因具有液泡型ＮＨＸｌ类似的功能。 将荞麦幼苗培养６周后，经１００ｍＭ ＮａＣＩ盐溶液处理３次，利用Ｒｅａｌ．Ｔｉｍｅ ＰＣＲ技术分析盐处理前后ＦｔＮＨＸ在ｍＲＮＡ水平上表达变化及组织特异性。实验 证实，养麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因ＦｔＮＨＸ和ＡｔＮＨＸｌ一样是组成型表达的， 在荞麦的各个器官均存在；盐处理后ＦｔＮＨＸ在根、茎、叶三个部位的表达均有 上调，分别为对照组的１．１５、１．３１和３．１６倍。不同器官增加的程度有所差别， 这也暗示盐胁迫后ＦｔＮＨＸ的表达存在较为显著的组织器官特异性。关键词：植物耐盐性；Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白；荞麦；基因克隆；酵母互补实验；Ｒｅａｌ．ＴｉｍｅＰＣＲ６华东师范人学硕上学位论文ＡｂｔｒａｃｔＡｂｓｔｒａｃｔＳａｌｔｉｎｊｕｒｙｉｓａｍａｊｏｒｌｉｍｉｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｔ ｉｓａｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｆｉｌｅｄ ｏｆ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｔｅ， ｃｌｏｎｉｎｇ ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ ｎｅｗ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｐｌａｎｔ．Ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｍａｉｎｌｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｎａ＋ｉｏｎｓ．Ｈｉｇｈ Ｎａ＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｏｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ，ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ，Ｋ＋／Ｎａ＋ｒａｔｉｏ ｉｍｂａｌａｎｃｅ，ａｂｎｏｒｍａｌ ｔｈｅｎｇｒｏｗｔｈａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｎａｎｄｃａｕｓｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄａｍａｇｅ ｔｏｐｌａｎｔｓ．Ｎａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ，ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｒｔｈｅ ｅｎｅｒｇｙｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＴＰＨ＋ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ，ｃａｔａｌｙｚｅｓａｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｆ Ｎａ＋ａｎｄ Ｈ＋ｉｏｎｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ Ｓｔｕｄｙｏｎｍａｊｏｒｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｎａ＋ＡＩ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ，ａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｇｅｎｅｓ ｗｉｌｌ ｂｅ ｖａｌｕａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｓａｌｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｌａｎｔｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｉｒｓｔｌｙ ｃｌｏｎｅｄａｔｏｌｅｒａｎｔｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｊｅｃｔ，ｗｅＮａ＋ＡＩ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ Ｇａｅｒｔｎ ａｎｄ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｔｓ ｆｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ．Ａ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｎａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ｏｆ Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ Ｇａｅｒｔｎ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ＲＡＣＥ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｅＤＮＡ ｉｓ ２０５２ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ １６６２ｂｐ ＯＲＦ（ＯｐｅｎＲｅａｄｉｎｇＦｒａｍｅ），２８７ｂｐ５’ＮＴＲ（ＮｏｎＴｒａｎｓｌａｔｅｄＲｅｇｉｏｎ），７５ｂｐ ３’ＮＴＲ ａｎｄ２８ ｂｐ ｐｏｌｙＡ ｔａｉｌ．Ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｉｓ ｎａｍｅｄＦｔＮＨＸ，ａｎｄ ｉｔｓａＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ｉｓ ｏｆ 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ＦｔＮＨＸｉｎ△ｅｎａｌ一４Ａｎｈｘ １００ｍＭ ＮａＣＩ，ｔｅｓｔｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎ ｃａｕｓｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｉｎ ＡＰＧ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ１．５Ｍ ＫＣＩ，２．５ｒａＭ ＬｉＣＩ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ＹＰＤ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ５０／【ｌｇ／ｍＬ ＨＹＧ Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＦｔＮＨＸ ｗｏｒｋｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ａｓＮ０嚼ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ａｎｄ ｐｌａｙｓ ａｌｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅｉｎＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＦｔＮＨＸ ｉｎｂｕｃｋｗｈｅａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｆｔｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＦｔＮＨＸ，ａｆｔｅｒ １００ ｍＭ ＮａＣＩ ｓｔｒｅｓｓ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ １．１５．ｆｏｌｄ ｉｎ ｒｏｏｔｓ，１．３１－ｆｏｌｄ ｉｎｓｔｅｍｓ ａｎｄ ３．１６一ｆｏｌｄ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ＦｔＮＨＸ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ． ｈａｄｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｅａｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＮａＣＩ ｒｅｓｐｏｎｓｅＫｅｙＷｏｒｄｓ：Ｓａｌｔ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；Ｎａ＋／ｎ＋Ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ；Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍＧａｅｒｔｎ；Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｅ；Ｙｅａｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｔｅｓｔ；Ｒｅａｌ―Ｔｉｍｅ ＰＣＲ８奎至硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名职称教授单位华东师范大学备注 主席 委员 委员 秘书吴自荣 赖玉平 黄静吴奇涵教授 副教授 讲师华东师范大学华东师范大学华东师范大学华东师范大学硕士学位论文第一章文献综述第一章文献综述目前，农业的发展遭遇到了前所未有的瓶颈。一方面在与城市争夺可耕种土 地的同时，还要负担起越来越多的人口。另一方面，生态气候的剧烈变化和不稳 定因素显著增加，日益威胁着农业的可持续发展。植物体是一个开放的体系，它 们暴露在大自然中频繁遭受各种逆境。据保守统计，由于不良环境而引起的减产 约为６７－８５％，严重时甚至颗粒无收。因而，对植物抗逆机理的研究正越来越成 为国内外科学家们关注的热点。 土壤盐渍化是一个世界性的问题，是影响生态环境和农业生产的首要非生物 胁迫因素。据不完全统计，全世界约有３８亿公顷土地具有不同程度的盐渍化，约占可耕地面积的１０％。中国的盐碱土总面积大约有５亿多亩，其中己开垦的约有１亿多亩，另外还有３亿多亩盐碱土地等待开发利用，这些占地面积巨大的盐 渍化土壤已经成为危及人类生存的重大资源与环境问题。近年来，由于不合理灌 溉、耕作等又造成了大量农田的次生盐渍化，导致我国次生盐碱地逐年增加，严 重威胁着我国的粮食生产与安全∞１。在可耕种土地严重缺乏、人口急剧增长的今 天，如何开发和利用盐碱地进行农业生产、如何进一步提高盐胁迫土地的农作物 产量成为一个日益紧迫而意义重大的研究课题。 利用传统的育种方法由于缺乏可靠的选择特性，工作量极大而收效甚微，进 展极其缓慢。但随着分子生物学与现代生物技术的飞速发展，人们对盐胁迫所造 成植物伤害及植物耐盐胁迫机理从整体、器官、细胞乃至分子等不同层次上有了 更加深入而全面的认识，这为进一步改良作物的耐盐性提供了坚实的理论基础 嗍。近年来，转基因技术层出不穷，工Ｆ被广泛应用于植物耐盐育种，而且已经获 得了多种耐盐水平显著提高的作物和模式植物，显示出利用现代分子技术进行耐 盐育种的光明前景Ｍ１。 以下就盐胁迫对植物的危害和植物Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白研究进展两方面进 行简要的论述。植物耐盐性研究进展１．１盐胁迫对植物的危害 一些干旱半干旱地区，由于其地表蒸发强烈，地下水上升，把水中所含的盐华东师范大学硕士学位论文第一章文献综述分残留到土壤表层；加上降水量小，不能把土壤表层的盐分淋溶排除，导致土壤 表面ＮａＣｌ、Ｎａ２Ｃ０３等盐分积累越来越多。海滨地带则由于海水倒灌，土壤表层 也会积累较多的ＮａＣｌ、ＭｇＳ０４等盐分，久而久之，形成了面积巨大的盐碱化土 壤。这些含盐量过多的土壤会对植物生长造成危害，成为盐害，也称盐胁迫（ｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ）‘１?副。土壤高盐渍化破坏了植物的渗透势，导致离子渗透胁迫、离子分配不均，进 而影响植物体内各种生理、生化变化，结果导致植物伤害，这种破坏发生在细胞 水平及整株植物水平。盐分对植物的伤害，主要表现在以下三个方面： （１）吸水困难，生长抑制 植物对盐害的反应是较为敏感的生理过程。土壤盐分过多能降低土壤溶液的 渗透势，植物吸水困难，种子会推迟发芽甚至不能萌发，正在生长的植物也会因 为不能吸水或吸水很少，形成生理干旱，进而造成生长抑制。这种抑制作用发生 在多种水平上，涉及细胞内的多个复杂的生理生化反应，包括蛋白合成、原叶绿 素合成、呼吸作用、光合作用以及渗透势改变。减少的膨压会导致气孔关闭，水 分和气体交换减少，影响蒸腾和光合速率，导致ＣＯ。的固定量骤减，光合产物严 重不足，生长速度减慢或停止。植物体内广泛存在一种受ＡＢＡ诱导的依赖细胞 周期蛋白的蛋白激酶抑制剂（ＩＣＫｌ），盐离子过多能降低依赖细胞周期蛋白的蛋 白激酶的活性，致使细胞循环受阻，进而抑制细胞伸长和分裂。另一方面，因为 植物细胞的分裂伸长均受到生长素、细胞分裂素和赤霉素等激素的调控，盐胁迫 降低了这些激素的合成效率，所以植物生长受到抑制。 （２）营养缺乏，生理紊乱 一些矿质元素是植物生长和发育所必需的，包括大量元素Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｋ、Ｃａ、Ｓ、Ｍｇ、Ｆｅ和微量元素Ｍｎ、Ｚｎ、Ｂ、Ｃｕ、Ｍｏ等。然而土壤中可溶性盐离子如Ｎａ＋、ＣＩ。、Ｍｇ＋、Ｓ０４２。等离子浓度过高，则会阻碍植物吸收营养元素 Ｋ＋、Ｎ０３‘、ＨＰ０４玉等，造成营养缺乏。例如，西葫芦经１００ｍＭ ＮａＣｌ处理后，由 于Ｎａ＋、Ｋ＋竞争相同吸收载体，植物下部缺乏Ｋ＋；盐分过多会降低大豆、小麦、 葡萄等作物的蛋白质合成速率，加速贮藏蛋白质的水解，进而导致植物体内氨积 累过多，造成氨中毒。有研究发现，在轻度盐土上生长的棉花其叶片的氨含量为 正常土壤的２倍，在重度盐碱土上生长的棉花其叶片的氨含量则高达正常土壤的 １０倍之多。另外，盐分过多可使小麦、大麦等作物的呼吸速率下降，细胞色素 氧化酶和抗坏血酸氧化酶等活性下降。盐分过多同时也能抑制光合速率，叶绿素２华东师范大学硕十学位论文第一章文献综述的生物合成受到干扰，饱受盐害的植物叶绿体趋于分解，叶绿体被严重破坏。总 之，盐分过多影响光合和呼吸，影响碳水化合物，蛋白质和核酸代谢，使植物体 正常的生理活动受到干扰。 （３）生物膜破坏，加速衰老 过量的无机盐离子的积累严重影响蛋白合成、蛋白结构、蛋白可溶性、膜的 结构和功能，破坏酶的正常功能，植物不能进行正常代谢活动，促进细胞衰老和 死亡。目前认为盐分促进衰老的机理主要包括：ｌ、过多的盐分使细胞膜结构受 到破坏。随着外界盐分浓度的增加，细胞膜透性逐渐增大，这种伤害不仅仅是渗 透效应，而且更主要的是离子效应。高浓度的ＮａＣＩ可以置换细胞膜系统所结合 的Ｃａ＋，使膜结合的Ｎａ＋／Ｃａ２＋增大，膜结构完整性及膜功能发生改变，促进Ｋ＋、 磷、有机溶质的外渗，细胞内Ｋ＋／Ｎａ＋比率下降。实验表明，生长在２５ｍＭＮａＣＩ中的菜豆叶片Ｋ＋强烈外流，在这种溶液中加入２ｍｍｏｌ／ＬＣａ２＋则可以抑制这种Ｎａ＋ 抑制的Ｋ＋外流现象，用２００ｍｍｏｌ／Ｌ甘露醇处理则不会有Ｋ＋外流。由此可以推断， 这种Ｋ＋外流不是因为渗透效应，而是由于盐离子破坏了膜的通透性所导致的；２、 过多的盐分使得植物光能利用率和Ｃ０２固定受到严重限制，促进脂质过氧化和 活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）的大量产生。研究发现，在叶绿体中Ｈ：０２。的浓度仅为１０ｕＭ时，光合作用便下降了５０％之多。所有这些活性氧都可以直接 或间接的侵害细胞内的生物大分子，影响蛋白质的合成和稳定性，损伤染色体结 构，阻碍ＤＮＡ合成，导致新陈代谢紊乱和细胞死亡。１．２Ｎａ＋离子毒性 所有盐离子都能影响植物生长，但并非所有的盐离子都严重抑制植物生长。植物体内存在多种多样的盐离子相互作用。一般来说，盐离子对植物生长的抑制 主要由Ｎａ＋和Ｃｌ‘引起的。对大多数植物来说，尤其是禾本科作物，Ｎａ＋是引起离 子损伤的最主要原因。大部分Ｎａ＋的运输都是单向性的，随着叶片的衰老，积累 的Ｎａ＋含量越来越多越多。Ｎａ＋的离子毒害主要是指Ｎａ＋在叶中的积累，会使老叶 从尖端和边缘开始直到整个叶片衰亡，单个叶片的生活史变短而导致植物生长 延缓，产量降低。叶中积累的Ｎａ＋浓度远远高于根中，植物的叶片比根系更容易 受到Ｎａ＋的影响。Ｎａ＋随着植物的蒸腾作用被快速运送到茎和叶中，积累了较高的 浓度，而根却可以通过Ｎａ＋的外排和向茎中的运输等方式降低Ｎａ＋在根中的积累。３华东师范大学硕士学位论文第一章文献综述１．２．１Ｎａ＋与Ｋ＋Ｎａ＋的代谢毒性主要是由于Ｎａ＋与Ｋ＋竞争细胞功能必需的Ｋ＋结合位点所造成 的。据统计，植物细胞中约有５０多种酶受Ｋ＋的激活，Ｋ＋对于ｔＲＮＡ结合到核糖体 上是必需的，各种蛋白的合成也同样需要高浓度的Ｋ＋存在。然而，在高盐环境中 Ｎａ＋离子内流，细胞内Ｋ＋／Ｎａ＋比率下降，但Ｎａ＋却无法代替Ｋ＋行使这种种功能。因 此，高浓度的Ｎａ＋严重干扰了细胞质中的各种正常的生理生化反应。１．２．２ Ｎａ＋与Ｃａ２＋盐胁迫还会导致Ｎａ＋对膜上Ｃａ２＋的取代，从而破坏细胞正常的膜结构。Ｃａ２＋ 在维持膜的完整性、稳定膜结构等方面具有重要作用。当细胞缺乏Ｃａ２＋时，细胞 就会逐渐解体死亡。在盐胁迫下，膜上的Ｃａ２＋被高浓度的Ｎａ＋所取代，使膜结合 的Ｎａ＋／Ｃａ２＋增大，膜结构完整性及膜功能发生改变，促进Ｋ＋、磷、有机溶质的外渗，细胞内Ｋ协ａ＋比率下降，抑制胞质中Ｈ＋跨液泡膜的运输和液泡膜Ｈ＋－ＰＰａｓｃ活性，跨液泡膜的ｐＨ梯度下降，液泡变得碱化，并且还诱导气孔关闭等。研究 发现，外源性的Ｃａ２＋可以明显缓解上述ＮａＣｌ诱导的胁迫效应（章文华等，１９９３）。１．２．３Ｎａ＋与营养亏缺Ｎａ＋的毒性还表现在Ｎａ＋的大量累积会导致其他营养因子的匮乏。植物的生 长离不开种类多样的数量充分的营养元素，而过多的Ｎａ＋会干扰植物根系质膜 上的Ｋ＋选择通道等运转体的活性，直接或间接的抑制其他营养成分的吸收，抑 制植物的正常生长发育。１．２．４Ｎａ＋间接引发的次级毒害效应在蒸腾作用促使下Ｎａ＋通过木质部进入外质体中，水分蒸发后Ｎａ＋在叶中逐 渐积累，使得叶片外质体中水势低于共质体水势，导致高渗胁迫。这一机制最初 由０ｅｒｔｌｉ（１９６８）提出并得到证实。Ｎａ＋的细胞毒害还引发另一种渗透问题，即 盐胁迫下，胞外水势低于胞内，植株根系吸水受到明显抑制，甚至发生水分由植 物体内向体外土壤中的倒流现象，导致细胞原生质体失水、收缩死亡。这也是作 物在盐渍化土壤中出苗率低及生长差的原因之一。除此之外，活性氧损伤也是 Ｎａ＋盐引起的次级效应之一。高Ｎａ＋环境中，叶绿体和线粒体电子传递链泄漏电 子的可能性大大增加。这些电子与０２反应产生大量的氧自由基，促进脂质过氧 化和活性氧ＲＯＳ的产生，并对核酸和蛋白质等造成严重损伤口１。４华东师范大学硕十学位论文第一章文献综述１．３植物的盐胁迫适应机制 耐盐性是指植物在盐胁迫下维持生长、形成经济产量或完成生活史的能力。 在自然界中，植物对盐的适应性存在有明显的差异，适应范围极其广泛，既有盐 敏感的甜土植物（ｇｌｙｃｏｐｈｙｔｅｓ），又有耐盐性较高的盐生植物（ｈａｌｏｐｈｙｔｅｓ）（Ｆｌｏｗｅｒｓ ｅｔａｌ，１９９７）。盐生植物能耐受高浓度的盐分，有些物种甚至能在２倍于海水的环境 中正常生长，但绝大多数的植物尤其是农作物，是甜土植物，它们并不能耐受高 浓度的盐分。植物界耐盐机制多种多样，归纳起来，可分为两种，即形态耐盐和 生理耐盐田’１引。前一种多在组织器官层面，后一种则多是在细胞和分子层面。形 态耐盐是指特殊环境下少数耐盐植物进化出特殊器官进行泌盐和稀盐。对大多数 植物来说，则是生理耐盐，其主要策略包括选择性吸收及离子区隔化机制、渗透 调节机制、活性氧清除机制、逆境信号传导介导的调控机制等等四’驯。１．３．１选择性吸收及离子区隔化机制 离子吸收对植物正常生长十分重要，对盐胁迫下的植物的生长则更为关键。 高盐环境中，过多的盐分干扰了植物体内的离子动态平衡。要预防或减轻盐胁迫 对植物的伤害，关键是如何限制盐分进入植物体内、如何有效地将已进入体内的 盐分分隔到代谢不活跃部位甚至排除到植物体外。植物某些器官对离子的选择性 吸收，就充当了植物耐盐的第一道防线。例如，大多禾本科植物其根表不吸收 Ｎａ＋，即使有Ｎａ＋进入细胞，也可以通过质子泵排除体外。根系是Ｎａ＋、ＣＩ。等离子 进入植物体内的主要屏障。但是仅仅依赖于离子的选择性吸收屏障则难以耐受高 度的盐害，这时，离子的区隔化机制便显得尤为重要。 成熟的液泡占据了植物细胞的大部分空间，它能够贮存营养和代谢产物，避 免有毒溶质对细胞质的伤害，大大提高细胞质表面积与体积之比，有利于细胞与 环境问的物质交换。液泡在细胞能量利用、膨压调节、信号传导和耐盐性中都起 着极其重要作用。植物在高盐环境下，将吸收到植物细胞中的大部分离子运输并 贮存于液泡中，从而降低细胞中的盐浓度，此过程称为离子区隔化。离子区隔化 作用，不仅是盐生植物适应盐渍生境的重要方式之一，而且在非盐生植物中也普 遍存在。 离子区隔化是依赖液泡膜上的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向运转蛋白来完成的，这是一个逆电 化学势的主动运输过程。该蛋白利用液泡膜上的Ｈｅ－ＡＴＰａｓｅ和Ｈｔ＿ＰＰａｓｅ建立的跨 膜质子梯度作为驱动力，以ｌ：１的比例介导Ｎａ＋和Ｈ＋的跨膜交换，将Ｎａ＋逆浓度５华东师范人学硕士学位论文第一章文献综述梯度运转到液泡内贮存ｎ副。有研究表明，高粱耐盐品种液泡膜转运蛋白的活性比 高粱盐敏感品种的高，液泡膜上Ｓａ＋／ｎ＋逆向转运蛋白的功能也较强。 现已明确，在亚细胞水平上，细胞原生质中各种离子的内稳态主要通过Ｎａ＋ 向液泡中转运并由此累积在液泡中实现。离子区域化机制可能是植物普遍具有的 能力，该活动主要依赖于离子的跨膜运输，由液泡型Ｎａ＋／Ｕ＋逆向转运蛋白完成。 这一过程最终可使液泡内积累４―１０倍于胞质的Ｎａ＋浓度。鉴于盐分区隔化机制在 植物盐适应过程中的重要作用，其中对于最为关键的运输蛋白Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋 白研究Ｒ益受到重视。自１９８５年Ｂ１ｕｍｗａｌｄ首次在甜菜的贮藏组织中发现液泡膜 Ｎａ＋／Ｈ＋逆向运转体活性之后，科学家相继在拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、滨藜（Ａｔｒｉｐｌｅｘｐａｔｅｎｓ）、冰叶日中花ｆ，Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｍ）、盐生车前（Ｐｌａｎｔａｇｏｍａｒｉｔｉｍａ）等盐生植物和甜土植物棉花（Ｇｏｓ叫ｐｉｕｍｈｉ ｒｓｕｔｕｍ）、柑橘（Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、长春花ｆ，Ｃａｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ夕、番杏（Ｔｅｔｒａｇｏｎｉａ ｔｅｔｒａｇｏｎｉｏｉｄｅｓ）等物种中发现了液泡膜Ｎａ＋／ｎ＋逆向运转体活性呻瑚氓矧。Ａｐｓｅ等证明拟南芥体内的ＡｔＮＨＸｌ编码一个 液泡Ｓａ＋／Ｉ－Ｉ＋逆向转运蛋白，ＡｔＮＨＸｌ过量表达的转基因拟南芥植株其液泡膜 Ｎａ＋／Ｈ＋交换率比野生型植株要高，转基因拟南芥植株Ｉ为Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白活性 和ＡｔＮＨＸｌ蛋白质含量的升高是一致的。转基因拟南芥植株在２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ胁迫条件下能正常生长，Ｎａ＋转运活性随着液泡中Ｎａ＋浓度的升高而增加，有力 的支持了Ｎａ＋的区隔化作用机制。此外，在油菜、番茄中过量表Ｊ盘ｚＡｔＮＨＸｌ也能显 著提高作物的耐盐性。该基因的研究越来越被人们所关注，成为了重要的耐．盐候选基因‘５硼１。１．３．２渗透调节机制 植物对盐渍的适应过程中除在细胞中吸收和积累无机盐离子外，同时还能在 细胞中积累一定数量的可溶性小分子有机物质，作为渗透调节剂共同进行渗透调 节，以适应外界的低水势。这些小分子化合物拥有许多相似的特性，分子表面有 较厚的水化层，溶解度高，极性电荷少，它们不仅能够维持细胞的膨压，还能稳定细胞质中酶分子的活性构象，保护其不受盐离子的直接伤害陋¨（Ｓｍｉｍｏｆ佯，１９９０）。从植株整体水平或整个细胞角度看，有机物质在渗透调节中的比重比无 机离子小得多（Ｒｏｄｉｇｕｅｚ等，１９９７），但它的作用却不容忽视，因为在细胞质里， 有机亲和物质的作用应是主要的，它既起保护作用，又能维持细胞质外的渗透平 衡。由于这些小分子化合物不干涉细胞正常的代谢过程，所以又被称为兼容物质，６华东师范人学硕上学位论文第一章文献综述常见的兼容物主要包括氨基酸类、季胺类、糖醇类等。 １．３．２．１氨基酸类 脯氨酸（ｐｒｏｌｉｎｅ）作为植物中主要的渗透调节物质之一，它不仅是生物大分 子的保护剂或羟基的清除剂，还是植物从胁迫条件回复正常过程中迅速、有效的 氮源、碳源和还原剂恤１。目前，关于脯氨酸作为无毒的渗透保护介质在植物中积 累已有很多报道，例如盐胁迫下的草莓叶片大量累积游离脯氨酸，且积累量与膜 通透性的增加值呈一定的正相关，与叶片的盐害积累程度也较一致口¨；Ｍａｔｔｉｏｎｉ 等哪！发现小麦在盐胁迫时大部分氨基酸含量上升，而脯氨酸的含量增加最为显 著，酶活性分析表明脯氨酸合成所需酶６一（１）一吡咯啉一５一羧酸还原酶的活性上 升，脯氨酸分解所需酶脱氢酶的活性下降；在拟南芥中将脯氨酸脱氢酶基因敲除 ∞３或表达脯氨酸脱氢酶的反义基因乜２１均能提高细胞内脯氨酸的积累水平并相应 提高植株对盐胁迫的耐受能力。 １．３．２．２季胺类 甜菜碱（ｂｅｔａｉｎｅ）是一类被广泛研究的季胺类渗透保护剂，在生物界广泛存 在，它的积累与一些代谢途径的调整有关。盐处理后，大多植物细胞内会累积大 量的甜菜碱。甜菜碱被认为是最好的渗透调节剂，它可以在细胞质之间累积，平 衡细胞质与液泡之间的渗透压，从而提高细胞的渗透调节能力。另外，甜菜碱还 能够提高细胞ＰＯＤ、ＳＯＤ等酶的活性，抑制细胞过氧化，维持细胞膜的完整性 和稳定性ｎ ８Ｊ。有研究证实，将甜菜碱合成中的关键基因胆碱脱氢酶基因（ＣｏｄＡ） 转化植物，能够明显提高转基因植株在生殖阶段的耐盐能力，这是由于植物器官中甜菜碱的积累水平提高造成的［搠。另外，将盐土植物碱蓬的甜菜碱醛脱羧酶基因引入烟草后也能显著提高其幼苗对盐分的耐受能力；将球形节杆菌 （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉ．ｆｏｒｍｉｓ ）的 １．３．２．３糖醇类 在这一类渗透调节物中研究的较为充分的是海藻糖。海藻糖是一类由两个 葡萄糖分子以Ｑ，Ｑ，ｌ，卜糖苷键构成的非还原性糖，存在于多种细菌、真菌 和一些耐旱的高等植物中，自身性质非常稳定，它在高温、高寒、高渗透压 及干燥失水等恶劣环境条件下能在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保 护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。目前已 从许多微生物中成功克隆了海藻糖代谢途径的各种酶基因，例如拟南芥海藻糖合 成酶基因ＴＰＳｌ、ＴＰＳ２等。有研究发现，通过过表达海藻糖基因可以改善水稻对ＣｏｄＡ转入水稻中也得到类似的结果啪１。７华东师范大学硕上学位论文第一章文献综述多种非生物胁迫的耐受性，转基因水稻中海藻糖的积累显著增加，并表现出对干 旱、盐渍、寒冷等多种环境胁迫的抗性泓一５１。胁迫条件下，转基因植株适度提 高海藻糖的表达水平会促进光和效率和减少光氧化的损伤。另外，果聚糖和某些 多元醇如甘露醇、山梨醇等，由于它们本身超强的亲水能力，都可以增强植物的 抗盐碱性。糖醇类作为植物对盐胁迫环境的适应性产物，由于其在细胞内的溶解 度较大，因此在盐胁迫下，其含量的增加对降低细胞水势、增加细胞液的浓度、 提高植物的吸水能力十分有利。１．３．３活性氧清除机制 植物的盐胁迫反应是个复杂的过程。由于盐胁迫对植物的各种代谢活动进行 渗透调节，造成植物体内环境严重水溃乏，从而导致超氧化物、过氧化氢、活性 氧自由基等活性氧物质的形成。这些对细胞有毒的活性氧能够通过对蛋白质、核 酸和油脂的氧化作用，使植物的正常新陈代谢遭到严重破坏。为了抵御盐害，植 物体内会产生一系列的解毒剂，以清除体内活性氧，使细胞免受毒害阻１。其中最明 显的是合成与清除活性氧有关的酶类，主要包括过氧化氢酶（ＣＡＴ）、过氧化物 酶（ＰＯＤ）、超氧化物岐化酶（ＳＯＤ）、谷胱甘肽还原酶（ＧＲ）、抗坏血酸过氧 化物酶（ＡＰＸ）等，它们的活性在盐胁迫时升高。研究表明这些抗氧化酶活性的 高低与植物的盐耐受程度存在某种相关性邮－７１Ｊ。 为了探明盐胁迫条件下活性氧清除剂的作用，人们对转基因植物中基因表达 的变化进行了研究。突变体分析发现，维生素Ｃ缺失的半显性拟南芥ｓｏｚｌ仅积累 了约３０％的抗坏血酸，植株对氧化胁迫表现出更高的敏感性呻１；在光照和盐分环 境下，过氧化物酶缺失的烟草提高了对氧化胁迫的敏感性啪１；在转基因烟草中过 表达莱茵衣藻的谷胱甘肽过氧化物酶有助于提高植株的抗逆能力；同时，过表达 能增强ＲＯＳ清除剂的积累水平及活性的一些酶如叶绿体Ｃｕ／Ｚｎ．ＳＯＤ、线粒体 Ｍｎ／Ｆｅ．ＳＯＤ、谷光甘肽－Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）／谷光甘肽过氧化物酶（ＧＰＸ）等，均 提高了转基因植物对胁迫的耐受能力邓司。上述研究表明，活性氧清除机制在植物 应对由非生物胁迫引起的过氧化毒害中起着重要作用，植物体内各种解毒剂协同 作用来抵抗干旱、盐渍胁迫诱导的氧化伤害。１．３．４逆境信号传导介导的调控机制 在胁迫环境中，植物体能通过信号传导作用，启动或关闭、增强或减弱某些基８华东师范人学硕上学位论文第一章文献综述因的表达，以达到抵抗逆境的目的。目前对于盐胁迫的信号转导途径有多种假说， 主要包括盐超敏感（Ｓａｌｔｏｖｅｒｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ＳＯＳ）信号传导途径、蛋白激酶信号转导途径、三磷酸肌醇（ＩＰ３）信号转导途径和ＡＢＡ信号转导途径等等ｍ１。１．３．４．１盐超敏感（Ｓａｌｔｏｖｅｒｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ＳＯＳ）信号传导途径ＳＯＳ途径是基于遗传、分子和生物化学分析得出的一条盐胁迫反应中的信 号通路。朱健康工作小组通过Ｔ－ＤＮＡ插入突变等方法乜３屯副，从拟南芥中筛选出了 一系列超盐敏感突变体（Ｓａｌｔｏｖｅｒｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ＳＯＳ），遗传分析表明这些突变体属 于５个等位基因群，ＳＯＳｌ＇－＇ＳＯＳ５。表型叠加分析证明ＳＯＳｌ、ＳＯＳ２和ＳＯＳ３共同 构成了一条完整的对盐胁迫响应的ＳＯＳ传导途径乜３。２７１。该传导途径的主要作用机 理如下：首先，盐胁迫引发了细胞质中的Ｃａ２＋信号，由于未知原因导致了细胞质 中Ｃａ２＋的富积，ＳＯＳ３结合这些游离的Ｃａ２＋，并激活ＳＯＳ２蛋白激酶，活化的 ＳＯＳ３－ＳＯＳ２激酶复合体使得ＳＯＳｌ或其它的转运蛋白进行表达。ＳＯＳｌ基因的表 达能够调控Ｎａ＋和Ｋ＋的动态平衡，从而使得植物可以忍受Ｎａ＊胁迫。其ｑｂＣａ２＋水平的升高是这个过程中最早的事件，而Ｓ傩３则可能是该信号传导途径中的一个关键限速分子（见图１）。 ＳＯＳｌ基因是植物耐盐性的一个必需基因。在拟南芥中，ＳＯＳｌ突变体对高 浓度Ｎａ＋或低浓度Ｋ＋环境相当敏感∞¨。ＳＯＳｌ编码质膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白，该 蛋白由１１４６个氨基酸残基组成，分子量约为１２７ｋＤ。ＳＯＳｌ的Ｎ端具有高度疏水特性， 存在１２个转膜区域。ＳＯＳｌ的跨膜区结构和动物或微生物的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白 相似。ＳＯＳ １的Ｃ端具有一个很长的亲水性尾巴暴露在细胞质中，为其结合众多 调节蛋白提供了更多的结合机会。此外，ＳＯＳｌ也有可能既是运输体又是感受元 件。如果ＳＯＳｌ是Ｎａ＋的感受元件，它可能控制植物中的ＳＯＳ２活性，这就形成了 一个调控回路，因为激活的ＳＯＳ２能够增强Ｎａ＋的外排能力。通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析检 测ｓｏｓｌ基因在盐胁迫下的表达情况，发现盐胁迫因子可以正调控ＳＯＳｌ的表达。 ＳＯＳ２突变体同样降低了植物在高Ｎａ＋和低Ｋ＋环境下的耐受性，实验证明，ＳＯＳ２ 编码一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，其催化结构与哺乳动物ＡｍＰ活化的蛋白激酶 （ＡＭＰＫ）以及酵母ＳＮＦｌ（ｓｕｃｒｏｓｅｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ１）非常相似，但调控功能却各不相同。ＳＯＳ３基因编码带有３个ＥＦ一臂的Ｃａ２＋结合蛋白，其Ｎ端有一个豆蔻酰化位 点，该位点：是ＳＯＳ３功能所必需的。ＳＯＳ３蛋白类似于动物神经传感器（ＮＣＡ）和钙 调磷酸酶的Ｂ一亚基，其独特的Ｃａ２＋结合性质决定了它在Ｎａ＋离子胁迫下信号传导９华东师范人学硕士学位论文第一章文献综述中的特殊作用心８‘。图１．１ＳＯＳ途径示意Ｆｉｇ．１．１ ＳＯＳ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓａｌｔ１．３．４．２蛋白激酶信号转导途径 到目前为止已研究的与植物干旱、盐渍应答有关的植物蛋白激酶主要有：促 分裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰ），与植物对高盐、干旱、低温、激素、创伤、病原反 应以及细胞周期调节等多种反应的信号传递有关：受体蛋白激酶（ＲＰＫ），主要与 感受发育和环境胁迫信号有关娜，剐：核糖体蛋白激酶，主要通过增加某些特定蛋 白的合成使植物对外界胁迫做出反应：转录调控蛋白激酶，主要参与生物生长细 胞周期、染色体正常结构维持、氨基酸合成等多种生命活动相关基因的表达，同 时还影响一系列转录因子的活性。 ＭＡＰＫ级联途径是蛋白激酶参与信号传导途径的最经典形式口７１。该激酶家族 成员在多种信号传递系统中起重要作用，它们均为保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激 酶，这类激酶主要包括促分裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）、促分裂原活化蛋白激酶的激酶（ＭＡＰＫＫ）、促分裂原活化蛋白激酶的激酶的激酶（ＭＡＰｌ（】嫩）三种类型。在真核细胞内，这三种类型的蛋白激酶组成ＭＡＰ激酶级联途径（ＭＡＰｋｉｎａｓｅ１０华东师范大学硕上学位论文第一章文献综述ｃａｓｃａｄｅ），通过ＭＡＰＫＫＫ―ＭＡＰＫＫ＿ＭＡＰＫ逐级磷酸化激活，并将级联反应信 号不断放大并传递下去。目前研究表明，ＭＡＰ激酶级联途径与植物对高盐、干 旱、激素、创伤、病原反应等多种反应信号传递有关。迄今已从多种植物中分离 到了ＭＡＰＫ基因。最早分离的植物蛋白激酶基因是小麦ＰＫＡＢＡｌ，它被低温、干 旱、ＮａＣＩ、ＡＢＡ所诱导。从拟南芥中也分离了许多不同的蛋白激酶基因，其中 ＡｔＭＥＫＫｌ参与拟南芥对干旱、高盐和触伤胁迫的信号传导。酵母互补研究证实， ＡｔＭＥＫＫＩ－＋ＡｔＭＥＫｌ－－－，ＡｔＭＰＫ４可能在同一信号传导途径中起作用，这是在植物 中鉴定出的第一条ＭＡＰ激酶级联途径。盐胁迫能够诱导ＡｔＭＥＫＫｌ的表达，而 ＡｔＭＫＫ２则受ＭＫＫｌ（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）、盐胁迫、冷害等因子的特异激活， 过量表达ＡｔＭＫＫ２的转基因植物的耐盐性和耐冷性均增强。研究还发现， ＡｔＭＫＫ２可与下游的ＭＰＫ４和ＭＰＫ６直接作用，诱导下游一系列盐胁迫相关基 因的表达，这是一个介导植物盐害和冷害的ＭＡＰＫ信号传导途径Ｈ６?４７１。２．植物Ｎ０／Ｈ＋逆向转运蛋白研究进展２．１Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的发现和基因克隆 Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白是生物界普遍存在的负责Ｎａ＋、Ｈ＋交换的一种跨膜运输蛋白，在植物中扮演着重要角色，是植物耐盐的关键因子ｎ羽。植物中Ｎａ＋／Ｈ＋逆向 转运蛋白最早是在大麦ｍ３（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｇａｒｅ）根中发现的，并将其定位于质膜。 后又在甜菜贮藏组织的液泡膜囊泡中检测到液泡Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的活性。研 究者随后相继在盐生植物滨藜咖１（Ａｔｒｉｐｌｅｘ ｐａｔｅｎｓ）、冰叶日中花 Ⅲ１（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｍ）、盐芥呻１（Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ ｓａｌｓｕｇｉｎｅａ）等和甜 土植物棉花ｎ３３ｆ，Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉ ｒｓｕｔｕｍ）、拟南芥№２１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、番杏 晦１（Ｔｅｔｒａｇｏｎｉａ ｔｅｔｒａｇｏｎｉｏｉｄｅｓ）、玉米阳司（ｚｅａ ｍａｙｓ）、长春花ｆ，Ｃａｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ， 等植物中普遍检测到了这种蛋白活性，表明这种蛋白质在植物中广泛存在。随着 分子生物学工作的开展，一系列Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因被相继得到分离和克 隆∞３瑚１。研究发现，这种蛋白由一个多基因家族控制ｎ ６。，在拟南芥中已克隆到６ 个ＮＨＸ基因即ＡｔＮＨＸｌ．ＡｔＮＨＸ６，这些基因表现出不同的时空表达模式，在不 同的器官中发挥着各自不同的功能泓１。华东师范大学硕十学位论文第一章文献综述２．２Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的分子结构特征 尽管不同生物中Ｎａ＋ＡＩ＋逆向转运蛋白的分子量、氨基酸数量、跨膜域数目有所不同，但Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白在跨膜域的组成上是高度保守的。在蛋白质 的拓扑结构上，Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白含有９―１２个跨膜域。此外，不同生物如拟 南芥中的ＡｔＮＨＸＩ、哺乳动物中的ＮＩＬＥ以及酵母中的ＮＨＸＩ编码的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向 转运蛋白都具有相似的氨氯吡嗪咪蛋白结合区域（ＬＦＦＩＹＬＬＰＰＩ基序）［１７，３５］。 Ｓａｒｄｅｔ等完成了第一个Ｎａ＋／Ｈ＋逆向运转蛋白（ＮＨＥ）的分子克隆啪１，对其氨基 酸序列的亲水性分析结果显示，该Ｎａ＋／Ｉ－Ｉ＋逆向运转蛋白的Ｎ端结构域是由大约 ５００个氨基酸形成的１２个跨膜片段组成，这一区域对Ｎａ＋／Ｉ－Ｉ十逆向运转蛋白的底 物Ｎａ＋的竞争性抑制剂氨氯吡嗪咪（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）及其衍生物敏感，是负责离子转运 的核心区域：与之相连的Ｃ末端结构域由大约３００个氨基酸组成，位于细胞质一 侧，此结构域内含有多个蛋白激酶作用位点，能够与钙调素（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）结合， 参与多种信号反应，是调节活性的区域ｎ６１。同时，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等（２００３）通过蛋白酶保护实验证明拟南芥的液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋ 逆向运转蛋白由１２个跨膜（ＴＭ）结构域，并据此提出一个拓扑结构模型如图１．２ 所示：图１．２拟南芥ＡｔＮＨＸｌ拓扑结构模式图 Ｃｙｔ指细胞质侧，Ｖａｃ指液泡侧Ｆｉ９１．２ ＰｒｏｐｏｓｅｄＴｏｐｏｌｏ＃ｃａｌ ＭｏｄｅｌｏｆＡｔＮＨＸｌ（Ｃｉｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｌｕｍｗａｌｄ Ｅ，２００３）１２华东师范人学硕士学位论文第一章文献综述拟南芥液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白ＡｔＮＨＸｌ是由９个跨膜结构域、１个亲水 Ｃ端结构域和３个疏水区组成的：疏水区不跨液泡膜，但是与膜结合；ＡｔＮＨＸｌ的Ｎ端面向细胞质；几乎整个Ｃ端的亲水区均存在于液泡的内腔中，Ｃ端决定Ｎａ＋／Ｉ－Ｉ＋逆向转运蛋白的离子选择性。 迄今为止，Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白中很少的功能残基被鉴定，只有哺乳动物 Ｎｈｅ的ａｍｉｌｏｒｉｄｅ（氨氯吡嗪咪）结合域和糖基化位点中的氨基酸残基、ＡｔＮｈｘｌ 的ＴＭ３区的８１ｕ下ＩＹｕＪＰｌ９０等已有报道。ＳｙｎＮｈａＰＡｓｐ．１３８是行使功能必不可 少的，在很多生物的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因中都是非常保守的。ＳｙｎＮｈａＰ和 ＳＯＳｌ都有长的Ｃ端亲水的尾部且它们的跨膜区有非常显著的序列相似性，Ｃ端 长的尾巴在运输中起重要作用。２．３Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白分类 系统学研究认为，植物ＮＨＸ属于Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白ＮＨＥ／ＮＨＸ亚家族的成员，为阳离子逆向转运蛋白（ｃａｔｉｏｎｐｒｏｔｏｎ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｌ，ＣＰＡＩ）家族的一个亚类。植物质膜上的ＳＯＳｌ蛋白则归属于ＣＰＡＩ家族ＮｈａＰ／ＳＯＳＩ亚家族，其中包括拟南芥的的 ＳＯＳｌ（曾被重命名为ＡｔＮＨＸ７和ＡｔＮＨＸ８）陋３删。基于蛋白质中氨基酸序列的相似性，Ｎ】ｍ州ＨＸ亚家族蛋白根据其亚细胞定位可以分为两大类，一类位于细胞内部（ｉｎｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒ，ＩＣ），命名为ＩＣ．ＮＨＥ／ＮＨＸ，另一类位于细胞质膜上（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＰＭ），命名为ＰＭ．ＮＩ删Ｘ。植物ＮＨＸ蛋白大多都属于ＩＣ类，它们可以进一步分为两类，Ｉ类蛋白定位于液泡膜上，在ｌＣ类群下形成一支独立的进化分支；ＩＩ类定位于内膜囊 泡上，在真菌及动物内膜上存在相应的同源蛋白。模式植物拟南芥和水稻的ＭＨＸ 基因家族数量相当。拟南芥ＮＨＸ蛋白家族由ＡｔＮＨＸｌ．ＡｔＮＨＸ６ ６个成员组成，而水 稻ＮＨＸ蛋白家族则包括ＯｓＮＨＸｌ．ＯｓＮＨＸ５，其中ＡｔＮＨＸｌ．ＡｔＮＨＸ４和 ＯｓＮＨＸｌ．ＯｓＮＨＸ４为Ｉ类蛋白畸¨，ＡｔＮＨＸ５、ＡｔＮＨＸ６和ＯｓＮＨＸ５为ＩＩ类蛋白。大 豆ＧｍＮＨＸｌ、番茄ＬｅＮＨＸｌ、牵牛ＩｎＮＨＸｌ、玉米的ＺｍＮＨＸＩ．ＺｍＮＨＸ６也都是定位 于液泡膜的Ｉ类蛋白。在ＩＣ．ＮＨＥ／ＮＨＸ两个分支中，同类之间相似性较高，Ｉ类蛋 白之间约为５４％一８７％，ＩＩ类蛋白之间约为７２％一７９％，但两类蛋白之间的相似 性极低仅为２０％一２５％。华东师范人学硕Ｊ：学位论文第一章文献综述２．４Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白功能研究及转基因 盐胁迫下Ｎａ＋／Ｉ－Ｉ＋逆向转运蛋白活性一般会增加，原因有二：一是诱导了Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的合成，二是激活了原有的无活性的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白。 在膜质子泵提供的能量下，位于质膜和液泡膜的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白分别将Ｎａ＋ 区隔化进液泡中和排到植物体外，从而降低细胞质中Ｎａ＋的浓度，使过多的Ｎａ＋离 开代谢位点，减轻其对酶和膜系统的伤害，特别是Ｎａ＋的区隔化还可降低细胞水势， 抵抗盐分造成的渗透胁迫。所以，Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白对植物的抗盐性起着重要 作用，Ｎａ＋通过Ｎａ＂／Ｈ＋逆向转运在液泡中的积累是盐生植物和耐盐甜土植物的主 要特征。Ａｐｓｅ等对转ＡｔＮＨＸｌ基因的拟南芥植株进行了分析，过量表达ＮａⅧ＋逆向转运蛋白的转基因拟南芥植株在２００ ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ中能正常生长发育。免疫印 迹表明，转化植株叶片的提纯液泡中含有比从野生型叶片提纯液泡中更多的 ＡｔＮＨＸｌ产物，液泡上Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白活力增强。Ｚｈａｎｇ等在番茄、油菜ｌ舳】 中过量表达ＡｔＮＨＸｌ，得到了世界上第一批真正意义上的耐盐作物。用２００ ｍＭ ＮａＣｌ浇灌，转基因植株仍可正常生长、开花并结实，而且盐是在转基因番茄的 叶中而不是果实中积累，这保证了果实的质量Ｈ５’７４１。一般来讲，植物的耐盐性是 由多基因控制的，但是把ＡｔＮＨＸ单基因转化入植物即能明显的改善植物的耐盐 性状，这充分说明了Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因在植物耐盐基因工程中巨大的潜 在的应用价值Ｈ４ｌ。鉴于植物Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白在Ｎａ＋、Ｈ＋细胞内外的转运中担任主要角色， 极大的影响细胞渗透、离子均衡、ｐＨ值和细胞体积，从而对植物的耐盐性、抗 旱性等生理机能产生重要的影响，因此被认为是目前最有希望利用其特性培养转 基因耐盐品种的基因Ｈ∞。３．本研究的目的意义及主要技术路线３．１研究目的意义荞麦（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ Ｇａｅｒｔｎ）起源于中国，栽培历史悠久，由于其独特的 营养价值被认为是世界性的新兴作物。它是小宗作物，但却能弥补大宗作 物优势的不足和不具有的成分：它能种植在大宗作物不能种植的生育期短、 冷凉地域和瘠薄土壤，它不仅含有大宗作物含有的营养成分，而且还含有 大宗作物不含的而且是人体所必须成分，其营养价值居所有粮食作物之首。１４华东师范人学硕士学位论文第一章文献综述荞麦特别是苦荞麦，富含多种特殊微量元素及药用成分，对现代“文明病” 及中老年心脑血管疾病有良好的预防和辅助治疗功能，因而受到各国的重 视。荞麦营养丰富、抗逆性强、极耐寒瘠，是一种不可忽视的非常有价值的 自然资源。但目前关于荞麦的研究多集中在品质营养和栽培管理方面，在分子遗 传育种和耐盐基因克隆等方面还没有相关报道。 我国约有２．０ｘ１０ａ ｈｍ２盐荒地和３．８ｘ１０ｓ ｈｍ２盐渍化土壤，约占全国土地面 积的１／４。人口的剧增和环境的压力使得我们不得不加快培育抗旱耐盐作物、提 高土地利用效率的研究。ｔｑａ＋／Ｉｔ＋逆向转运蛋白基因作为首要的的耐盐候选基因， 在植物的抗旱耐盐生理过程中发挥着举足轻重的作用。因此，对植物Ｎａ＋／Ｈ＋逆 向转运蛋白的分子克隆、表达分析、结构功能分析等研究，对于其作用机制及调 控机理的研究，以及利用这些基因进行分子育种，培育有重要社会和经济价值的 转基因植物，提高植物的抗盐耐旱能力，对于生态环境的改善和现代农业的发展 均具有十分重要的意义。 本研究在国内外首次从荞麦（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ Ｇａｅｒｔｎ）中克隆得到Ｎａ＋ＡＩ＋逆向 转运蛋白基因，并对其功能和盐胁迫后的表达情况进行初步探究。３．２本研究的主要技术路线 拟定的主要技术路线如下： １．荞麦幼苗的培养； ２．设计简并引物，获取荞麦Ｎａ＋／ｎ＋逆向转运蛋白基因的部分片段； ３．利用ＲＡＣＥ技术，获取养麦Ｎａ＋／ｎ＋逆向转运蛋白基因的全长序列； ４．酵母表达载体ｐＹＰＧＥｌ５－ＦｔＮＨＸ的构建； ５．酵母互补实验初步验证荞麦Ｎａ＊／Ｈ＋逆向转运蛋白基因的功能； ６．利用Ｒｅａｌ．Ｔｉｍｅ ＰＣＲ技术分析荞麦盐处理后Ｎａ＋／ｎ十逆向转运蛋白基因的表达 情况。华东师范大学硕上学位论文第二二章荞麦Ｎａ＋Ｍ＋逆向转运蛋白基冈部分保守片段的克隆第二章荞麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因部分保守片段的克隆１．前言荞麦（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ Ｇａｅｒｔｎ）营养丰富、抗逆性强、极耐寒瘠，是一种不 可忽视的非常有价值的自然资源。但目前关于荞麦的研究多集中在品质营养和栽 培管理方面，在分子遗传育种和耐盐基因克隆改造方面还没有相关报道。本研究 目的是从荞麦中克隆得到Ｎａ＋／Ｉ－Ｉ＋逆向转运蛋白基因，并进一步了解Ｎａ＋ＡＩ十逆向 转运蛋白的功能特征。２材料与方法２．１植物材料 荞麦（Ｆ砌ｒ纽，－把Ｈ朋Ｇａｅｒｔｎ）种子购自四川西昌，种子冲洗干净后，浸水处 理２天，种植于（蛭石：珍珠岩＝３：１）普通土壤中，培养箱（２２＂Ｃ，２５００ＬＸ）培 养６周。２．２主要试剂ＲＮＡｉｓｏＲｅａｇｅｎｔ试剂盒购自ＴＡＫＡＲＡ；反转录试剂盒、Ｔａｑ酶、限制性内切酶、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ＲＮＡｓｅ、ＴＲＩＳ等为ＴＩＡＮＧＥＮ公司产品；琼脂糖凝胶ＤＮＡ 回收试剂盒、ｐＧＥＭ－ＴｅａｓｙＶｅｃｔｏｒ、ＤＮＡ连接试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ：ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、ｔｒｙｐｔｏｎｅ、ａｇａｒ、Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、Ｘ―ｇａｌ、ＳＤＳ等购自Ａｍｒｅｓｃｏ；氯仿、苯酚、异丙 醇、无水乙醇、９５％乙醇、甲醛、甲酰胺、葡萄糖、胰酪胨、琼脂粉等为国产制 剂，ＮａＣＩ、ＮａＯＨ、ＣａＣｌ２等无机试剂均为国产分析纯试剂。 常用溶液配制方法： （１）ＴＡＥ缓冲液（Ｔｒｉｓ－ＨＡｔ）：ｌｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．ｏ）、０．０４Ｍ （２）ＬＢ液体培养基：ＮａＣｌ（０．５％）、ｙｅａｓｔ （３）ＬＢ固体配养基：ＮａＣｌ（０．５％）、ｙｅａｓｔａｇａｒ（２％） Ｔｒｉｓ―ａＡｃｅｘｔｒａｃｔ（Ｏ．５％）、ｔｒｙｐｔｏｎｅ（１．０％） ｅｘｔｒａｃｔ（０．５％）、ｔｒｙｐｔｏｎｅ（１．０％）、（４）质粒提取溶液：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ：２５ｒａＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｒａＭ葡萄糖１６华东师范大学硕士学位论文第二章荞麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因部分保守片段的克隆Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ：１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２Ｎ ＮａＯＨＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩｈＨ２０２８．５ｍＬ、冰醋酸１１．５ｍＬ、５ＭＫＡｃ ６０ｍＬ（５）ＩＰＴＧ（２０％，ｍⅣ）溶液：ｌｇ ＩＰＴＧ溶于４ｍＬｄｄＨ２０中，定容至５ｍＬ，过 滤灭菌后，．２００Ｃ避光保存。（６）Ｘ．ｇａｌ（２０％，ｍⅣ）溶液：２０ｍｇＸ－ｇａｌ溶于ｌｍＬ二甲基甲酰胺中，－２０。Ｃ避光保存。２．３主要仪器立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、ＰＪ．ＴＧＬ－１６Ｂ台 式高速离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）、ＰＴＣ．１００Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅＰＣＲ仪（ＢＩＯ．ＲＡＤ）、ＨＮ．１型多功能水平电泳槽（大连竞迈生物科技有限公司）、 ７５２紫外可见光分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）、ＫＨ．ｕｖＩＩＩ型透射反射分 析仪（上海康禾实业有限公司）、电压仪（大连捷迈科贸公司）、ＨＨＳ型电热恒 温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、空气浴振荡器（哈尔滨市东明医疗仪器厂）、无菌操作台（ＤＬａ．１Ｆ医用型）（北京东联哈尔仪器制造有限公司）。２．４荞麦幼苗总ＲＮＡ的提取２．４．１ＲＮＡ提取 使用ＲＮＡｉｓｏ Ｒｅａｇｅｎｔ试剂盒（ＴＡＫＡＲＡ Ｃｏｄｅ：Ｄ３１２）从荞麦镰ｔａｔａｒｉｃｕｍＧａｅｒｔｎ）ｒ辛提取ＲＮＡ。具体步骤如下： １、将荞麦幼苗嫩叶剪下（１９左右）置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状。２、加入ＲＮＡｉｓｏ Ｒｅａｇｅｎｔ试剂充分与植物粉末作用，混匀，分装在２ｍＬ离心管中，每管分装ｌｍＬ，室温放置１０ｍｉｎ。１２０００ｒｐｍ，４０ Ｃ离心ｌｍｉｎ，取上清。 ３、每管加入５ＭＮａＣＩ２００／ｔＬ，氯仿６０毗Ｌ，剧烈震动２０ｓｅｃ。１２０００ｒｐｍ，４０ Ｃ离心１５ｍｉｎ。若富含多糖、多酚等次级代谢产物可重复此步骤一次。 ４、上清转移到新管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放置１０ｍｉｎ。１２０００ｒｐｍ， ４０Ｃ离心１０ｍｉｎ。 ５、弃上清，用７５％乙醇洗涤沉淀。６０００ｒｐｍ，４０Ｃ离心５ｍｉｎ。除去乙醇。 ６、干燥沉淀，用ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，．２００Ｃ保存。２．４．２ＲＮＡ纯度、浓度及完整性检测（１）ＲＮＡ纯度、浓度检测１７华东师范大学硕十学位论文第二章荞麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白摹冈部分保守片段的克隆利用７５２紫外可见光分光光度计测定２６０和２８０ｎｍ的光吸收值，确定ＲＮＡ 的浓度及纯度。 ＲＮＡ浓度计算公式：ＲＮＡ浓度（ｎｇ／∥Ｌ）＝ＯＤ２６０ Ｘ ４０ ｎｇ／／比ＬＸ稀释倍数 ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值评估ＲＮＡ的纯度，ＯＤ２６０／ＯＤ２∞比值在１．８－２．０，表明ＲＮＡ 样品纯度较好；ＯＤ２一ＯＤ２８０比值小于１．８，则说明ＲＮＡ样品中蛋白质、酚或多 糖等杂质较多；ＯＤ２６０／ＯＤ２舳比值大于２．Ｏ，则说明ＲＮＡ样品可能有所降解。 （２）ＲＮＡ完整性检测 利用甲醛变性电泳检测ＲＮＡ完整性。①准备材料：１０×ＭＯＰＳ电泳缓冲液：１０ｒａＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０），０．２Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ ７．０），２０ｍＭ乙酸钠１０Ｘ甲醛凝胶加样缓冲液：１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．Ｏ），５０％甘油，Ｏ．２５％（ｍ／ｖ）二甲苯氰蓝乙酸，０．２５％（ｍ／ｖ）溴酚蓝②配制１００ｍＬ含２．２ｍＭ甲醛的１％琼脂糖凝胶：将１９琼脂糖加入到７２ｍＬｄｄＨ２０中，煮沸溶解，冷却至５５。Ｃ加入１０ｍＬｌ０Ｘ ＭＯＰＳ电泳缓冲液和１８ｍＬ去离子甲醛，通风橱中灌胶。ＲＮＡ点样样品处理：ＲＮＡ ３∥Ｌ１０ＸＭＯＰＳ电泳缓冲液２∥Ｌ１０∥Ｌ ４∥Ｌ １∥Ｌ ２０∥Ｌ甲酰胺甲醛溴化乙锭（２００肛ｇ／ｍ１）Ｔｏｔａｌ将上述溶液混匀，５５０ Ｃ温育６０ｍｉｎ，冰浴冷却２ ｍｉｎ，离心５ｓｅｅ，加入２ｉｌＬ １０Ｘ甲醛凝胶加样缓冲液，置于冰上。 将配制好的凝胶放入电泳槽中，加５００ｍＬ１ Ｘ ＭＯＰＳ电泳缓冲液，将ＲＮＡ样品和Ｍａｋｅｒ加入到加样孔中，５ｖ／ｃｍ电压电泳１ｈ左右，紫外检测仪检测。２．５荞麦Ｎａ＋，Ｈ＋逆向转运蛋白基因保守区序列的克隆２．５．１ ＲＴ－ＰＣＲ１８华东师范大学硕士学位论文第二章荞麦Ｎａ＋小＋逆向转运蛋白基冈部分保守片段的克隆利用ＴＩＡＮＧＥＮ Ｑｕａｎｔ ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒进行ＲＴ―ＰＣＲ。楚王到组盛醒生』厦整基厦廛液；ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２０ １０ｘＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ４．７５¨Ｌ １“Ｌ １¨Ｌ ０．２５ ｐＬｄＮＴＰ ＭｉｘｔｕｒｅＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｏｌｉｇｏ ｄＴ－Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ０．５肚０．５¨Ｌ ２ ｌａＬ １０ｐ．ＬＱｕａｎｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＲＮＡ ｓａｍｐｌｅ总量反转录反应条件：３７ｏＣ，６０ ｒａｉｎ，４ｏＣ保温。２．５．２利用简并引物进行ＰＣＲ （１）简并引物的设计 根据Ｇｅｎｂａｎｋ已知的拟南芥ＡｔＮＨＸｌ（ＡＦｌ０６３２４）【６２】、盐角草ＳｅＮＨＸｌ （ＡＹｌ３１２３５）【７８】、蕃杏ＴｔＮＨＸｌ（ＡＦ５２７６２５）【５１、牵牛花ＩｎＮＨＸｌ（ＡＢｌ９４０６５） ［４２】、水稻ＯｓＮＨＸｌ（ＡＢ０２１８７８）【５ Ｊ］、大麦ＨｖＮＨＸｌ（ＤＱ３７２０６１）［４０】等多种植 物的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的氨基酸序列，进行多序列比对。比对结果如下（图２―１）：图２．１植物Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白保守氨基酸序列多序列比对Ｆｉｇ．２．１Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆＮａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓ ｆｒｏｍｓｏｒｌａｃｐｌａｎｔｓ１９华东师范人学硕：Ｌ学位论文第：：章荞麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因部分保守片段的克隆选取ＰＰＩＩＦＮＡＧＦＱＶ和ＬＹＳＬＶＦＧＥＧＶＶ两段高度保守的区域，设计简并引物如下：Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａｒｄ ＦｔＤＰＦ：５７－ＣＣ（Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ｇ／Ｃ）ＡＴ（Ｃ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｃ）ＴＴＣＡＡＴＧＣＡＧＧ（Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＴＴＴＣＡ－３’；Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＦｔＤＰＲ：５ ７－（Ｔ／Ｃ）ＡＣＡＡＣＡＣＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＣ（Ａ／Ｇ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ｇ／ａ３ＡＣ（Ａ／Ｃ）ＡＧ ＡＣＴＧＴＡ－３’（２）按下列组成配制反转录反应液：ＭｉｌｌｐｏｒｅＨ２０ ２７．７５¨Ｌ５ ｘＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｄＮＴＰＦｔＤＰＦ ＦｔＤＰＲ５“Ｌ ４ ＬＬＬ１ Ｉ．ｔＬ １ ｌａＬ ０．５¨Ｌ ３“ＬＰｆｈ Ｅ反转录ｅＤＮＡ 总 （３）ＰＣＲ反应程序：９４０Ｃ９４０ Ｃ量４０皿４ｍｉｎ３０ｓｅｃ、 Ｉ５５。Ｃ ３０ｓｅｃ７２０ Ｃｌｌｍｉｎ ５ｍｉｎ３２个循环Ｊ７２０Ｃ４ｏＣ保温（４）１％琼脂糖凝胶电泳检测。２．５．３回收ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物 （１）将目的ＤＮＡ条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称重。（２）按ｌＯＯｕＩ／Ｏ．１９的比例加入溶胶液，６５０ Ｃ水浴，其间不断翻转离心管直至溶化．（３）将上一步所得溶液加入吸附柱，静置ｌｍｉｎ，１６０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，倒掉废液。 （４）向吸附柱加入７００１ａＬ漂洗液，１６０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，倒掉废液。 （５）向吸附柱中加入５００ｐＬ漂洗液，１３０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，倒掉废液。２０华东师范大学硕上学位论文第二章荞麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白皋凶部分保守片段的克隆（６）１６０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，尽量除去漂洗液中的乙醇，室温晾干。 （７）将吸附柱置于干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加洗脱缓冲液，室温 放置２ｍｉｎ。１３０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ收集ＤＮＡ溶液。２．５．４目的产物的转化克隆 （１）加Ａ反应 反应成分： 回收产物５ｘＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｍｉｘ 也气ＴＰ Ｔａｑ Ｅ１５ⅣＬ ５∥Ｌ４∥Ｌ １／．ｔＬ总 反应程序：３７０Ｃ４ ｏＣ量３０ｍｉｎ２０ ｇＬ保温（２）连接载体 将各组分放在冰上融化，短暂离心： 加Ａ的目的片段ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ２ｘ ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ３／ｚＬ１∥Ｌ ５／ｚＬ １／ｚＬ １０肛ＬｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ ＬｉｇａｓｅＴｏｔａｌ轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。 将混合反应液置于１６０Ｃ过夜。 （３）大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞的制备： １、挑取大肠杆菌ＤＨ５ａ的单菌落，接种于５ｍｌ不含抗生素的ＬＢ液体培养基中， ３７℃震荡培养１２ｈ。 ２、按１％（Ｖ／Ｖ）的量转入新鲜ＬＢ培养基液体中，３７。Ｃ振荡培养，分光光度计 测定ＯＤ６００值为０．４。 ３、将５０ｍｌ的培养液转入两个预冷的无菌离心管中，于冰上放置３０ｍｉｎ。 ４、４℃，３５００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去掉上清液。 ５、向每个离心管中各加入１０ｍｌ冰冷的０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＣａＣｌ２溶液重悬菌体，冰浴２１华东师范人学硕．１：学位论文第二章养麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白菜凶部分保守片段的克隆３０ｍｉｎ。６、４＂Ｃ，３５００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。７、弃去上清，将菌体悬浮于２ｍｌ冰冷的ＣａＣｌ２甘油溶液，分装到１．５ｍｌ离心管中，每管１０吮Ｌ，于．８０。Ｃ冰箱保存备用。（４）转化Ｅ．ｃｏｌｉ １、取１管感受态细胞，加入上面ｌＯ／ｚＬ连接反应液，轻弹混匀，微离心，立即 置冰上，放置３０ｍｉｎ。 ２、将离心管置于４２＂Ｃ恒温水浴中热激９０ｓ。 ３、冰上放置３ｍｉｎ。 ４、加入８００／ｚＬ无抗生素的ＬＢ液体培养基，混匀，３７。Ｃ培养６０ｍｉｎ。 ５、取即Ｌ ＩＰＴＧ、４弘ＬＸ．Ｇａｌ、５０／ｚＬ无菌水混匀，涂布于含有ｌ删ｍｌＡｍｐ氨苄青霉素的固体ＬＢ平板上，３７＂Ｃ静置待用。 ６、将转化产物离心浓缩，取适量涂布于待用平板上。 ７、将平板倒置，于３７℃培养１６小时左右。２．５．５筛选鉴定 （１）蓝白斑筛选及扩大培养 在转化平板上挑取白色单克隆接种于含５０ｎｇ／ｍｌ Ａｍｐ氨苄青霉素的ＬＢ培 养基中，２００ｒｐｍ，３７０摇床过夜培养。 （２）质粒的快速提取 １、取过夜培养的菌液１．２ｍＬ转入１．５ｍＬ的离心管中，１２０００ｒｍｐ，离心ｌｍｉｎ， 弃尽上清。 ２、往沉淀中加１０吮Ｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ，漩涡器上振荡使菌体重悬，混匀。３、加入２０吮Ｌ现配的Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ，再加入几滴氯仿／异丙醇（２４：１）的裂解液，颠倒混匀。 ４、加入２００＃ＬＳｏｌｕｔｉｏｎｌＩＩ，用力混匀。静置５ｍｉｎ，充分裂解。１３０００ｒｍｐ，离心１５ｍｉｎ。５、取ｌｍｌ无水乙醇在新的离心管中，备用。 ６、吸取上清，转移至上述离心管中，颠倒混匀。静置１０ｒａｉｎ。 ７、１３０００ｒｍｐ，离心１５ｍｉｎ。 ８、小心弃去上清，加入７５％乙醇，颠倒３次，１００００ｒｍｐ，离心２ｍｉｎ。弃尽液体，华东师范大学硕上学位论文第二章养麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基凶部分保守片段的克隆温度干燥至沉淀变透明。９、加入３毗Ｌ无菌水溶解沉淀。加入ｌ＃ＬＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ），３７。Ｃ水浴１５ｍｉｎ，．２００ Ｃ保存。（３）ＥｃｏＲＩ酶切鉴定重组质粒按照以下成分在无菌离心管中加入各种成分：Ｍｉｌｌｐｏｒｅ Ｈ２０１０×ＢｕｆｆｅｒＥｃｏＲ Ｉ１３ｕＬ ２“Ｌ１“Ｌ重组质粒ＤＮＡＴｏｔａｌ乱Ｌ２０“Ｌ混匀，短暂离心后，３７。Ｃ水浴２．３ｈ。加入１０ｘｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ中止酶切反应。 取反应液５ｕｌ进行１％琼脂糖凝胶电泳观察结果。 （４）ＰＣＲ鉴定重组质粒 按照以下成分在无菌离心管中加入各种成分：ＭｉｌｌｐｏｒｅＨ２０ ３７／ｚＬ ５“Ｌ１０ｘＰＣＲ ＢｕｆｆｅｒｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（１０ｒａＭ）４∥Ｌ１肛Ｌ １ ｇＬＦｔＤＰＦ ＦｔＤＰＲ重组质粒ＤＮＡ Ｔａｑ酶 总量 ＰＣＲ反应程序如下：１／ｚＬＩ＃Ｌ ５０／ｔＬ９４。Ｃ预变性４ｍｉｎ；９４０Ｃ变性３０ｓｅｃ，５５０Ｃ退火３０ｓｅｃ，７２０Ｃ延伸ｌｍｉｎ， 共３０循环；７２。Ｃ ５ｒａｉｎ充分延伸；４。Ｃ保温。 最后，取反应液进行１％琼脂糖凝胶电泳观察结果。２．５．６测序及序列分析 将鉴定出的阳性重组质粒送至上海生工生物科技有限公司进行测序。 序列分析软件为ＤＮＡｃｌｕｂ软件。 同源性检索网址：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴｐ华东师范大学硕士学位论文第二章养麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白皋因部分保守片段的克隆３．结果与分析３．１ＲＮＡ抽提结果与分析 ＲＮＡ的浓度及纯度 提取ＲＮＡ的质量直接影响ＲＮＡ的逆转录活性及后续实验的成败与否。使３．１．１用ＲＮＡｉｓｏ Ｒｅａｇｅｎｔ试剂盒（ＴＡＫＡＲＡ Ｃｏｄｅ：Ｄ３１２）提取的荞麦ＲＮＡ稀释２００倍 后，测得：ＯＤ２６０＝０．０９９ ＯＤ２８０＝０．０５０ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．９８荞麦ＲＮＡ浓度（ｎｇ／／比Ｌ）：ＯＤ２６０Ｘ ４０ ｎｇ／ｐＬ Ｘ稀释倍数＝８００ ｎｇ／／堪ＬＯＤ２６０／ＯＤ２８０为１．９８，介于１．８．２．０之间，表明提取的ＲＮＡ质量良好，基 本无蛋白等污染，可继续用于下一步实验。３．１．２ＲＮＡ的完整性 从甲醛变性电泳结果图（图２．２）可以看出典型的２８Ｓ、１８Ｓ、５Ｓ三种ＲＮＡ带型，带型清晰，无明显拖尾。这表明，提取的ＲＮＡ完整性良好，不存在明显 降解，可用于下一步实验。图２．２ＲＮＡ甲醛变性电泳图Ｆｉ９２．２：ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｐｉｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ总结，我们利用适合植物总ＲＮＡ提取的ＲＮＡｉｓｏ Ｒｅａｇｅｎｔ试剂盒（ＴＡＫＡＲＡ Ｃｏｄｅ：Ｄ３１２）得到了纯度高，完整性好的荞麦ＲＮＡ，为后续试验的成功进行打下 了坚实的基础。华东师范大学硕士学位论文第二章荞麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蚩白捧凶部分保守片段的克隆３．２简并引物的ＰＣＲ扩增结果 利用已知的植物Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白中两段保守性氨基酸序列所设计的 兼并引物，根据两段保守序列之间的距离，初步预计我们要扩增的目的片段为 ３００ｂｐ左右。ＰＣＲ结果如图２．３Ａ所示，得到的片段大小和预计的较吻合，约为 ３００ｂｐ，产物特异性较好，条带清晰。 ３．３酶切鉴定和ＰＣＲ鉴定 将简并ＰＣＲ得到的ＤＮＡ片段连接到ｐＧＥＭ．ＴｅａｓｙＶｅｃｔｏｒ中，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，根据菌落颜色初步筛选，挑去３个白色阳性菌落，扩大培养后，提取质 粒，经ＥｃｏＲＩ酶切及ＰＣＲ验证，结果如图２．３Ｂ．Ｃ所示：Ｍ１Ｍ１２３Ｍ１２３’一＇‘一ｊ女’■。２０００ ｂｐ１０００ｂｐ ７５０ｂｐ ５００ｂｐ ２５０ｂｐ １００ｂｐ聱、霉俐一鬻繁―＿０‘盂盗盗．ｉ蟹－遂龇●一簟 槲一ｔ锄 蝴铂％灞☆≈＿｜｜ ■｜｜ｉ＿ｌ一 ■｜｜＿一Ｉ～ ｏ｜｜ｏ儿ｌ－一ｍ＃■｜｜｜｜｜｜Ｉ｜｜ ＿｜｜ｎ￡‰■一黪罐。。《躲罐％獭谚锄彩缀、’’’？ 。 ｜｜ ｜｜＿｜｜ ｜｜ ｜｜ … ¨ 一｜｜ 一 ｜｜ ‘蕊 ！ 斗 拦 ｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜ Ｅ 肛ｙ、／’作．上华东师范大学硕｝：学位论文第二章养麦Ｎａ＋Ｍ＋逆向转运蛋白基冈部分保守片段的克隆３．４测序结果与序列分析 测序结果显示１号和２号克隆插入片段均为２８８ｂｐ，且序列完全一致，两 端均含有与兼并引物一致的上下游引物。利用ＤＮＡｃｌｕｂ软件将该ＤＮＡ片段翻译 为氨基酸序列，核苷酸及氨基酸序列如图２．４所示。在网站 ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴｐ中进行ＢＬＡＳＴｐ分析，结果如图２．５．Ａ．Ｂ所示。 ＢＬＡＳＴ显示该ＤＮＡ所编码的氨基酸序列与许多植物的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白具 有较高的同源性，其中与蓖麻（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白同源 性最高为７３％，其次是冰叶日中花（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ 向转运蛋白为７０％、玉米（Ｚｅａ（Ｋａｌｉｄｉｕｍｃｒｙｓｔａｌｉｎｕｍ）ＮａⅦ＋逆ｍａｙｓ）ＮａⅦ＋逆向转运蛋白为７０％、盐爪爪ｆｏｌｉａｔｕｍ）Ｎａ＊／Ｉ－Ｉ＋逆向转运蛋白为６３％。这些结果说明，通过简并ＰＣＲ成功扩增得到了荞麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因的部分编码序列，为下一步克隆荞麦Ｎａ＋Ｍ＋逆向转运蛋白基因的ｃＤＮＡ全序列提供了可能。 ＣＣ。１１ｃＣＣ冉ＴＴ鱼？１１Ｃ１’Ｉ℃自臼１Ｗ直！ＧＫｙｒｒｌｌ℃＾ＧＧＴＴ鱼冉ＧＡ直Ａ直冉鱼Ｃ直Ａ１１－ｒＴｌ℃鱼鱼Ｇ鱼鱼ｒ兀℃１ ６１ＴＣＣＡＣ鱼鱼ＴｒｒＨ＇１－ｒＧｒｒ啪鱼ＧＴｌＣＣＴｎ娜直Ｃ鱼直？ｒ直冉Ｔ直ＴＣＣ饿１陷ＣＣＴＴ直ＴＣＴＣＣＣＴＴＰＰ工 工ＩＦ Ｌ Ｌ 工 ＬＮ Ｆ Ｆ Ｌ ＬＡ Ｇ Ｋ Ｓ ＹＧ Ｖ Ｒ Ａ ＳＦ Ｌ Ｌ Ｔ ＬＱＶ Ｔ Ｖ Ｓ ＦＫ 工Ｋ 工Ｋ ＳＱＦ Ｃ ＬＦ ＬＫ 工Ｎ ＳＦ Ｌ Ｌ１２１ １８１ ２４１ＧＣ明ＤＧＣｌｌ册Ｃ１１ＧＣＴＧＴｒＣ自自自自Ｇ自Ｃ１．ｃ；（）Ｇ１１（；粥＾Ｃ直ＧＡＧＣｌｌ｜ＧＧ直？Ｉ’ＣＴＣＣＡＡＧＡＣＴＡｌ－】鹏Ｓ Ｔ Ａ Ｖ Ｄ Ｌ Ｇ Ｇ Ｄ Ｖ Ｆ Ｄ Ｌ ＶＧＣＣＧＴｌｌ｜ＧＧＴＧＣＣ鱼Ｔ直ＴＴＧＴＣＣＧＣＧＡＣＡＧＡＴｌ℃ＡＧｌ．１１Ｗ直ＣＡＴ了ＧＣＡＧＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＧＡ Ｄ Ｇ Ｔ Ａ Ｐ Ｖ Ｇ Ｃ Ｅ Ｔ ＧＧＦＬＴＥＬＱＤ ＬＹ ＳＱＶＶＱＧ直ＴＧＡＴＡＣＡＣＣ直ＴＴＧＣＴＴＴ凸ＣＡＧｌｌＣＴＧＧＴＡＴＴＴＧＧＴＧ＝真古ＧＧＴＧＴＴＧＴＡ图２．４荞麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因部分核苷酸序列及其编码的氨基酸序列Ｆｉｇ．２．４Ｐａｒｔｉａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｎａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｆ．ｔａｒｔａｒｉｃｕｍ Ｇａｅｒｔｎ图２．５Ｆｉｇ．２。５。ＡＡ荞麦ＮａⅦ＋逆向转运蛋白基因部分核苷酸序列ＢＬＡＳＴｐ分析结果ＢＬＡＳＴｐ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆｐａｒｔｉａｌ ｎｕｃｌｅｏｆｉｄｅｏｆＮ０斟ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｆｒｏｍ Ｆ．ｔａｒｔａｒｉｃｕｍ Ｇａｅｒｔｎ２６华东师范大学硕上学位论文第二章养麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因部分保守片段的克隆图２．５．Ｂ荞麦Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因部分氨基酸序列ＢＬＡＳＴｐ同源性比较Ｆｉｇ．２．５．Ｂ ＢＬＡＳＴｐ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐａｒｔｉａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｏｆ Ｎａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｆ．ｔａｒｔａｒｉｃｕｍ Ｇａｅｒｔｎ４．讨论植物总ＲＮＡ提取的质量与