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五大职业助力首测 9月28日荣耀开启!METHODS FOR DNA MUTAGENESIS AND DNA-CLONING
WIPO Patent Application WO/
The invention relates to methods and reagent kits for DNA manipulation, in particular for site-specific mutagenesis or for cloning.
Inventors:
Rudel, Thomas (Breddiner Weg 5, Berlin, 13591, DE)
Machuy, Nikolaus (Otto-Suhr-Allee 104, Berlin, 10585, DE)
Application Number:
Publication Date:
04/17/2003
Filing Date:
10/02/2002
Export Citation:
Max-planck-gesellschaft V, Zur F?rderung Der Wissenschaften E. (Hofgartenstrasse 8, München, 80539, DE)
Rudel, Thomas (Breddiner Weg 5, Berlin, 13591, DE)
Machuy, Nikolaus (Otto-Suhr-Allee 104, Berlin, 10585, DE)
International Classes:
C12N15/10; C12N15/66; (IPC1-7): C12N15/10
View Patent Images:
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Other References:
COONEY AUSTIN J:
"Use of T4 DNA polymerase to create cohesive termini in PCR products for subcloning and site-directed mutagenesis." BIOTECHNIQUES, Bd. 24, Nr. 1, Januar -01), Seiten 30-34, XP ISSN:
FISHER CONSTANCE L ET AL:
"Modification of a PCR-based site-directed mutagenesis method" BIOTECHNIQUES, EATON PUBLISHING, NATICK, US, Bd. 23, Nr. 4, 1997, Seiten 570-571,574, XP ISSN:
PARIKH ASIT ET AL:
"Random mutagenesis by whole-plasmid PCR amplification." BIOTECHNIQUES, Bd. 24, Nr. 3, M{rz -03), Seiten 428-431, XP ISSN:
KUIJPER J L ET AL:
"FUNCTIONAL CLONING VECTORS FOR USE IN DIRECTIONAL CDNA CLONING USING COHESIVE ENDS PRODUCED WITH T4 DNA POLYMERASE" GENE, ELSEVIER BIOMEDICAL PRESS. AMSTERDAM, NL, Bd. 112, Nr. 2, 1992, Seiten 147-155, XP ISSN:
DIETMAIER WOLFGANG ET AL:
"DISEC-TRISEC: di- and trinucleotide-sticky-end cloning of PCR-amplified DNA." NUCLEIC ACIDS RESEARCH, Bd. 21, Nr. 15, 1993, Seiten , XP ISSN:
See also references of EP
Attorney, Agent or Firm:
WEICKMANN & WEICKMANN (Postfach 860 820, München, 81635, DE)
Ansprüche
1. Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleins?uren, umfassend die
Schritte :
(a) Bereitstellen einer zu mutagenisierenden zirkul?re
doppeistr?ngigen Nukleins?ureMatrize,
(b) Bereitstellen von zwei Oligonukleotiden, die
(i) jeweils mit einem Strang der Nukleins?ureMatrize
hybridisieren,
(ii) im Bereich ihrer 5'Enden einen 24 Basenpaare langen
zueinander komplement?ren Abschnitt aufweisen, und
(iii) wobei zumindest eines der Oligonukleotide die mutierte
Zielsequenz enth?lt,
(c) Amplifizieren der zu mutagenisierenden Nukleins?ureMatrize
aus (a) unter Verwendung der Oligonukleotide mit der
mutierten Zielsequenz aus (b) als Primer, wobei ein mutiertes
doppelstr?ngiges Amplifikationsprodukt erhalten wird,
(d) Trimmen der Enden des Amplifikationsprodukts, wobei ein
getrimmtes Amplifikationsprodukt mit zueinander
komplement?ren 5'?berh?ngen erzeugt wird, und
(e) Ligieren des getrimmten Amplifikationsprodukts, wobei ein
mutiertes zirkul?res Nukleins?ureKonstrukt erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Amplifizieren in Schritt (c) eine PCR umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Trimmen in Schritt (d) eine Behandlung mit einem Enzym
mit 3'Exonukleaseund PolymeraseAktivit?t, insbesondere mit T4
DNAPolymerase in Gegenwart von StoppNukleotiden umfasst.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass vor dem Ligieren in Schritt (e) ein Entfernen der Nukleins?ure
Matrize erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass man eine methylierte Nukleins?ureMatrize und zu deren
Entfernung eine nur methylierte DNA spaltende
Restriktionsendonuklease verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Mutagenisierung ausgew?hlt wird aus :
(i) Bewirken von einer oder mehreren einzelnen
Nukleotidsubstitutionenv
(ii) Bewirken von einer oder mehreren einzelnen
Nukleotidinsertionen,
(iii) Bewirken von einer oder mehreren Inversionen einer Sequenz
von mindestens 2 Basen,
(iv) Bewirken von einer oder mehreren einzelnen
Nukleotiddeletionen und
(v) Bewirken jeder beliebigen Kombination der Mutagenisierungen
(i), (ii), (iii) und (iv).
7. Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des
Mutagenisierungsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
umfassend :
(a) Mittel zur Nukleins?ureAmplifizierung,
(b) Mitte ! zum Trimmen von doppelstr?ngigen Nukleins?uren zur
Erzeugung gestufter Enden, die komplement?r zueinander
(c) Mittel zum Ligieren von Nukleins?uren und
(d) gegebenenfalls Mittel zum selektiven Entfernen von
methylierter DNA.
8. Verfahren zur Klonierung von Nukleins?urefragmenten in einen
Vektor, umfassend die Schritte :
(a) Bereitstellen eines zirkul?re doppelstr?ngigen Nukleins?ure
(b) Spalten des Vektors aus (a) mit zwei unterschiedlichen
Restriktionsendonukleasen, wobei ein linearer Vektor mit zwei
unterschiedlichen gestuften Enden erhalten wird,
(c) teilweises Auffüllen der Enden des geschnittenen Vektors,
wobei ein aufgefüllter linearer Vektor mit unterschiedlichen
gestuften Enden erzeugt wird, die nicht komplement?r
zueinander und nicht komplement?r zu sich selbst sind,
(d) Bereitstellen eines in den Vektor aus (c) zu klonierenden
Nukleins?urefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften
Enden, die zu den Enden des aufgefüllten Vektors
komplement?r sind, die aber nicht komplement?r zueinander
und nicht zu sich selbst sind, und
(e) Ligieren des Nukleins?urefragments in den aufgefüllten
9. Verfahren nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass man in Schritt (b) Restriktionsenzyme verwendet, die 5'
?berh?nge ergeben.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9,
dadurch gekennzeichent,
dass das Auffüllen in Schritt (c) eine Behandlung mit einem Enzym
mit DNAPolymeraseAktivit?t, insbesondere mit KlenowEnzym, in
Gegenwart von maximal zwei Nukleotidtriphosphaten umfasst, um
eine nur partielle Auffüllung der gestuften Enden zu bewirken.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass man das in den Vektor zu klonierende Nukleins?urefragment
durch chemische oder enzymatische Synthese einzelstr?ngiger
Oligonukleotide und anschliessende Hybridisierung der
einzelst?ngigen Oligonukleotide erzeugt.
12. Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des
Klonierungsverfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 11,
umfassend :
(a) Mittel zur Spaltung einer Nukleins?ure durch zwei
unterschiedliche Restriktionsendonukleasen, die jeweils
unterschiedliche gestufte Enden erzeugen,
(b) Mittel zum teilweisen Auffüllen von gestuften Enden bei
doppelstr?ngigen Nukleins?uren zur Erzeugung gestufter
Enden, die nicht komplement?r zueinander und nicht
komplement?r zu sich selbst sind,
(c) Mittel zum Hybridisieren von DNAOligonukleotiden und
(d) Mittel zum Ligieren von Nukleins?uren.
13. Verfahren zur Klonierung von Nukleins?urefragmenten in einen
Vektor, umfassend die Schritte :
(a) Bereitstellen eines zirkul?ren doppelstr?ngigen Nukleins?ure
(b) Bereitstellen von zwei Oligonukleotiden, die
(i) jeweils mit einem Stang des Nukleins?urevektors
hybridisieren und
(ii) im Bereich ihrer 5'Enden einen 24 Basenpaare langen
zueinander komplement?ren Abschnitt aufweisen,
(c) Amplifizieren des Nukleins?urevektors aus (a) unter
Verwendung der Oligonukleotide. aus (b) als Primer, wobei ein
doppelstr?ngiges Amplifikationsprodukt mit gestuften Enden
erhalten wird,
(d) Trimmen der Enden des Amplifikationsprodukts, wobei ein
getrimmter linearer Vektor mit unterschiedlichen gestuften
Enden erzeugt wird, die nicht komplement?r zueinander und
nicht komplement?r zu sich selbst sind,
(e) Bereitstellen eines in den Vektor zu klonierenden
Nukleins?urefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften
Enden, die zu den Enden des getrimmten Vektors
komplement?r sind, die aber nicht komplement?r zueinander
und nicht komplement?r zu sich selbst sind, und
(f) Ligieren des Nukleins?urefragments in den getrimmten Vektor.
14. Verfahren nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Amplifizieren in Schritt (c) eine PCR umfasst.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Trimmen in Schritt (d) eine Behandlung mit einem Enzym
mit 3'ExonukleaseAktivit?t, insbesondere mit T4DNAPolymerase
in Gegenwart von StoppNukleotiden umfasst.
16. Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des
Klonierungsverfahrens nach einem der Ansprüche 13 bis 15,
umfassend :
(a) Mittel zur Nukleins?ureAmpjifizierung,
(b) Mittel zum Trimmen von doppelstr?ngigen Nukleins?uren zur
Erzeugung von gestuften Enden die nicht komplement?r
zueinander und nicht komplement?r zu sich selbst sind,
(c) Mittel zum Hybridisieren von DNAOligonukleotiden und
(d) Mittel zum Ligieren von Nukleins?uren.
17. Verfahren zur Klonierung von Nukleins?urefragmenten in einen
Vektor, umfassend die Schritte :
(a) Bereitstellen eines zirkul?re doppelstr?ngigen
Nukleins?urevektors mit einer Restriktionsschnittstelle für ein
Restriktionsenzym, bei der die Erkennungssequenz neben der
eigentlichen Schnittstelle liegt,
(b) Spalten des Vektors mit dem Restriktionsenzym,
(c) teilweises Auffüllen oder Trimmen der Enden des
geschnittenen Vektors, wobei ein linearer Vektor mit
unterschiedlichen gestuften Enden erzeugt wird, die nicht
komplement?r zueinander und zu sich selbst sind,
(d) Bereitstellen eines in den Vektor aus (c) zu klonierenden
Nukleins?urefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften
Enden, die zu den Enden des aufgefüllten Vektors
komplement?r sind, die aber nicht komplement?r zueinander
und nicht zu sich selbst sind,
(e) Ligieren des Nukleins?urefragments in den aufgefüllten
18. Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des
Klonierungsverfahrens nach Anspruch 17, umfassend :
(a) Mittel zur Spaltung einer Nukleins?ure durch eine
Restriktionsendonuklease mit einer Restriktionsschnittstelle,
bei der die Erkennungssequenz neben der eigentlichen
Schnittstelle liegt,
(b) Mittel zum teilweisen Auffüllen von gestuften Enden bei
doppelstr?ngigen Nukleins?uren zur Erzeugung gestufter
Enden, die nicht komplement?r zueineinander und nicht
komplement?r zu sich selbst sind,
(c) Mittel zum Trimmen von doppelstr?ngigen Nukleins?uren zur
Erzeugung von gestuften Enden, die nicht komplement?r
zueinander und nicht komplement?r zu sich selbst sind,
(d) Mittel zum Hybridisieren von DNAOligonukleotiden und
(e) Mittel zum Ligieren von Nukleins?uren.
Description:
Methoden zur DNA-Manipulation
Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Reagenzienkits zur DNA- Manipulation, insbesondere zur ortsspezifischen Mutagenese oder zur Klonierung. Trotz der erheblichen Fortschritte, die in den letzten Jahren bei der Manipulation von Nukleins?uren, beispielsweise bei der Mutagenisierung oder Klonierung von DNA-Fragmenten, gemacht wurden, besteht immer noch ein erhebliches Bedürfnis, derartige Verfahren zu verbessern. Probleme bei bekannten Mutagenisierungs-und Klonierungsverfahren bestehen oftmals hinsichtlich deren Effizienz. Durch die vorliegende Anmeldung werden neue Mutagenisierungs-und Kionierungsverfahren bereitgestellt, mit denen diese Probleme zumindest teilweise ausger?umt werden k?nnen : Für die Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen, wie z. B. der Kinasefunktion in Abh?ngigkeit bestimmter Aminos?uren oder der Promoterfunktion von DNA-Abschnitten in Abh?ngigkeit ihrer Sequenz, ist es h?ufig notwendig, eine gezielte Mutagenese von Nukleins?uren durchzuführen. Hutchison et al. (Hutchison et a/., 1978) beschreiben eine Site-directed- Mutagenese, bei der einzelstr?ngige DNA mit einem Oligonukleotid hybridisiert wird, das bis auf die zu mutagenisierende Base komplement?r zur Matrizen-DNA ist. Nach der Verl?ngerung des Oligonukleotids, also der Erzeugung eines Doppelstranges mit einer DNA-Polymerase, dem Schliessen des synthetisierten Stranges mit einer Ligase und der Transformation in E.
coli, sollten eigentlich 50 % der Klone mutierte DNA enthalten. In der Praxis ist diese Rate aber jedoch deutlich geringer (Kramer et a/., 1984). Deshalb verwenden die derzeit kommerziell erh?ltlichen Mutagenesesysteme Selektionsmarker für die mutierte DNA. Einige davon sollen hier vorgestellt werden. Das pALTER System von Promega verwendet einen Vektor der in seinem Ausgangszustand ein inaktives Ampicillin-und ein aktives Tetracyclinresistenzgen enth?lt. Die Mutagenese erfolgt ?hnlich der oben beschriebenen Methode, mit dem Unterschied, dass zusammen mit dem Mutagenese-Oligonukleotid noch zwei weitere Primer hybridisiert werden, die das AmpR-Gen aktivieren und das TetR-Gen inaktivieren (Kleina et al., 1990 ; Normanly et al., 1990). Nach der Transformation in E. coli werden die Klone mit der mutierten DNA mit Ampicillin selektioniert. Nachteile dieser Methode sind zum einen, dass die zu mutierende DNA in ein spezielles Plasmid kloniert werden muss und zum anderen, dass DNA-Reparatur-defiziente E. coli St?mme verwendet werden müssen. Das Transformer"Site-Directed Mutagenesis Kit von Clontech verwendet zur Selektion ein zweites zu hybridisierendes Oligonukleotid, mit dem eine im Ausgangskonstrukt einmalige Restriktionsschnittstelle zerst?rt wird (Deng and Nickoloff, 1992 ; Zhu, 1996). Nach Hybridisierung und Oligonukleotidverl?ngerung werden durch Verdau mit diesem
Restriktionsenzym nur die nichtmutierten Plasmide geschnitten, die somit nicht mehr transformierbar sind. Auch diese Methode greift auf
reparaturdefiziente St?mme zurück. Ausserdem sind zwei nacheinander folgende Transformationen notwendig, was die Dauer der Mutagenese
wesentlich verl?ngert.
Bei der Mutagenese mit dem Quickchange"Site-Directed Mutagenesis Kit
von Stratagene werden zwei komplement?re Mutagenese-Oligonukleotide
an beide Str?nge hybridisiert und die mutierte DNA mit Hilfe der Pfu-Turbo
DNA-Polymerase in 12 bis 18 Temperaturzyklen amplifiziert. Nach dem Verdau der Matrizen-DNA mit Dpnl wird die doppelstr?ngige DNA in E. coli transformiert. Diese schliessen dann die noch vorhandenen Einzelstranglücken. Bei einer weiteren Mutagenesemethode wird der zu mutierende DNA- Abschnitt in zwei getrennten PCRs so amplifiziert, dass die Produkte an der Mutationsstelle ca. 20 Basen überlappen und bereits die mutierte Sequenz enthalten (Lottspeich, F. and Zorbas, 1998). Die beiden Produkte werden gemischt und in einer dritten PCR mit Oligonukleotiden, die das Klonieren in den gewünschten Vektor erlauben, wird die gesamte DNA amplifiziert. Der Nachteil dieser Methode ist, dass drei PCRs notwendig sind. Mit ebenfalls zwei PCRs startet eine weitere Mutagenesemethode (Cooney, 1998). Auch bei ihr überlappen die beiden Produkte an der Mutationsstelle, allerdings nicht 20 Basen, sondern nur so viele, dass durch eine T4-DNA- Polymerase-Trimmreaktion komplement?re 5'-?berh?nge entstehen. Die ?usseren Enden der PCR-Produkte werden mit Restriktionsenzymen behandelt. Zur Ligation werden beide Produkte und der Vektor gemischt. Sowohl die Notwendigkeit, auf Restriktionsschnittstellen innerhalb der Fragmente Rücksicht zu nehmen, als auch. die Ligation von drei DNA- Fragmenten, sind Nachteile dieser Methode. Ein erster Aspekt der vorliegenden Anmeldung ist Gegenstand des Anspruchs 1 und betrifft ein Verfahren zur Mutagenisierung von
Nukleins?uren, insbesondere von doppelstr?ngigen DNA-Fragmenten, umfassend die Schritte :
(a) Bereitstellen einer zu mutagenisierenden zirkul?ren doppelstr?ngigen
Nukleins?ure-Matrize, z. B. eines Plasmidvektors,
(b) Bereitstellen von zwei Oligonukleotiden, die
(i) jeweils mit einem Strang der Nukleins?ure-Matrize
hybridisieren und
(ii) im Bereich ihrer 5'-Enden einen kurzen, vorzugsweise 2-4
Basenpaare langen, zueinander komplement?ren Abschnitt
aufweisen,
(iii) wobei zumindest eines der Oligonukleotide die mutierte
Zielsequenz enth?lt, die vorzugsweise im Bereich des 5'-
Endes des Oligonukleotids liegt, (c) Amplifizieren der zu mutagenisierenden Nukleins?ure-Matrize aus (a)
unter Verwendung der Oligonukleotide mit der mutierten Zielsequenz
aus (b) als Primer, wobei ein mutiertes doppelstr?ngiges
Amplifikationsprodukt erhalten wird, (d) Trimmen der Enden des Amplifikationsprodukts, wobei ein
getrimmtes Amplifikationsprodukt mit zueinander komplement?ren
5'-?berh?ngen erzeugt wird, und (e) Ligieren des getrimmten Amplifikationsprodukts, wobei ein mutiertes
zirkul?re Nukleins?ure-Konstrukt erhalten wird. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 6. Mit Hilfe des Verfahrens wird eine neue, sehr einfache, günstige und effiziente Mutagenesemethode bereitgestellt (Abbildung 1). Hierzu werden Oligonukleotide hergestellt, die z. B. an den 5'-Enden die mutierten DNA- Sequenzen enthalten und die vorzugsweise eine 2-3 Basenpaare lange ?berlappung (hier AA bzw. TT) aufweisen. Die L?nge der Oligonukleotide wird so gew?hlt, dass sie unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit ausreichender Effizienz an die Matrize binden k?nnen. ?blicherweise betr?gt die L?nge der Oligonukleotide z. B. 15-50 Basen. Durch PCR- Amplifikation des gesamten Konstrukts mit den Mutagenese- Oligonukleotiden und einem anschliessenden Trimmen der Enden, z. B. durch die T4-DNA-Polymerase mit entsprechendem Stopp-Nukleotid (im Beispiel
dGTP), entsteht ein Produkt mit zueinander komplement?ren 5'- ?berh?ngen. Diese k?nnen sehr effizient ligiert werden. Durch die Entfernung der Matrizen-DNA, z. B. mittels Dpnl-Verdau, wobei nur methylierte DNA geschnitten wird, kann die Mutageneserate zus?tztich gesteigert werden. Als Negativkontrolle kann ein Ligationsansatz ohne Ligase dienen. Nach der Transformation in E. coli l?sst sich aus dem Verh?ltnis der Anzahl der Klone die Mutageneseeffizienz absch?tzen. Im Idealfall kann der Ansatz ohne Ligase keinen Transformanten liefern. Die ?berprüfung der Mutation kann nach Transformation des mutagenisierten Konstrukts in eine geeignete Wirtzelle, z. B. durch Sequenzierung, oder/und PCR Kontrolle erfolgen, bei der ein Oligonukleotid verwendet wird, das nur mit mutierter DNA zu einem Produkt führt. Bei den ersten zehn mit dieser Methode durchgeführten Mutagenesen und je zwei überprüften Klonen lag die Mutationsrate bei 95 %. Durch das erfindungsgem?sse Mutagenese-Verfahren werden insbesondere DNA-Manipulationen durchgeführt, ausgew?hlt aus der Gruppe : Punktmutationen, wobei ein Austausch bzw. eine Substitution von einem oder mehreren einzelnen N Insertionen, wobei ein oder mehrere einzelne Nukleotide in die Sequenz zus?tzlich eingefü Inversionen, wobei eine oder mehrere Sequenzen von mindestens zwei Basen, z. B. zwei, drei oder vier Basen, Deletionen, wobei eine oder mehrere einzelne Ba und beliebige Kombinationen der genannten Mutagenesem?glichkeiten, z. B. zwei-oder mehrfache Kombinationen von Punktmutation, Insertion, Inversion oder/und Deletion in einem einzigen Schritt oder Einfügen mehrerer Punktmutationen mit einem maximalen Abstand, entsprechend der L?nge der verwendeten Oligonukleotide, von z. B. 50 Basen in einem einzigen Schritt. Der Vorteil des erfindungsgem?ssen Verfahrens gegenüber anderen Mutagenesemethoden ist die extrem hohe Mutageneserate von 95 %. Die
Erzeugung von gestuften Enden durch das Trimmen, z. B. mittels einer T4- DNA-Polymerasereaktion, bewirkt, dass nur akkurat getrimmte Produkte religieren k?nnen. Im Gegensatz dazu k?nnen bei der Religation von ungetrimmten Amplifikationsprodukten eher Leserahmenverschiebungen durch eine zus?tzliche Base, z. B. ein Adenin, auftreten. Im Gegensatz zu vielen kommerziell erh?ltlichen Systemen ist man nicht auf das Vorhandensein von singul?ren Restriktionsschnittstellen sowie bestimmten Antibiotikaresistenzen angewiesen. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens liegt in der Geschwindigkeit. Am ersten Tag k?nnen PCR, T4-DNA- PoXymerasereaktion, Ligation, Dpnl-Verdau und Transformation durchgeführt werden. Am zweiten Tag erfolgt die Analyse der Kolonien durch PCR und Kulturen zur Plasmidpr?paration werden angesetzt. Bereits am dritten Tag kann die mutierte DNA isoliert und in Versuchen verwendet werden. Weiterhin betrifft dieser erste Aspekt der Erfindung gem?ss Anspruch 7 auch einen Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des zuvor beschriebenen Mutagenese-Verfahrens, umfassend : (a) Mittel zur Nukleins?ure-Amplifizierung, (b) Mittel zum Trimmen von doppelstr?ngigen Nukleins?uren zur
Erzeugung von gestuften Enden, die komplement?r zueinander sind, (c) Mittel zum Ligieren von Nukteins?uren und (d) gegebenenfalls Mittel. zum selektiven Entfernen von methylierter
DNA. Die Komponenten des Reagenzienkits k?nnen gemeinsam bezogen oder aus verschiedenen Quellen zusammengestellt werden. Weiterhin kann der Kit übliche Puffer-und Hilfsreagenzien zur Durchführung der Reaktionen sowie eine schriftliche Verfahrensbeschreibung enthalten. Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft ein neues Klonierungsverfahren, mit dem insbesondere die mit der Ausbildung von Multimeren verbundenen Schwierigkeiten bei der Klonierung doppelstr?ngiger
Nukleins?urefragmente, z. B. Oligonukleotide mit einer L?nge von vorzugweise bis zu 200 bp, besonders bevorzugt von 15-100 bp, oder auch l?ngerer PCR-Fragmente, ausger?umt werden k?nnen. Für die Klonierung kürzerer DNA-Fragmente werden üblicherweise zwei komplement?re Oligonukleotide verwendet, die nach Hybridisierung komplement?re ?berh?nge zu einem mit entsprechenden Restriktionsenzymen ge?ffneten Vektor aufweisen und in diesen ligiert werden k?nnen. Dabei tritt jedoch h?ufig das Problem auf, dass die doppelstr?ngigen Oligonukleotide Multimere bilden und dadurch entweder gar nicht kloniert werden k?nnen-oder als oMultimere in den-Vektor integrieren. Dieses Problem kann durch das erfindungsgem?sse Verfahren umgangen werden. Für die Generierung eines ge?ffneten Vektors zum Einfügen eines doppelstr?ngigen Oligonukleotids oder eines l?ngeren DNA-Fragments stehen zwei Ausführungsformen zur Verfügung : Bei der Variante 1 wird der Vektor mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen ge?ffnet und mit Hilfe der Klenow-Polymerase werden ein oder zwei Nukleotide an den DNA-Enden aufgefüllt. Dadurch entstehen unterschiedliche gestufte Enden, die nicht kornplement?r zueinander und nicht komplement?r zu sich selbst sind (Abbildung 2). Die Enden der Oligonukleotide werden so ausgew?hlt, dass sie komplement?r zu den aufgefüllten Vektorenden sind. Zur Generierung des Vektors nach der Variante 2 wird der Teil, in den das zu klonierende Fragment inseriert werden soll, z. B. mittels PCR, amplifiziert. Dann werden durch Trimmen, z. B. mit T4-DNA-Polymerase, unter Verwendung von bestimmten Stopp-Nukleotiden gestufte Enden erzeugt, die nicht komplement?r zu sich selbst und nicht komplement?r zueinander sind. Um dies zu erreichen, müssen beim Design der Oligonukleotide
geeignete Basen an den 5'-Enden vorgesehen werden. Die Variante 2 erlaubt das Einfügen von doppelstr?ngigen Oligonukleotiden an jede beliebige Stelle in einem Vektor, z. B. einem Plasmid. Zum Erzeugen doppelstr?ngiger Oligonukleotide werden jeweils ?quivalente Mengen der einzelstr?ngigen Oligonukleotide unter geeigneten Bedingungen miteinander hybridisiert, z. B. durch Vermischen in Anwesenheit von MgClz, Erhitzen und langsames Abkühlen von 95 °C auf Raumtemperatur. Die Enden der hybridisierten Oligonukleotide-weisen vorzugsweise 5'- ?berh?nge auf, die komplement?r zu den 5'-?berh?ngen der pr?parierten Vektoren sind. Da die 5'-?berh?nge der so entstandenen doppelstr?ngigen DNA nicht komplement?r zueinander und zu sich selbst sind, k?nnen keine Multimere gebildet werden. Dies führt zu einer enormen Effizienzsteigerung der Klonierung von Oligonukleotiden. Der Einbau der Oligonukleotide kann durch PCR oder/und Restriktionsverdau sowie Sequenzierung überprüft werden. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist Gegenstand des Anspruchs 8 und betrifft ein Verfahren zur Klonierung von Nukleins?urefragmenten in einen Vektor gem?ss Variante 1 umfassend die Schritte : (a) Bereitstellen eines zirkul?re doppelstr?ngigen Nukleins?ure-Vektors, (b) Spalten des Vektors aus (a) mit-zwei unterschiedlichen
Restriktionsendonukleasen, wobei ein linearer Vektor mit zwei
unterschiedlichen gestuften Enden erhalten wird, (c) teilweises Auffüllen der Enden des geschnittenen Vektors, wobei ein
aufgefüllter linearer Vektor mit unterschiedlichen gestuften Enden
erzeugt wird, die nicht komplement?r zueinander und nicht
komplement?r zu sich selbst sind, (d) Bereitstellen eines in den Vektor aus (c) zu klonierenden
Nukleins?urefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften Enden,
die zu den Enden des aufgefüllten Vektors komplement?r sind, die
aber nicht komplement?r zueinander und nicht zu sich selbst sind,
und (e) Ligieren des Nukleins?urefragments in den aufgefüllten Vektor. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens. sind Gegenstand der Ansprüche 9 bis 11. Weiterhin betrifft diese Ausführungsform gem?ss Anspruch 12 ein Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des Klonierungsverfahrens, umfassend : (a) Mittel zur Spaltung einer Nukleins?ure durch zwei unterschiedliche-
Restriktionsendonukleasen, die jeweils unterschiedliche gestufte
Enden erzeugen, Mittel zum teilweisen Auffüllen von gestuften Enden bei
doppelstr?ngigen Nukleins?uren, z. B. ein geeignetes Enzym und 2
Nukleosidtriphosphate, wobei die Enden nicht komplement?r
zueinander und nicht komplement?r zu sich selbst sind, und (c) Mittel zum Ligieren von Nukleins?uren. Weiterhin kann der Reagenzienkit übliche Puffer-und Hilfsreagenzien sowie eine schriftliche Verfahrensbeschreibung enthalten. Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist Gegenstand des Anspruchs 13 und betrifft ein Verfahren zur Klonierung von Nukleins?ure-Fragmenten in einen Vektor gem?ss Variante 2, umfassend die Schritte : (a) Bereitstellen eines zirkul?ren doppelstr?ngigen Nukleins?ure-Vektors, (b) Bereitstellen von zwei Oligonukleotiden, die
(i) jeweils mit einem Stang des Nukleins?urevektors hybridisieren
(ii) im Bereich ihrer 5'-Enden einen vorzugsweise kurzen, z. B. 2-4
Basenpaare langen, zu den Enden der einzufügenden DNA
homologen Abschnitt aufweisen, (c) Amplifizieren des Nukleins?ure-Vektors aus (a) unter Verwendung
der Oligonukleotide aus (b) als Primer, wobei ein doppelstr?ngiges
Amplifikationsprodukt erhalten wird, (d) Trimmen der Enden des Amplifikationsprodukts, wobei ein
getrimmter linearer Vektor mit unterschiedlichen gestuften Enden
erzeugt wird, die nicht komplement?r zueinander und nicht
komplement?r zu sich selbst sind, (e) Bereitstellen eines in den Vektor zu klonierenden
Nukleins?urefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften Enden,
die zu den Enden des getrimmten Vektors komplement?r sind, die
aber nicht komplement?r zueinander und nicht zu sich selbst sind,
und (f) Ligieren des Nukleins?urefragments in den getrimmten Vektor. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 14 bis 15. Weiterhin betrifft diese Ausführungsform gem?ss Anspruch 16 einen Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des zuvor genannten Klonierungsverfahrens, umfassend (a) Mittel zur Nukleins?ure-Amplifizierung, (b) Mittel zum Trimmen von doppelstr?ngigen Nukleins?uren zur
Erzeugung von gestuften Enden, die nicht komplement?r zueinander
und nicht komplement?r zu sich selbst sind, und (c) Mittel zum Ligieren von Nukleins?uren. Der Reagenzienkit kann weiterhin übliche Puffer-und Hilfsreagenzien sowie eine Verfahrensbeschreibung enthalten.
Eine weitere neue M?glichkeit im Zusammenhang mit nach Variante 2 erzeugten offenen Vektoren oder Plasmidteilen besteht darin, mit T4 DNA- Polymerase getrimmte Amplifikationsprodukte, z. B. PCR-Produkte, einzufügen. Ausserdem ist das Klonieren mit dieser Methode unabh?ngig von Restriktionsschnittstellen. Die gestuften Endender einzufügenden PCR- Produkte müssen komplement?r zu den Vektorenden sein. Dadurch wird es m?glich, sehr einfach bestimmte DNA-Abschnitte punktgenau und ohne zus?tzliche, mitunter st?rende Basen einzufügen. Dieses ist besonders hilfreich, wenn die Fusionsproteine sich z. B. aus einem Signalpeptid und dem zu untersuchenden Protein zusammensetzen. Ferner k?nnen so funktionelle Dom?nen zwischen verschiedenen Proteinen nach Belieben ausgetauscht werden. Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist Gegenstand des Anspruchs 17 und betrifft ein Verfahren zur Klonierung von Nukleins?urefragmenten in einen Vektor, umfassend die Schritte : (a) Bereitstellen eines zirkul?ren doppelstr?ngigen Nukleins?urevektors
mit einer Restriktionsschnittstelle für ein Restriktionsenzym, bei der
die Erkennungssequenz neben der eigentlichen Schnittstelle liegt, (b) Spalten des Vektors mit dem Restriktionsenzym, (c) teilweises Auffüllen oder Trimmen der Enden des geschnittenen
Vektors, wobei ein linearer Vektor mits unterschiedlich gestuften
Enden erzeugt wird, die nicht komplement?r zueinander und zu sich
selbst sind, (d) Bereitstellen eines in den Vektor aus (c) zu klonierenden
Nukleins?urefragments mit zwei unterschiedlichen gestuften Enden,
die zu den Enden des aufgefüllten Vektors komplement?r sind, die
aber nicht komplement?r zueinander und nicht zu sich selbst sind,
und (e) Ligieren des Nukleins?urefragments in den aufgefüllten Vektor.
Weiterhin betrifft diese Ausführungsform gem?ss Anspruch 18 einen Reagenzienkit, insbesondere zur Durchführung des zuvor genannten Klonierungsverfahrens, umfassend : (a) Mittel zur Spaltung einer Nukleins?ure durch eine
Restriktionsendonuklease mit einer Restri bei der
die Erkennungssequenz neben der eigentlichen Schnittstelle liegt, (b) Mittel zum teilweisen Auffüllen von gestuften Enden bei
doppelstr?ngigen Nukleins?uren zur Erzeugung gestufter Enden, die
nicht komplement?r zueineinander und nicht komplement?r zu sich
selbst sind, (c) Mittel zum Trimmen von doppelstr?ngigen Nukleins?uren zur
Erzeugung von gestuften Enden, die nicht komplement?r zueinander
und nicht komplement?r zu sich selbst sind, und (d) Mittel zum Ligieren von Nukleins?uren. Der Reagenzienkit kann weiterhin übliche Puffer-und Hilfsreagenzien sowie eine Verfahrensbeschreibung enthalten. Für die Definition der für die Mutagenisierung bzw. Klonierung zu verwendenden Oligonukleotide gelten vorzugsweise folgende Regeln bzw. Algorithmen : ?ber die Wahl geeigneter Sequenzen am-gestuften Ende k?nnen die
Eigenschaften"nicht komplement?r zu sich selbst"und"nicht
komplement?r zueinander"erzeugt werden.
"Nicht komplement?r"zueinander bedeutet, dass zwei gestufte
Enden nicht miteinander ligiert werden k?nnen. "Nicht komplement?r
zu sich selbst"bedeutet, dass die Sequenz innerhalb eines
?berhangs in deren gestuftes Ende nicht komplement?r ist. Beim Trimmen durch ein Enzym mit Exonuklease/Polymerase-
Aktivit?t in Gegenwart von Stopp-Nukleotiden, z. B. T4-DNA-
Polymerase, dürfen nicht alle 4 Basen in den überlappenden Enden
enthalten sein, da sonst ein Stoppen der Reaktion durch Zugabe
eines Stopp-Nukleotids nicht mehr m?glich ist. Die bevorzugte Annealing-Temperatur der Oligonukleotide wird
vorgegeben und nach der 4+2-Regel (2 °C für jedes Adenin-und
T 4 °C für jedes Guanin-und Cytosinnukleotid)
anhand der Basensequenz des Oligonukleotids ermittelt. Dabei soll
der Unterschied der Annealing-Temperatur der beiden
Oligonukleotide vorzugsweise maximal 2 °C betragen. Am 3'-Ende der Oligonukleotide soll vorzugsweise die Base Thymidin
vermieden werden. Für die Definition von Oligonukleotiden zur Mutagenese werden folgende Regeln bzw. Algorithmen festgelegt : Am 5'-Ende der Oligonukleotide sollen nach dem Trimmen, z. B.
durch T4-DNA-Polymerasereaktion, ?berh?nge entstehen, die
komplement?r zueinander, aber nicht zu sich selbst sind. Die 5'-
Enden der Amplifikationsprodukte sollen phosphoryliert sein. Vorgegeben wird entweder die gewünschte Mutation, z. B. ein
Aminos?ureaustausch, und die dabei zu ver?ndernden Basen werden
durch den Algorithmus ermittelt, oder nur die gewünschte Mutation,
z. B. ein Basenaustausch, wird vorgegeben. In beiden F?llen k?nnen
zus?tzliche stille Mutationen eingefügt werden. Für das Einfügen von Oligonukleotiden an bestimmte Stellen in einem Vektor, z. B. einem Plasmid, wird zwischen den beiden M?glichkeiten der Vektorvorbereitung unterschieden. Für die Variante 1, das Vorbereiten des Vektors durch Restriktionsverdau und anschliessende Auffüllreaktion, z. B. durch das Klenow-Enzym, gilt folgender Algorithmus : Vorgegeben werden m?gliche Restriktionsschnittstellen. Das
Programm soll eine Schnittstellenkombination mit Nukleotidvorgabe
für die Klenow-Reaktion ermitteln. Ferner sollen die 5'-?berh?nge
der einzufügenden doppelstr?ngigen Oligonukleotide, die
komplement?r zu den Vektorenden sein müssen, aber nicht
komplement?r zu sich selbst sein dürfen, ermittelt werden. Wird der Vektor nach Variante 2 durch PCR amplifiziert, gelten folgende Regeln : Vorgegeben wird die genaue Insertionsstelle. Diese kann auch eine
Deletion umfassen. Die Enden der PCR-Produkte dürfen nach T4-
DNA-Polymerasereaktion weder zueinander noch zu sich selbst
komplement?r sein. Die für die PCR verwendeten Oligonukleotide
müssen an ihren 5'-Enden phosphoryliert. sein. -Falls an der vorgegebenen Insertionsstelle die Generierung von
gestuften Enden mit den Eigenschaften"nicht komplement?r zu sich
selbst"und"nicht komplement?r zueinander"nicht m?glich ist, so
soll von der vorgegebenen Insertionsstelle ausgehend eine Sequenz
gesucht werden, die die Erzeugung der gewünschten Eigenschaften
sowohl im Vektor als auch an den Enden der einzufügenden
Oligonukleotide erlaubt. Die Enden der Oligonukleotide für die PCR
oder das Einfügen werden entsprechend verl?ngert oder verkürzt.
Ferner ist es m?glich, die für die Klonierung notwendigen Basen über
das Oligonukleotid einzuführen. Die L?nge der einzufügenden Oligonukleotide ist beliebig und einzig
durch die gegebenen M?glichkeiten der Oligonukleotidsynthese
beschr?nkt. Die bei der Dimerisierung entstehenden gestuften Enden der
einzufügenden doppelstr?ngigen Oligonukleotide müssen
komplement?r zu den Vektorenden sein. Dahingegen dürfen sie nicht
komplement?r zu sich selbst sein. Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch nachfolgende Abbildungen und Beispiele erl?utert werden. Es zeigen :
Abbildung 1 ein Beispiel für die Durchführung des erfindungsgem?ssen Mutageneseverfahrens. Abbildung 1A zeigt die durchzuführende Mutagenese (Ersetzen von G/C durch A/T, verbunden mit einem Aminos?ureaustausch Asp nach Asn). In Abbildung 1B ist die schematische Durchführung des Verfahrens gezeigt. Das zu mutagenisierende Ausgangskonstrukt wird, z. B. durch-PCR, amplifiziert. Die 5'-Enden der dafür als Primer verwendeten Oligonukleotide enthalten die mutierte Sequenz. Durch eine T4-DNA-Polymerase-Trimmreaktion werden gestufte komplement?re Enden erzeugt, die miteinander ligiert werden k?nnen. Nach Transformation in einen geeigneten Wirtsorganismus, z. B. E. co/i, k?nnen die positiven Klone durch geeignete Massnahmen, wie PCR oder/und Sequenzierung, identifiziert werden. Abbildung 2 zeigt die Klonierung von Oligonukleotiden nach Variante 1 des erfindungsgem?ssen Klonierungsverfahrens. Der zirkul?re Vektor wird hierzu mit 2 Restriktionsenzymen, z. B. Nhel und Sam1, die nicht miteinander komplement?re gestufte Enden ergeben, geschnitten. Durch Behandlung mit Klenow-Erizymen werden die gestuften Enden teilweise aufgefüllt. Die Sequenz der in den Vektor zu klonierenden Oligonukleotide bzw. Amplifikationsprodukte ist so definiert, dass sie als doppelstr?ngiges Fragment zum Vektor komplement?re 5'-?berh?nge besitzen und mit dem Vektor ligiert werden k?nnen. Beispiel 1 : Mutagenese 1.1 Mutagenese-PCR Die Bedingungen für die PCR wurden gem?ss nachfolgender Tabelle gew?hlt. Da die Amplifikation eines gesamten Plasmids zu langen PCR- Produkten führt, wurden die Reaktionsans?tze durch 5 Vol.-% Glycerol und 2-5 Vol.-% DMSO erg?nzt. Ausserdem wurde sowohl die Matrizen-DNA- Menge (& 10 ng) als auch die PCR-Zyklenzahl ( : 5 25) m?glichst klein gehalten.
Mutagenese PCR-Ansatz
Substanz Konzentration/Menge Matrizen-DNA & 1 Ong Puffer 1-x dNTPs je 0, 3,NM Oligonukleotide je 0,3-0, 6, uM Glycerol 5 % (Karasavvas and Zakeri, 1999) DMSO 2-5 % (Karasavvas and Zakeri, 1999) MgCI2 2,25 mM ExpandTM 1, 75 U H20 ad. 50-100 ul
Zyklische Amplifikation : Temperatur Dauer Zyklenzahl 94 °C 2 min 1 94 C 30sec 50-68 °C 1 min # 25 68 °C 1 min/kb 1 68 °C 10 min Variationen der MgCl2-Konzentration oder/und die Verwendung von HotStart-Polymerasen sind weitere Alternativen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Erzeugung und Verwendung sehr reiner PCR-Produkte eine Voraussetzung für die erfolgreiche Mutagenese war. Die anschliessende Aufreinigung und T4-Reaktion erfolgte nach Beispiel 2.2. 2.
1.2 Ligation und Dpnl Verdau Für die Ligation in einem Endvolumen von 10, ul wurden zwischen 100 und 200 ng DNA und 0, 5p1 Ligase (Invitrogen) verwendet. Als Negativkontrolle diente ein Ligationsansatz ohne Ligase. Nach Inkubation über Nacht bei 4 C wurde der gesamte Ligationsansatz mit 2, u1 Puffer A (Roche), 0, 5, ul Dpnl und 7, 5, ul H20 versetzt und die Matrizen-DNA wurde für 30 min bei 37 °C verdaut. Die Transformation in E. coli erfolgte unter Standardbedingungen. Sofern die Anzahl der Transformanten des Ansatzes mit Ligase zu dem Ansatz ohne Ligase über 5 : 1 lag, wurde von 2 Klonen DNA isoliert und die Mutagenese durch Sequenzierung verifiziert. Beispiel 2 : Klonieren von Oligonukleotiden 2.1 Pr?paration des Vektors nach Variante 1 : ?ffnen des Vektors durch
Restriktionsverdau mit anschliessender Klenow-Reaktion 2.1. 1 Restriktionsverdau Mit Hilfe von Restriktionsenzymen wurden die Klonierungsvektoren an den entsprechenden Stellen ge?ffnet. Da nicht alle Enzyme im gleichen Puffer schneiden und einige Enzyme in der N?he von DNA-Enden nur sehr schlecht arbeiten, richteten-sich die Bedingungen für den Restriktionsverdau nach der Wahl der Enzyme. Im Folgenden sind die Bedingungen für das Schneiden mit Hindlll und BamHI angegeben. Zun?chst wurden ca. 7/lg des Vektors für eine Stunde mit 10 U Hindlll in 30, ul 1x Puffer A (Roche) im Inkubator bei 37 °C verdaut. Nach Zugabe weiterer 5 U Hindlil wurde nochmals eine Stunde geschnitten. Der Pufferwechsel erfolgte entweder durch Zugabe der entsprechenden Puffer-und Salzi?sungen oder, wie in diesem Falle, durch Ethanolpr?zipitation (siehe 2.1. 3) und anschliessendem Resuspendieren im Puffer für das zweite Enzym. Im hier beschriebenen Beispiel wurde der
Vektor in 1x Puffer B (Roche) und 10 U BamHI in 30 ul Endvolumen für eine Stunde und nach erneuter Enzymzugabe (5 U) über Nacht verdaut. Am n?chsten Morgen wurden 5 U Sam1 zugegeben und nochmals für eine Stunde inkubiert. Danach wurden die Restriktionsenzyme 10 min bei 65 °C denaturiert. 2.1. 2 Klenow-Reaktion Zum Restriktionsansatz wurden folgende L?sungen pipettiert :
Reagenz Volumen Endkonzentration
Entsprechende dNTPs 4@ ul je 1 mM (je 10 mM, hier dATP, dGTP)
Klenow-Enzym (2 U/, ul) 2, ul 4 U/Reaktion
H20 ad 40, ul
Hierbei war zu beachten, dass das Gesamtenzymvolumen nicht 10 % der L?sungsmenge überschritt, weil der hohe Glycerolgehalt die Enzymaktivit?t h?tte herabsetzen k?nnen. Der Ansatz wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und das Klenow-Enzym anschliessend für 15 min bei 75 °C denaturiert. 2.1. 3 Aufreinigung Um die Enzyme aus einem Reaktionsansatz zu entfernen wurden zwei Phenol/Chloroform-Extraktionen durchgeführt. Hierzu wurden der DNA- L?sung 10 lit 3 M Natriumacetat pH 5,2, 50 Pl H20 und 100, ul Phenol/Chloroform zugegeben. Nach kr?ftigem Schütteln und dreiminütiger Zentrifugation bei 13.000 Upm in einer Tischzentrifuge wurde die obere, w?ssrige Phase abgenommen und erneut mit Phenol/Chloroform gereinigt. Zur F?llung der DNA wurden 250 NI Ethanol (p. A. ) zugegeben und für 15 min bei-70 °C inkubiert. Anschliessend wurde die DNA durch
Zentrifugation für 15 min bei 13. 000 Upm und 4 °C pelletiert, mit 70 % Ethanol gewaschen und bei 37 °C getrocknet. Der fertig pr?parierte Vektor wurde in 30, ul H20 resuspendiert und die Konzentration durch Agarose- Gelelektrophorese abgesch?tzt. 2.2 Pr?paration des Vektors nach Variante 2 : Generierung des
ge?ffneten Vektors durch PCR mit anschliessender T4-DNA-
Polymerasereaktion unter Verwendung bestimmter Stopp-Nukleotide 2.2. 1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Für die Amplifikation wurde untenstehender PCR-Ansatz pipettiertund nach dem angegebenen Programm die PCR durchgeführt. Da die Amplifikation des nahezu gesamten Plasmids zu langen PCR-Produkten führt, wurden die Reaktionsans?tze durch 5 Vol.-% Glycerol und 2-5 Vol.-% DMSO erg?nzt. Ausserdem wurde sowohl die Matrizen-DNA-Menge (& 10 ng) als auch die PCR-Zyklenzahl (& 25) m?glichst klein gehalten.
Mutagenese PCR-Ansatz
Substanz Konzentration/Menge Matrizen-DNA & 10ng Puffer 1-x.
dNTPs je 0,3 uM Oligonukleotide je 0,3-0, 6 uM Glycerol 5 % (Karasavvas and Zakeri, 1999) DMSO 2-5 % (Karasavvas and Zakeri, 1999) MgCI2 2,25 mM ExpandTM 1, 75 U H2O ad. 50-100/il
Zyklische Amplifikation : Temperatur Dauer Zyklenzahl 94 °C 2 min 1 94 °C 30sec 50-68 °C 1 min : 5 25 &BR& 68 °C Imin/kb 1&BR& 68'C 10 min 2.2. 2 Aufreinigung Zur Aufreinigung der PCR-Produkte wurde der Qiagen PCR-Purification Kit verwendet. Dazu wurden die PCR-Produkte mit 5 fachem Volumen Puffer PB vermischt und durch Zentrifugation an eine Minis?ule gebunden. Nach Waschen mit PE-Puffer wurde die DNA mit 40 ul H2O eluiert. 2.2. 3 Trimmen des PCR Produkts Zum Erzeugen der zum pr?parierten Vektor komplement?ren 5'-?berh?nge wurde folgender Mix auf Eis angesetzt :
Substanz Volumen (NI) Endkonzentration DNA 20 2.5-5 ug/40ul T4-Inkubationspuffer 8 1 x dNTP (10 mM) 4 je 1 mM Wasser add. 38/7)
Vor Zugabe der T4-DNA-Polymerase wurde der Ansatz gut gemixt
T4-DNA-Polymerase (1 U/ul) 2 0.05 U/ul
Nach 30 minütiger Inkubation bei 12 °C wurden die Proben für 15 min bei 75 °C denaturiert und, wie bei der Vektorpr?paration beschrieben, aufgereinigt und analysiert. 2.3 Einfügen der doppelstr?ngigen D) igonuk) eotide 2.3. 1 Vorbereiten der doppelstr?ngigen Oligonukleotide Für die Dimerisierung der Oligonukleotide wurden je 10, ug Primer in einem 50 mM Tris-HCI-Puffer (pH 7,5) mit 1,75 mM MgCl2 in einem Endvolumen von 100, ul gemischt und in einem PCR-Ger?t bei 95 °C denaturiert. Die Hybridisierung erfolgte durch langsames Abkühlen des Heizblocks auf Raumtemperatur. 2. 3.2 Ligation Pr?parierter Vektor und doppelstr?ngige Oligonukleotide wurden bei einem Endvolumen von 10-15 pI so gemischt, dass das Verh?ltnis der freien Enden 1 : 500 betrug, wobei ca. 100 ng Vektor eingesetzt wurden. Nach Zugabe von 0, 5, u1 T4-DNA Ligase wurde der Ansatz über Nacht bei 4 °C inkubiert. Beispiel 3 : Xcml-Klonierung 3.1 Einleitung Die Verwendung von Restriktionsenzymen, deren Schnittstelle nicht in der Erkennungssequenz liegt, zum ?ffnen des Klonierungsvektors bietet mehrere weitreichende Vorteile. Der gravierendste Vorteil ist die M?glichkeit gerichteten Klonierens mit nur einem Restriktionsenzym. Da die Effizienz einer Restriktion wesentlich h?her ist als die eines Doppelverdaus, steigt die Klonierungsrate enorm. Zudem f?llt aus dem Vektor kein Linkerfragment heraus, das somit nicht mehr abgetrennt werden muss. Im Falle der hier verwendeten Erkennungssequenz für Xcml k?nnen neun
Basen an der Schnittstelle frei gew?hlt werden. Man k?nnte aber auch jedes andere Restriktionsenzym einsetzten, das neben einer spezifischen Erkennungssequenz die freie Wahl von Basen zul?sst. Beispiele sind Xmnl, Van9 11, SM, Mwol oder andere. Das erm?glicht dem Anwender das Einfügen von Basen, welche die Nutzung bereits im Labor vorhandener Oligonukleotide erlauben. Durch die mit dieser Klonierungstechnik erzielte hohe Effizienz bietet sich diese für eine automatisierte Klonierung von DNA an. 3.2 Generierung von pDLO12-Xcml Das Einfügen der Xcml-Schnittstelle in den Vektor pDL012 erfolgte über eine Di-/TriSec-Mutagenese mit den Oligonukleotiden pDL01 x-5'-Xcml (5'-Phos-TTATCGATGGATCCAGACATGATAAGATACATTGA-3') und pDL01-3'-Xcml (5'-Phos-ATAAGGTGGCAGGTCGGATCGGTCC-3'). Mit Hilfe dieser Oligonukleotide wurde der Vektor pDL012 amplifiziert. Nach der T4-DNA-Polymerasereaktion mit dCTP und dGTP, der Ligation und anschliessender Transformation in E. coli, konnten die positiven Klone durch Xcml-Verdau identifiziert werden. Das Einfügen der Schnittstelle wurde zudem mittels Sequenzierung überprüft. Klonierung von G3BP in pDLO-Xcml : Xcml hat folgende Erkennungssequenz :
Xcml 5'-CCANNNNNNNNNTGG-3' 3'-GGTNNNNNNNNNACC-5'
t Die mit N gekennzeichneten Basen sind frei w?hlbar, sie tragen nicht zur Schnittstellenerkennung bei. Dies erm?glicht die Einführung einer Sequenz, die ben?tigt wird für eine Di-/TriSec-Klonierung über ein bestimmtes oft verwendetes Klonierungschema. Dies hat den Vorteil, dass nur ein
Primerpaar gekauft werden muss, das dann aber eine Klonierung in verschiedene Vektoren erlaubt. Im hier angeführten Beispiel besitzt die Xcml-Schnittstelle folgende Sequenz : &BR& &BR& &BR& Xcml&BR& &BR& &BR& &BR& &BR& 5'-CCAccttatcgaTGG-3'&BR& &BR& &BR& &BR& 3'-GGTggaattagctACC-5'&BR& &BR& i Nach Xcm/-Verdau des Vektors entsteht ein"Einzelbasen-3'-?berhang". 5'-GCAcctta tcgaTGG-3' 3'-GGTggaa tagctACC-5' Anschliessend erfolgt die Trimmreaktion (3'-5'-Exonukleaseaktivit?t) mit der T4-DNA-Polymerase unter der Verwendung von dCTP als Stopp-Nukleotid : 5'-CCAcc tcgaTGG-3' 3'-GGTggaa ctACC-5' In die aufgereinigten Vektoren k?nnen dann PCR-Fragmente einkloniert werden, die am 5'-Ende die Sequenz"TTC"und am 3'-Ende"GAC" besitzen (im Beispiel : G3BP-Klonierung mit den Oligonukleotiden 5'-G3BP-DLO (5'-TTC ATG GTG ATG GAG AAG CCT AGT-3') und 3'-G3BP (5'-GAC TTA CTG CCG TGG CGC AAG CCC CCT-3'). Das PCR-Produkt tr?gt folgende Enden : 5'-TTCxxxxxxxxxxxxxxxxGTC-3' 3'-AAGxxxxxxxxxxxxxxxxCAG-5' Es wird ebenfalls einer T4-DNA-Polymerase-Reaktion unterzogen, mit dGTP als Stopp-Nukleotid, wodurch untenstehendes Produkt erhalten wird :
5'-TTCxxxxxxxxxxxxxxxxG-3' 3'-GxxxxxxxxxxxxxxxxCAG-5' Nach der Aufreinigung, k?nnen der Vektor und das Insert ligiert werden. 5'-CCAccTTCxxxxxxxxxxxxxxxxGtcgaTGG-3' 3'-GGTggaaGxxxxxxxxxxxxxxxxCAGctACC-5' Die iigierte DNA wird in E. coli transformiert. Mit Hilfe von Kolonie-PCR und Sequenzierung k?nnen die positiven Klone identifiziert und überprüft werden. 3.3 Methoden : 3.3. 1 Amplifikation des Inserts : Templat: G3BP in pET28a (GI : 5031702) PCR : 3 x Ans?tze ? 50 ul
1 ul pARBO21 (10 ng/ul)
15 ul Expand Puffer 3 (Roche)
3, ul dNTPs (10mMeach)
1, 5, ul 5'-Primer (50 uM)
1, 5, ul 3'-Primer (50 uM)
pI Expand Long Template 125 sI H2O 150 pl Programm :
1'94°C 1 x
1'94°C 1'55°C 25 x 2'68°C
3.3. 2 Vektorverdau mit Xcml: 10 ug pDLO12-Xcml
5 ul Stratagene #one-for-all"-Puffer ad 50 ul ca. 2 h, 37 °C 3.3. 3 Vektor-Trimmen mit T4-DNA Polymerase :
2, 5 ul geschnittener pDLO12-Xcml (0, 5 @g/ul)
2 pI Puffer A (Roche)
2 ul BSA (1 : 10)
2 ul dCTP (10 mM) 10, 5 pl H20
1 ul T4 (1 : 5) 30 min 12 °C, anschliessend 15 min 75 °C 3.3. 4 Insert-Trimmen mit T4-DNA Polymerase :
8 ul G3BP-PCR-Fragment (150 ng/ul) . 4 ul Puffer A (Roche)
0, 4 NI BSA (100 x)
4 ul dGTP (10 mM) 22, 6 @l H2O
1 @ ul T4-Polymerase 30 min 12 °C, anschlie#end
15 min 75 °C
Nach dem Trimmen erfolgte eine Aufreinigung über Phenol/Chlororform- Extraktion und Ethanolpr?zipitation (siehe Abschnitt 2.1. 3). 3.3. 5 Ligation (in 1 5, ul) 3, 5, ul getrimmter pDL012-Xcml-Vektor (-10Q ng) pI getrimmtes G3BP-PCR-Fragment (100 ng) 3, ul 5 x Ligation Buffer 0, 5, ul T4-Ligase (Life Tech.) 8 ul H2O 4 °C über Nacht Anschliessend wurde die DNA in E. coli transformiert. Die positiven Klone konnten durch Kolonie-PCR sowie Restriktionsverdau identifiziert und durch Sequenzierung verifiziert werden. Beispiel 4 : Di-/TriSec-Klonierung von DNA-Oligonukleotiden in einen
Vektor zur in vivo Expression von siRNA 4.1 Einleitung Die entwickelte Di-/TriSec-Klonierung soll ?uf ihre Eignung für die Klonierung von DNA-Oligonukleotiden in Vektoren untersucht werden, die sich zur Produktion von doppelstr?ngiger RNA in transfizierten Zellen eignen. Als Beispiel sollte ein Inhibitor für das Lamin A/C Gen generiert werden. 4.2 Methoden Die DNA-Oligos mit der Sequenz hLamin 1as IVE 5'CTT TTC CAA AAA CTG GAC TTC CAG AAG AAC ATC TCT TGA ATG TTC TTC TGG AAG TCC AGG GG 3'und hLamin 1 s IVE 5'TCC CCC TGG ACT TCC AGA AGA
ACA TTC AAG AGA TGT TCT TCT GGA AGT CCA GTT TTT GGA AA 3' wurden in einer Konzentration von 100, uM in H20 gel?st. Für die Dimerisierung wurden komplement?re Oligonukleotide in unterschiedlichen Konzentrationen in einem Magnesium-haltigen Puffer (siehe Abschnitt 2.3. 1) gemischt und in einer PCR-Maschine auf 95 °C erhitzt. Die Hybridisierung der Oligonukleotide erfolgte durch langsames Abkühlen von 95 ° C über 3 Stunden auf Raumtemperatur. Der Deckel des Reaktionsgef?sses blieb auf 95 ° C erhitzt. Die Dimerisierung der Oligonukleotide kann in Konzentrationen von 0, 25-40, uM erfolgen, ohne dass dies entscheidenden Einfluss auf die Ligationsrate hat. Zur Vorbereitung der Klonierung wurde der pSUPER Vektor (Brummelkamp et al., 2002) mit den Restriktionsendonukleasen BgllI und Hindlll nach Herstellerangaben geschnitten und nach der zuvor beschriebenen Methode mit dATP und dGTP aufgefüllt (siehe Abschnitt 2.1. 1). Die Ligation erfolgte wie zuvor beschrieben (siehe Abschnitt 2.3. 2). Dabei wurden Verh?ltnisse der freien Vektorenden zu den freien Insertenden von 1 : 100 und 1 : 500 getestet. Die Ligationsans?tze wurden mittels Stahdardmethoden in E. coli transformiert, rekombinante Plasmide vermehrt und gereinigt. 4.3 Ergebnis Die Effizienz der Klonierung der doppelstr?ngigen hLamin 1 IVE Oligonukleotide lag insgesamt bei 84 % wobei das Verh?ltnis Vektor zu Insert nur geringen Einfluss hatte (1 : 500,80 %, 1 : 100,86 %). Das hier gezeigte Beispiel unterstreicht die hohe Effizienz des erfindungsgem?ssen Klonierungsverfahrens. Der geringe Einfluss der
Konzentration der Oligonukleotide bei der Dimerisierung sowie des Verh?ltnisses Vektor : lnsert auf die Ligationsrate belegen die Robustheit des Verfahrens gegenüber den Reaktionsbedingungen. Im postgenomischen Zeitalter entsteht ein immer h?herer Bedarf an Ans?tzen, die eine sehr grosse Anzahl von Genen untersuchen. Die hier gezeigte siRNA-Klonierungstechnik k?nnte einen wichtigen Schritt zur Erstellung einer permanenten"Knockdown"-Zellklonbibliothek darstellen. S?mtliche Schritte, angefangen mit dem L?sen der Oligonukleotide über die Dimerisierung, die Ligation, die Transformation bis zum PCR-Screen für positive Klone und die Isolation von Plasmid-DNA k?nnen automatisiert werden. Dadurch k?nnen in kurzer Zeit Silencer-Konstrukte für nahezu alle humanen Gene erzeugt werden. Der Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens zu herk?mmlichen Verfahren ist die hohe Effizienz und Robustheit der Klonierung. Herk?mmliche Strategien beruhen auf der Klonierung von doppelstr?ngigen Oligonukleotiden über palindromische Restriktionsschnittstellen. Dabei bilden die zu klonierenden Oligonukleotide bevorzugt Concatamere. Die Folge ist eine erheblich verringerte Klonierungseffizienz. Das hierin beschriebene Verfahren schliesst hingegen Concatamerbildung der Oligonukleotide aus und erh?ht dadurch die Effizienz der Klonierung.
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