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ctDNA&cfDNA&CTC那点事儿——临床应用篇
核心提示：1.关于cfDNA的事儿Q1：外周血中的cfDNA的含量，说明什么？A：有研究已经证实，肿瘤患者外周血中的cfDNA总量，要高于健康人。通过……1.关于cfDNA的事儿
Q1：外周血中的cfDNA的含量，说明什么？
A：有研究已经证实，肿瘤患者外周血中的cfDNA总量，要高于健康人。通过这一点，虽然不能武断的说cfDNA能成为肿瘤标志物，但是cfDNA的含量增多，能起到一个较好的提示作用，作为一个初筛的手段。
Q2：基于cfDNA的液态活检（对于肿瘤来说既是ctDNA），是否只应用于肿瘤？
A：尽管ctDNA在肿瘤诊疗中的应用是当下cfDNA最广泛，研究最深入的分支。但是，cfDNA作为液态活检，不只是局限于肿瘤学。例如，有研究报道对于接受器官移植手术的病人，可以通过监测术后外周血中具有捐献者基因特征，片段化的cfDNA含量变化，来评估移植器官的排斥情况。
2.关于ctDNA的事儿
Q1：ctDNA能够检测到哪些遗传变异情况？
A：ctDNA中能够检测到的遗传变异信息非常丰富，从简单的点突变和indel到复杂的结构变异（structural variation），甚至染色体拷贝数变异都能够检测到。在表观遗传层面，ctDNA中可以检测到基因启动子区的甲基化。在细胞器遗传物质层面，ctDNA中可检测线粒体DNA（mtDNA）的变异情况。
Q2：是否所有的肿瘤都会产生ctDNA，且能够在外周血中被检测到？
A：因为ctDNA主要是死亡的肿瘤细胞破裂后所释放出来的、片段化的基因组DNA。理论上，所有的肿瘤都会产生ctDNA。但是，ctDNA的检出率是高度依赖于肿瘤发展阶段、肿瘤类型和检测手段这三个重要因素。
肿瘤发展阶段上，ctDNA含量通常在晚期或转移性肿瘤中较高，而在早期或局限性肿瘤中含量较低。肿瘤类型上，有研究表明ctDNA在原发性脑肿瘤（如胶质瘤），肾癌，前列腺癌和甲状腺癌中含量较低（晚期肿瘤中检出率&50%）。检测手段上，数字PCR和BEAMing系统的灵敏度是最高的，在肿瘤早期也有较高的检出率，而同期高通量检测手段（多基因靶向测序或外显子测序）检出率较低。
Q3：为什么原发性脑肿瘤（如胶质瘤）外周血中的ctDNA含量最低？
A：目前认为，主要是因为血脑屏障的阻碍，使得原发性脑肿瘤的ctDNA较难进入到外周血中。作为一种替代方式，有研究表明对于原发性脑肿瘤，可通过脑脊液来检测ctDNA的特征。
Q4：外周血中的ctDNA，能否作为肿瘤诊断的标志物？
A：目前有研究支持ctDNA在作为肿瘤诊断标志物上具有巨大的潜力。在ctDNA在用于诊断方向时，多选取该种肿瘤的频发突变基因作为标志物。但在看到其高特异性的同时，应清楚地认识到其灵敏度有限。因此，ctDNA诊断应用的同时，也要密切结合其他传统诊断的方法。
Q5：外周血中的ctDNA，能否作为肿瘤预后的标志物？
A：外周血中的ctDNA，无论是量，还是特定的基因突变类型（例如KRAS等）都可以作为肿瘤预后的标志物。研究的趋势倾向于，使用肿瘤特异性突变特征（包括突变类型和拷贝数）的变化，作为肿瘤预后的标志物。
Q6：外周血中的ctDNA，能否用来预测治疗效果？
A：外周血中的ctDNA能够用来预测药物治疗的效果，这也是ctDNA作为肿瘤监测应用非常重要的一个方面。它的预测效能主要通过两个方面来体现，一个是肿瘤特异性突变拷贝数的变化，这种变化反映了肿瘤负荷对药物治疗的响应程度；另一个是肿瘤突变类型（主要是指耐药突变）的演化，这种变化反映了肿瘤内部耐药克隆筛选的进程，这将直接导至药物失效。
3.关于CTC的事儿
Q1：CTC的哪些信息可用于临床检测？
A：我们通常通过以下几方面来评估CTC：
1、CTC计数：对标准取样体积中包含的细胞数目进行计数（CellSearch平台的标准取样体积为7.5ml）。
2、CTC抗原特征：通过对CTC上特定肿瘤相关抗原染色（如Her2等）。
3、CTC基因组信息：对CTC上的肿瘤突变（单细胞测序），染色体异常（荧光原位杂交）等。
随着CTC分离和单细胞检测技术的飞速发展，未来可能了解更多关于CTC单细胞的RNA信息（包括mRNA，miRNA和lncRNA），以及CTC活细胞的功能，例如细胞迁移能力，细胞分泌特定因子情况。
Q2：目前通过FDA认证的CTC临床应用有哪些？
A：目前FDA认证的CTC应用，主要是指通过CellSearch平台的CTC计数来辅助评估转移性乳腺癌、转移性前列腺癌和转移性结直肠癌的疾病进展，主要包含以下几个方面：
1、接受化疗的癌症患者基线的CTC数量（Cut-off值：乳腺癌/前列腺癌是5个CTC/7.5ml血，结直肠癌是3个CTC细胞/7.5ml血），可预测治疗后无进展生存时间和总生存时间，以此作为患者是否需要接受辅助化疗的参考；
2、接受化疗的癌症患者CTC的数量变化，可预测治疗后的无进展生存时间和总生存时间，以此作为肿瘤进展、转移复发风险评估的参考；
3、接受化疗的癌症患者CTC数量，可用于实时反映肿瘤负荷，以此作为肿瘤药物耐药性的监测。
Q3：CTC能否用于肿瘤早期筛查/诊断？
A：有研究探索CTC在肿瘤高危群体中早期筛查/诊断中的应用价值（如肺癌、胰腺癌）。结果提示，在极少数肿瘤高危人群中的确能够检测出CTC，能够很准确地提示肿瘤的发生，并且远早于影像学证据。
CTC在肿瘤早期筛查/诊断中的难点在于：
1、CTC在肿瘤患者外周血中含量很低，在癌前病变或肿瘤早期数目更加稀少。这对应用于肿瘤早期筛查/诊断的CTC检测技术，提出了更高的要求。因此，相关研究较多地采用CTC检出率较高的技术（例如阴性富集策略，微流体检测策略）。而CellSearch平台，较少地在应用于该方向（良性肿瘤检出率基本为0）。
2、CTC应用于肿瘤早筛，较多的基于特定类型肿瘤的高危人群（例如慢性阻塞性肺病和肺癌）开展分析和相应推论。但就检测到CTC所选取的特征值（如数量，CD45抗原阴性，EpCAM阳性，特定肿瘤基因突变等），只能推断这种细胞可能是恶性肿瘤细胞，而不能进一步确诊为何种肿瘤细胞。未来的研究，应进一步完善单细胞水平上肿瘤类型的区别性诊断方案（例如肿瘤特异性抗原染色）。
Q4：CTC能否能够应用于靶向治疗药物的疗效预测及监测？
A：在乳腺癌CTC相关的临床研究中，大部分结果支持CTC计数（Cut-off值为5）在各种亚型（组织学或免疫组织化学诊断，包括Her2阳性，三阴等亚型）中均与病人的预后密切相关。这种相关性与患者选择的治疗方式无关，无论是靶向治疗还是传统化疗。检测胎儿染色体异常
cf-DNA检测性能次于标准筛查
检测胎儿染色体异常
cf-DNA检测性能次于标准筛查
圣地亚哥--新的研究显示，胎儿游离DNA（cfDNA）检测作为胎儿染色体异常的初筛手段，似乎比母体血清学序贯筛查的效果差。
　　圣地亚哥--新的研究显示，胎儿游离DNA（cfDNA）检测作为胎儿染色体异常的初筛手段，似乎比母体血清学序贯筛查的效果差。
　　美国加州大学旧金山分校的医学博士玛丽.诺顿表示，&总体而言，考虑到所有的染色体异常，包括cfDNA检测的无结果病例，序贯筛查的性能优于cfDNA检测。& 她在2015年母胎医学协会（SMFM）年度妊娠会议上提出，&各种疾病都是产前检查的重要考虑因素，而非仅仅21三体综合征，检查需要考虑到所有的结果。&
　　诺顿博士和她的团队在普通人群产前研究队列中，评估了检测出的所有胎儿染色体异常情况。他们比较cfDNA检测和作为现行标准的序贯筛查，后者涉及在孕早期和孕中期进行的血清分析和颈部透明带超声检查。
　　2011年cfDNA检测引入临床实践，并迅速应用于高风险孕妇群。目前该检测主要用于胎儿非整倍体或其它畸形的高危孕妇，然而，最近的数据表明，该检测对低风险孕妇也具有很高的灵敏度和特异性。
　　诺顿博士解释，虽然cfDNA技术有望成为所有孕妇的初筛手段，但它确实存在一定的局限性。该检测只针对13，18，21三体综合征和性染色体非整倍体，而非检测智力和其他先天缺陷。序贯筛查反而能确定是否存在一系列胎儿发育异常的风险。
　　胎儿DNA测序需要一定量存在于母体血液中的胎儿DNA，胎儿DNA片段含量不足可能会导致检测失败。一项&无结果&的cfDNA检测的预测性往往更显著，根据以往的研究，检测失败意味着非整倍体的几率为普通的2.5至6.2倍。
　　诺顿博士指出，因为&没有做过含所有染色体异常和检测失败的前瞻性队列研究，所以检测失败对cfDNA检测作为初筛的影响未知&。需要考虑这些限制和特性，进一步完善该项研究。
　　研究人员在一个大样本队列中，考虑到所有的染色体异常，去模拟cfDNA作为非整倍体初筛的预期性能。无检测结果的案例被认为是高风险人群，并跟踪随访；cfDNA检测结果与传统的筛查结果进行比对。
　　这项研究纳入了从2009年4月至2012年12月&加州产前筛查项目&所有单胎妊娠的参与者，同时提供传统的序贯筛查结果。
　　细胞遗传学异常按国家规定的报告收集。cfDNA检测内容包含13，18，21三体综合征和性染色体非整倍体。cfDNA无法检测罕见的三倍体，平衡易位，缺失和复制，染色体标记和嵌合体。无检测结果的情况被认为是13、18三体，和三倍体高风险的指示。在452901名女性的队列中，74％的女性年龄小于35岁，在2575妇女中检测到的异常核型，结果显示cfDNA检出率比序贯筛查检测率低（75.4％比81.6％）。如果排除无检测结果的情况，cfDNA检出率较低，为71.4％；非检出率，其中包括假阴性率，为24.5％；无检测结果的比例为4.1％。相比之下，cfDNA检测和序贯筛查之间的检出率有显著差异（P&0.001）。除三种三体综合征外，传统序贯筛查对其他情况的染色体异常检出率为53.8％，范围从24.2％罗伯逊易位到91.0％的其他三倍体。序贯筛查和cfDNA筛查的假阳性率分别为4.5％和5.1％（如果cfDNA检测无结果归入高风险组并跟踪随访）；若无检测结果组后期无随访，cfDNA筛查假阳性率为1.0％。
　　诺顿博士承认，虽然研究使用了cfDNA筛查技术，但非所有的孕妇都完成了序贯筛查，而且cfDNA检测无结果的案例并没有典型的报道，也非所有的cfDNA筛查实验室都报道了相同染色体异常或使用同样的方法学。她总结中强调，所有的异常都是产前检测中需要考虑的重要因素，而cfDNA检测无结果的案例有必要进行咨询和随访。
专家们对cfDNA检测应用的异议
　　来自费城托马斯杰斐逊大学，同时也担任SMFM主席，此次主持全体会议的Vincenzo Berghella 医学博士说：&诺顿博士在比对序贯筛查和cfDNA检测的灵敏度和检出率方面做得非常出色，结果显示出序贯筛查具有较高的检出率，而且它的价格也更优惠。就目前，我们没有看到广泛使用cfDNA检测方法带来的益处。美国妇产科医师学会（ACOG）建议该检测用于高危孕妇，而非广泛用于一般人群，我们在实际应用中也是这么做的。&
　　纽约哥伦比亚大学和纽约大学朗格尼医学中心的Laxmi Baxi医学博士向Medscape医学新闻社表示：&这种观点并不普遍。对于常见的非整倍体，cfDNA检测更准确。对于产前检查，cfDNA检测唐氏综合征和13三体综合征和精确度分别达到了99.0％和98.9％。而且孕妇不想要一个风险评分，她们更想要一个是或否的结果。&
　　Baxi博士质疑了检测所有染色体异常的重要性，尤其是那些会导致胎儿死亡的异常。她说：&重点是什么？我不想在发现其他异常情况下，再去做有风险的侵入性检查[如后续绒毛膜取样或羊膜穿刺术]。&有多少孕妇的序贯筛查高风险时再去做绒毛膜取样或羊膜穿刺术？她又解释，&我已经几乎停做这些侵入性检查，因为有了cfDNA技术，所以没有必要再行侵入性检查。我相信，不论孕妇年龄大小，cfDNA检测应该是普遍适用于孕妇的检查，该技术一定可以做到。&
　　诺顿博士公布该研究得到Ariosa诊断公司和Natera的支持。Berghella博士和Baxi博士则宣称与它们无相关财务关系。(编译)
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　　对于cfDNA可能大家知道的并不多，至于癌症和产检，大家肯定就比较熟悉了。而cfDNA在癌症早期诊断与后期评价癌症药物疗效还有孕妇无创产前基因检测中起着非常重要的作用。这里大家就有疑问了，为什么cfDNA有这么大的作用，到底什么是cfDNA呢？小编为大家细细道来。
　　cfDNA是 cell free DNA的缩写，顾名思义就是指游离于细胞外的DNA。大家又会问了，DNA不都是在细胞内吗，怎么会跑到细胞外呢，除非细胞破了（裂解了）细胞内的DNA才会被释放到出来？没错，这正是cfDNA的来源，从这一点去思考cfDNA的产生就比较简单了。目前发现Cell-free DNA的来源主要有两种：一种是细胞主动裂解（又叫细胞凋亡）过程中产生的“DNA ladder”式的片段化核酸（图1），它们的大小基本上在150-200bp左右。关于细胞凋亡这点小编跟大家稍微解释一下，人体是一个庞大而复杂的循环系统，其中的运作周而复始，循环往复。除了整个人体的大循环，还有组成人体的各个部件各自的“小循环”，简单来说，就是人体各个器官更换状态的周期。一般情况下，人体会在半年内更新掉身体的98%组织的细胞，也就是说每天每时每刻我们体内都不断地有细胞在凋亡又有新的细胞在形成。另一种就是细胞被动裂解——这种裂解的方式就有很多，既可以来源于外界物理或者化学刺激引发的组织坏死，也可以是自身免疫系统对细胞杀伤作用，不同的是这个过程产生的核酸很大，会接近基因组DNA大小。当然，无论是哪一种方式产生的cfDNA，都会进一步在外周血中被快速清除，同时体内的细胞裂解又会释放新的cfDNA，这个动态的过程会使得体内的cfDNA维持在一个相对稳定的较低的水平。总结前面几点可以知道：cfDNA实际上是机体内细胞损伤的产物，它可以来自细胞凋亡，还可以来自细胞被动裂解。我们可以认为人体内可检测到的cfDNA含量，实际上反映的是DNA的释放和清除两方面因素平衡后的情况。对于健康的人来说，血液中的cfDNA主要来源是体细胞正常的新陈代谢，因此应该维持在一个较低的水平。当有很严重的系统性器官损伤打破这种平衡时，大量死亡的细胞会产生大量的cfDNA，使得血液中的cfDNA含量大大增加。因此，反过来就有可能通过cfDNA的含量变化，来对这类型疾病进行一个评估。目前已经有很多文献，证实在包括系统性红斑狼疮在内的风湿性关节炎，肾小球肾炎，胰腺炎，炎症性肠病、肝炎等炎症疾病患者血浆中，都能够显著性地检测到cfDNA相比健康人群含量大大增加。
　　图1：cf DNA是由身体内正常细胞凋亡释放出来
　　说到cfDNA与肿瘤的关系，这里我们得知道另外两个词ct DNA（Circulatingtumor DNA）翻译为循环肿瘤DNA和CTCs 即循环肿瘤细胞（circulatingtumor cells）。CtDNA为来源肿瘤细胞的cfDNA，也就是说其实ct DNA只是cf DNA中的一种。到目前为止，ctDNA可以作为肿瘤预后的标志物，而且也能够用来预测药物治疗的效果。再解释一下无创产检与cfDNA的关系，因为在孕妇血液中，约有10%-15%的cfDNA来自于胎盘滋养层，这意味着可以通过母亲外周血测序分析其中的cfDNA信息有一部分是胎儿的，而通过这一部分就可以判断胎儿是否存在整个染色体或者大片段DNA的变异，这比起以前的方式是要安全可靠得多。
　　图2：cf DNA、CTCs和ct DNA
　　cfDNA在肿瘤生物学中如此出名，但是它的最早发现却不是在肿瘤患者的血样中，而是于1948年由法国科学家Mendel和Metais在健康人的血清和血浆中通过高氯酸沉淀的方法发现c DNA（图3）。由于当时人们都还没有意识到DNA是遗传物质，因此并没有充分地引起大家重视。在1977年人们第一次发现肿瘤病人血清中的 cfDNA含量比健康人要高，但当时并无法知道这些DNA是否来自于肿瘤细胞还是正常组织。直到1989年，人们才通过DNA链的热力学稳定性比较，第一次确定在肿瘤患者血浆中发现的DNA有一部分是来自于肿瘤细胞的，并且在这个时候提出了“液体活检”的概念。从这之后cfDNA每一次的重大发现都与肿瘤密不可分，这也使得cfDNA研究有了长足的进步，并且很快体现了其研究价值所在。
　　图3：cf DNA发现的时间轴
　　当然，我们现在对cfDNA的了解也只是皮毛，其中包含的各种序列信息还有待于我们进一步细细发掘。
　　参考文献：
　　[1] Fariz Nurwidya ,etal. Circulating tumorcell and cell-free circulating tumor DNA in lung cancer. CMJ 2016
　　[2] Giulia Siravegna and Alberto Bardelli.Genotyping cell-free tumor DNA in the blood todetect residualdisease and drug resistance. Genome Biology 2014
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