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【cfDNA专题】cell
时间： 10:20
作者:生物观察
近期我们在开展一个优化cfDNA quantification 和 qualification 方法学的小课题。尽管这个课题的初衷，是为了更精准地开展ctDNA研究提供一个技术基础，但我认为cfDNA，包括我们这个小课题的价值，并不仅限于此。现将课题立项阶段，我对cfDNA在非肿瘤疾病中的应用前景的思考分享给大家。再谈Cell-free DNA的历史Cell-free DNA最早的发现就不是在肿瘤患者的血样中，他是1947年由法国科学家Mendel和Metais在健康人的血清和血浆中通过高氯酸沉淀的方法发现了存在DNA。但在那个时候，人类都还没有意识到DNA是遗传物质，因此并没有充分地引起大家重视。人们第一次发现肿瘤和血清中的DNA含量存在一定关系是在1977年，但当时并无法知道这些DNA是否来自于肿瘤细胞还是正常组织。直到1989年，人们才通过DNA链的热力学稳定性比较，第一次确定在肿瘤患者血浆中发现的DNA有一部分是来自于肿瘤细胞的。与肿瘤不同，cfDNA最早引发医学界普遍重视是在20世纪60年代，当时人们在系统性红斑狼疮的患者体内发现很高水平的cfDNA。
因此，从Cell-free DNA的科学发现史上看，我们就有理由相信它不是肿瘤生物学的专宠。Cell-free DNA的来源Cell-free DNA的来源主要有两种。一种就是细胞凋亡过程中产生的“DNA ladder”式的片段化核酸，它们的大小基本上在150-200bp左右。还有一种就是细胞被裂解――这种裂解既可以来源于物理性刺激引发的坏死，也可以是免疫细胞杀伤作用。这种过程产生的核酸很大，会接近基因组DNA大小。当然，不管是哪一种方式产生的cfDNA，它们都会进一步在外周血中被快速清除――这个时间可能是数十分钟至数小时不等，但机制尚不清楚。还有一些极痕量的cfDNA，会存在于不同类型囊泡结构中，如exosome。它们会相对来说稳定一些，但是由于量太少，在此不着重讲述。从cfDNA的来源来看，我们能得到两个信息：cfDNA实际上是一种机体细胞损伤的产物，不管它是来自细胞凋亡，还是细胞裂解。基于cfDNA较短的半衰期，我们可以认为检测到的cfDNA含量，是实时地反映了DNA的释放和清除两方面因素平衡后的情况。目前，尚无研究系统地阐明cfDNA在血液中被清除的主要机制。因此，大家通常默认DNA的释放机制，是决定cfDNA含量的核心因素――换句话说，我们看到的cfDNA多/少了，自然地推论是产生这些cfDNA的细胞群体增多/减少了。理解这两点，对于理解cfDNA的潜在临床价值很有帮助。Cell-free DNA与机体细胞损伤相关疾病如上所述，cfDNA来源于机体细胞损伤，因此我们可以做一个思维实验：对于健康的人，他血液中的cfDNA主要来源是体细胞正常的新陈代谢，因此应该维持在一个较低的水平。然而，当有很严重的系统性器官损伤时，大量死亡的细胞会产生大量的cfDNA。因此，我们就有可能通过cfDNA的含量变化，来对这类型疾病进行一个评估。事实上，这样的假设是成立的。目前已经有很多文献，证实在包括系统性红斑狼疮在内的风湿性关节炎，肾小球肾炎，胰腺炎，炎症性肠病、肝炎等炎症疾病患者血浆中，都能够显著性地检测到cfDNA相比健康人群含量大大增加。因此，似乎cfDNA的临床应用方向，更多地是和显著性的机体细胞损伤这一病理性情境相关联。但是，这个结论可能还要排除掉一些特殊情况。我能想到的一种情形，就是短时程，急性的器官性损伤，例如药物的毒性。因为对于代谢较快的药物来说，它发挥细胞毒性时间窗口较窄，相应地引发的细胞损伤造成的cfDNA检测窗口也会较窄。因此，我们很可能检测不到预期的cfDNA的含量和细胞毒性成正比。我的这个感觉，其实来源于ctDNA含量在肿瘤化疗疗效监测中的数据。大部分的数据显示，肿瘤化疗效果好，ctDNA的含量是降低的，而并非上述“机体细胞损伤”假说中的相应升高。我的解释是，ctDNA监测的时间通常都是在接受化疗后1周，甚至2周，而这个阶段，药物已经代谢殆尽，故不是化疗药物最主要的杀伤窗口，而更多是一个反映肿瘤负荷的窗口――尽管这个时候肯定也会存在一些肿瘤细胞源于治疗的死亡，但相比之下肿瘤负荷的降低对ctDNA的含量影响更为显著。因此，持续性的机体细胞损伤，对于cfDNA在临床上的应用，可能也是必要参考的。那么cfDNA在临床应用方面，还有哪些潜在的问题亟需解决呢？流式细胞术检测植物核DNA含量和倍性水平-360文档中心
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流式细胞术检测植物核DNA含量和倍性水平
中国科技论文在线 http://www.360docs.net/doc/info-32aaf762d6c1.html
流式细胞术检测植物核DNA含量和倍性水平
弓娜1，周香艳2（1. 兰州大学分子生态实验室，兰州 730000；
2. 甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州 730000）
摘要：植物的核DNA含量和倍性水平是植物学研究中重要的基础研究指标。流式细胞仪作为检测这些指标的高效工具，在植物学研究的多个领域都发挥了重要作用。本实验室通过大量的植物流式细胞术实验，总结出一套详细通用的实验方法，同时本文阐述了各个实验环节的关键点，并分析了解决因碎片过多而导致实验失败的原因及解决办法，对今后进行植物流式实验具有指导意义。
关键词：流式细胞术；植物核DNA含量；倍性水平；C值
中图分类号：Q94-336
Analysis of nuclear DNA content and ploid level in plant
cells by flow cytometry
Gong Na1, Zhou Xiangyang2
(1. Laboratory of Molecular Ecology, Lanzhou University, LanZhou 730000;
2. School of Life Sciences, Gansu Agriculture University, LanZhou 730000)
Abstract: Nuclear DNA content and ploidy level are key biological characters in the study of botany. As an efficient tool to measure them, flow cytometry has been playing very important role in many fields of botany research. Through plenty of flow cytometry experiments, our lab came up with a set of universal experimental procedure, at the same time, we have elaborated key points at every experimental stage and solutions to the problems caused by too much fragments which can result in the failure of an experiment, which may provide guidance for the future experiments.
Keywords:FNuclear DNAC-value
20世纪80年代以来，随着流式细胞仪和荧光探针标记技术的不断发展，流式细胞术在现代科学研究及科学实践中的作用越来越重要。流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是应用流式细胞仪进行分析、分选的技术，可以对处于液流中的各种荧光标记的微粒进行多参数快速准确的定性、定量测定。在生物科学研究中，可以使用流式细胞术测定细胞周期、DNA含量，检测细胞凋亡，进行倍性、染色体核型和流式分子表型分析等[1-4]。植物学研究中，流式细胞术主要用于检测植物细胞核DNA含量及其倍性水平[5-8]。在医学研究及临床实践的应用中，流式细胞术也发挥了重要的作用，例如肿瘤诊断和分型、血液病的诊断和治疗及免疫相关疾病分析等方面的应用[9-12]。
生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值。C值是一个很重要的植物学特征，成为植物学家进行种群进化、物种分类和生态学研究的有用分析工具和证据[13]。由于近缘物种的C值极为相似，因而可以通过C值获取基因组大小这一特征信息，用于构建物种的系统进化树，分析亲缘关系[14]，同时可以通过测定C值来鉴定杂交物种[15]。借助植物学细胞C值与气孔保卫细胞长度、面积正相关的规律，通过测量植物化石的气孔长度和面积，可以用已知参考样本物种的C值推断出相应的古植物C值[16]，用于古植物学研究。外来入侵种比同域分布的同属其它种有较小的C值，因此通过检测植物的C值，可以预测入侵能力的作者简介：弓娜（1986-），女，硕士研究生，植物细胞学. E-mail: gongn08@http://www.360docs.net/doc/info-32aaf762d6c1.html
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什么是CTCs、ctDNA和cfDNA?
循环细胞（CTCs）CTCs&就是循环细胞（circulating tumor cells）的简称，这玩意就是在形成的早期，或者是从原发甚至是转移形成的新上掉落下来，并且进入到患者的外周血循环系统中的恶性细胞！！临床上可以用于的早发现，或者治疗的预后监测！循环细胞团（CTC clusters）来自原发中单克隆细胞之间抱团，而不是由单个CTC在血管内聚集或在血管中增殖而成。相比于单个细胞状态存在的循环细胞，2~50个细胞形成的CTC细胞团具有更大的转移能力（是单个循环细胞的25~50倍）。《参考文献》Circulating TumorCell Clusters Are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell 158,,August 28,2014循环DNA（ctDNA&）ctDNA&就是循环DNA（Circulating tumor DNA），顾名思义是原发甚至是转移形成的新上的细胞破裂掉落下来的DNA片段，也是进入了外周血循环系统。这玩意甚至比CTCs更具价值，因为在形成早期血液中往往还没有CTCs但是却已经开始有ctDNA了，这意味着可以通过检测ctDNA而发现早期的！这对于早筛、用药和预后都是非常有意义的！当然技术上也更难。日，坦福大学医学院的研究人员在《 Science Translational Medicine》杂志中表示，对患者血液ctDNA进行测序，可以准确地确定癌症亚型以及引起耐药性的突变位点，这有助于揭示哪些患者有可能被成功治疗，哪些患者的预后较差，从而有助于实现癌症的个性化治疗。“在这项研究中，我们用了五种不同的方式来展示ctDNA潜在的临床价值——量化负荷、识别疾病亚型、分类突变、预测疾病的转变以及早期预测疾病复发”，本文的一位作者，放射学助理教授Maximilian Diehn说，“我们迫不及待在最近被诊断的患者中进行这项前瞻性研究，以确定如何更好地提高对病人的护理。”他们的目标就是对健康人群精准预测和预防疾病，对疾病人群进行精确的诊断和治疗！《参考文献》1.Distinct biological subtypes and patterns of genome evolution in lymphoma revealed by circulating tumor DNA2.DNA sequencing determines lymphoma origin, prognosis细胞游离DNA（cfDNA）cfDNA就跟上面的2种完全不同了，它其实就是cell free DNA，就是在血液中游离的自身DNA而已，这些DNA多是从身体的细胞或者白血球破裂释放出来的，一般认为是无害的，不用多久会被自身清理掉。不过值得一提是，当孕妇怀孕的时候，胎儿的DNA也会同时释放到母亲的血液里头去，这是当前火热的无创唐氏筛查的基础！通过抽取母亲的外周血测序分析其中的游离DNA就可以判断胎儿是否存在整个染色体或者大片段DNA的变异。比起以前的方式是要安全得多，也更准确。
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ctDNA&cfDNA&CTC那点事儿——临床应用篇
核心提示：1.关于cfDNA的事儿Q1：外周血中的cfDNA的含量，说明什么？A：有研究已经证实，肿瘤患者外周血中的cfDNA总量，要高于健康人。通过……1.关于cfDNA的事儿
Q1：外周血中的cfDNA的含量，说明什么？
A：有研究已经证实，肿瘤患者外周血中的cfDNA总量，要高于健康人。通过这一点，虽然不能武断的说cfDNA能成为肿瘤标志物，但是cfDNA的含量增多，能起到一个较好的提示作用，作为一个初筛的手段。
Q2：基于cfDNA的液态活检（对于肿瘤来说既是ctDNA），是否只应用于肿瘤？
A：尽管ctDNA在肿瘤诊疗中的应用是当下cfDNA最广泛，研究最深入的分支。但是，cfDNA作为液态活检，不只是局限于肿瘤学。例如，有研究报道对于接受器官移植手术的病人，可以通过监测术后外周血中具有捐献者基因特征，片段化的cfDNA含量变化，来评估移植器官的排斥情况。
2.关于ctDNA的事儿
Q1：ctDNA能够检测到哪些遗传变异情况？
A：ctDNA中能够检测到的遗传变异信息非常丰富，从简单的点突变和indel到复杂的结构变异（structural variation），甚至染色体拷贝数变异都能够检测到。在表观遗传层面，ctDNA中可以检测到基因启动子区的甲基化。在细胞器遗传物质层面，ctDNA中可检测线粒体DNA（mtDNA）的变异情况。
Q2：是否所有的肿瘤都会产生ctDNA，且能够在外周血中被检测到？
A：因为ctDNA主要是死亡的肿瘤细胞破裂后所释放出来的、片段化的基因组DNA。理论上，所有的肿瘤都会产生ctDNA。但是，ctDNA的检出率是高度依赖于肿瘤发展阶段、肿瘤类型和检测手段这三个重要因素。
肿瘤发展阶段上，ctDNA含量通常在晚期或转移性肿瘤中较高，而在早期或局限性肿瘤中含量较低。肿瘤类型上，有研究表明ctDNA在原发性脑肿瘤（如胶质瘤），肾癌，前列腺癌和甲状腺癌中含量较低（晚期肿瘤中检出率&50%）。检测手段上，数字PCR和BEAMing系统的灵敏度是最高的，在肿瘤早期也有较高的检出率，而同期高通量检测手段（多基因靶向测序或外显子测序）检出率较低。
Q3：为什么原发性脑肿瘤（如胶质瘤）外周血中的ctDNA含量最低？
A：目前认为，主要是因为血脑屏障的阻碍，使得原发性脑肿瘤的ctDNA较难进入到外周血中。作为一种替代方式，有研究表明对于原发性脑肿瘤，可通过脑脊液来检测ctDNA的特征。
Q4：外周血中的ctDNA，能否作为肿瘤诊断的标志物？
A：目前有研究支持ctDNA在作为肿瘤诊断标志物上具有巨大的潜力。在ctDNA在用于诊断方向时，多选取该种肿瘤的频发突变基因作为标志物。但在看到其高特异性的同时，应清楚地认识到其灵敏度有限。因此，ctDNA诊断应用的同时，也要密切结合其他传统诊断的方法。
Q5：外周血中的ctDNA，能否作为肿瘤预后的标志物？
A：外周血中的ctDNA，无论是量，还是特定的基因突变类型（例如KRAS等）都可以作为肿瘤预后的标志物。研究的趋势倾向于，使用肿瘤特异性突变特征（包括突变类型和拷贝数）的变化，作为肿瘤预后的标志物。
Q6：外周血中的ctDNA，能否用来预测治疗效果？
A：外周血中的ctDNA能够用来预测药物治疗的效果，这也是ctDNA作为肿瘤监测应用非常重要的一个方面。它的预测效能主要通过两个方面来体现，一个是肿瘤特异性突变拷贝数的变化，这种变化反映了肿瘤负荷对药物治疗的响应程度；另一个是肿瘤突变类型（主要是指耐药突变）的演化，这种变化反映了肿瘤内部耐药克隆筛选的进程，这将直接导至药物失效。
3.关于CTC的事儿
Q1：CTC的哪些信息可用于临床检测？
A：我们通常通过以下几方面来评估CTC：
1、CTC计数：对标准取样体积中包含的细胞数目进行计数（CellSearch平台的标准取样体积为7.5ml）。
2、CTC抗原特征：通过对CTC上特定肿瘤相关抗原染色（如Her2等）。
3、CTC基因组信息：对CTC上的肿瘤突变（单细胞测序），染色体异常（荧光原位杂交）等。
随着CTC分离和单细胞检测技术的飞速发展，未来可能了解更多关于CTC单细胞的RNA信息（包括mRNA，miRNA和lncRNA），以及CTC活细胞的功能，例如细胞迁移能力，细胞分泌特定因子情况。
Q2：目前通过FDA认证的CTC临床应用有哪些？
A：目前FDA认证的CTC应用，主要是指通过CellSearch平台的CTC计数来辅助评估转移性乳腺癌、转移性前列腺癌和转移性结直肠癌的疾病进展，主要包含以下几个方面：
1、接受化疗的癌症患者基线的CTC数量（Cut-off值：乳腺癌/前列腺癌是5个CTC/7.5ml血，结直肠癌是3个CTC细胞/7.5ml血），可预测治疗后无进展生存时间和总生存时间，以此作为患者是否需要接受辅助化疗的参考；
2、接受化疗的癌症患者CTC的数量变化，可预测治疗后的无进展生存时间和总生存时间，以此作为肿瘤进展、转移复发风险评估的参考；
3、接受化疗的癌症患者CTC数量，可用于实时反映肿瘤负荷，以此作为肿瘤药物耐药性的监测。
Q3：CTC能否用于肿瘤早期筛查/诊断？
A：有研究探索CTC在肿瘤高危群体中早期筛查/诊断中的应用价值（如肺癌、胰腺癌）。结果提示，在极少数肿瘤高危人群中的确能够检测出CTC，能够很准确地提示肿瘤的发生，并且远早于影像学证据。
CTC在肿瘤早期筛查/诊断中的难点在于：
1、CTC在肿瘤患者外周血中含量很低，在癌前病变或肿瘤早期数目更加稀少。这对应用于肿瘤早期筛查/诊断的CTC检测技术，提出了更高的要求。因此，相关研究较多地采用CTC检出率较高的技术（例如阴性富集策略，微流体检测策略）。而CellSearch平台，较少地在应用于该方向（良性肿瘤检出率基本为0）。
2、CTC应用于肿瘤早筛，较多的基于特定类型肿瘤的高危人群（例如慢性阻塞性肺病和肺癌）开展分析和相应推论。但就检测到CTC所选取的特征值（如数量，CD45抗原阴性，EpCAM阳性，特定肿瘤基因突变等），只能推断这种细胞可能是恶性肿瘤细胞，而不能进一步确诊为何种肿瘤细胞。未来的研究，应进一步完善单细胞水平上肿瘤类型的区别性诊断方案（例如肿瘤特异性抗原染色）。
Q4：CTC能否能够应用于靶向治疗药物的疗效预测及监测？
A：在乳腺癌CTC相关的临床研究中，大部分结果支持CTC计数（Cut-off值为5）在各种亚型（组织学或免疫组织化学诊断，包括Her2阳性，三阴等亚型）中均与病人的预后密切相关。这种相关性与患者选择的治疗方式无关，无论是靶向治疗还是传统化疗。