上传用户：nvbhjbjefk资料价格：5财富值&&『』文档下载 ：『』&&『』所属分类：机构：湖南师范大学生物系基金：湖南省教委“八五”攻关资助分类号：Q930文献出处：关 键 词 ：&&&权力声明：若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请点击。摘要：报道用五种无机盐和有机糖醇作渗透压稳定剂，对草菇、银丝菇、台湾根霉和黑曲霉原生质体分离和再生的影响．分离原生质体以ＫＣｌ、ＮａＣｌ和ＭｇＳＯ４等无机盐渗稳剂较有机糖醇效果好．ＫＣｌ和蔗糖对四种真菌原生质体再生都有较好的效果．就浓度而言，分离原生质体０．６ｍｏｌ／ＬＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、蔗糖和甘露醇对黑曲霉和台湾根霉都是最佳的浓度．草菇和银丝菇以０．４ｍｏｌ／Ｌ蔗糖或０．５ｍｏｌ／ＬＫＣｌ和ＭｇＳＯ４效果较好．渗透压稳定剂的种类和浓度不仅影响原生质体的数量而且影响原生质体的质量．０．６ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ对台湾根霉和黑曲霉原生质体分离有好的效果，而对草菇和银丝菇效果就比较差．０．６ｍｏｌ／ＬＫＣｌ对草菇、银丝菇和台湾根霉原生质体再生有很好的效果，而对黑曲霉效果则相当差．Abstract：Reported that five kinds of inorganic salts and organic sugar alcohol as osmotic stabilizer, impact on mushroom, mushroom, silver Taiwan Rhizopus and Aspergillus niger protoplast isolation and regeneration of protoplast isolation. By KCl, NaCl and MgSO4 of inorganic salt such as osmotic stabilizer is organic sugar alcohol effect.KCl and sucrose have better effect on four kinds of fungal protoplast regeneration. Concentration, protoplast isolation of 0.6mol / LKCl, MgSO4, sucrose and mannitol is the best concentration of Aspergillus niger and Rhizopus. Taiwan mushroom and silver mushroom by 0.4mol / L or 0.5mol / LKCl sucrose and MgSO4 better. Osmotic pressure stabilizers and concentration not only affect protoplast the number and quality of protoplasts of.0.6mol / LN ACl on Taiwan Rhizopus and Aspergillus niger protoplast isolation has good effect, and on Volvariella volvacea and silver mushroom effect is relatively poor.0.6mol LKCl of straw mushroom, mushroom with filigree and Rhizopus Taiwan protoplast regeneration has good effect, and the effect on Aspergillus niger is rather poor.正文快照：丝状真菌原生质体技术的研究（Ⅷ）——渗透压稳定剂对原生质体的影响张志光李东屏邹寿长??方芳⒇（湖南师范大学生物系，长沙，４１００８１）摘要报道用五种无机盐和有机糖醇作渗透压稳定剂，对草菇、银丝菇、台湾根霉和黑曲霉原生质体分离和再生的影响．分离原生质体以分享到：相关文献|502 Bad Gateway
502 Bad Gateway四、原生质体转化
相关工具书解释
如前所述,转化在工业微生物遗传改良及基因工程中占有十分重要的地位。但除少数细菌外,多数微生物的自然转化能力很低,特别是真核微生物几乎很少能发现自然转化。这主要是因为转化的必备条件之一是感受态的存在。经过人工诱导法可使一些微生物获得感受态,已成功的例子如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等并得到广泛应用。但在链霉菌及真菌中,人工诱导法实现完整细胞的转化的成功例子就不多了。原生质体技术出现后不久,Bibb等发现,当有PEG存在...
(本文共668字)
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玉米是目前我国和世界第一大粮食作物,具 长足进步,而玉米由于基因组大、遗传转化难、缺有高产、耐旱等特点,还可以作为动物饲料及工业 乏覆盖全基因组的突变体库等原因,其功能基因原料,在国民经济中有着重要作用。近些年来,随 组学研究则滞后了很多。原生质体瞬时转化技术着植物基因组学的快速发展,许多模式植物如拟 不依赖于稳定的遗传转化,而且可以使外源基因南芥、烟草、水稻等功能基因组学的研究都取得了 在细胞中快速表达,并通过检测目的基因或报告基因的表达情况,可以很好的观察到基因在细胞中的行为,是一种非常适合于玉米基因功能研究 1实验材料与方法的方法11]。由于具有方便、快捷等优点,目前原生质体瞬 1.1实验材料时转化技术已经广泛应用于植物的蛋白亚细胞定玉米自交系Q319种子由本实验室保存,纤位「2—41、启动子分析…7:、蛋白互作[8-1]、信号传 维素酶RIO(cellulase RIO)和离析酶R10导通路[11~131等研究领域。除玉...
(本文共7页)
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枯草杆菌u切n刃isSI如打1…不仅是重要的工业用酶生产菌，能将产生的一些酶分泌至胞外，已成为基因工程重要的宿主菌之一，因而具有十分重要的研究及应用价值l”‘］。将外源基因导人枯草杆菌的方法很多，如感受态细胞转化法、噬菌体感染法、电冲击法、以及原生质体转化法等。已有的研究结果表明，原生质体转化法对实现外源基因在枯草杆菌中的克隆具有十分重要的地位。这是因为用其它方法，如感受态细胞转化法转化枯草杆菌，成功率及转化率都很低［’］。Chang等人［‘］于1979年建立的原生质体转化法，使外源DNA导入枯草杆菌，获得高频率的转化成为可能。迄今为止，Chang的方法仍然是各国研究人员普遍采纳的转化方法。作者在筛选中性蛋白酶基因的研究中，按照Chang的方法，用质粒载体pNQ122与蛋白酶高产菌BSSbtiliSML染色体片段所构建的重组DNA分子转化BSubtilisDB1041’］，多次转化都因转化效率极低而使筛选失败。因此，实现在BSS...
(本文共4页)
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红霉素（Saccharopolysporaerythraea）及其化学结构改造的抗生素药物在临床上具有广泛的应用，红霉素生物合成的过程及相关基因已经比较清晰犤１犦，以红霉素生物合成基因为基础的基因工程已经合成了１００多种新的聚酮化合物犤２犦。红霉素基因工程可分为４个方面，①利用染色体同源重组直接改造红霉素生产菌基因犤３犦；②在S．lividans和S．coelicolor等链霉菌中进行异源表达犤４犦；③利用糖多孢红霉菌突变株和载体进行同源表达犤５犦；④在大肠杆菌中进行表达犤６犦。作者认为，合成具有生物活性红霉素及其衍生物需要多种酶或酶系，在红霉素生产菌中进行基因改造最为有利。只是糖多孢红霉菌的转化相当困难，尽管有原生质体转化犤７，８犦、电击转化犤９犦和接合转移转化犤１０犦，但能够用于同源重组的转化效率都很低。为此，作者在Yamamoto犤７犦和Weber犤８犦原生质体转化的基础上，对糖多孢红霉菌A２２６原生质体转化条件进行了优化...
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关于真菌原生质体转化的抗性筛选
我想了解下丝状真菌原生质体转化后的抗性筛选。我的质粒上含有潮霉素B的抗性基因。
首先是不是要先确定原生质体或菌株对潮霉素B耐受性？怎么做？
然后原生质体转化后如何进行抗性筛选？
我目前找到文献上是先将转化后的原生质体用液体再生培养基培养12-16h后，直接涂布于加有一定浓度的潮霉素B的抗性平板上进行筛选。这种方法怎么样？有没有其他的方法？
谢谢！请问下转化培养基上有没有含有抗生素啊？传代筛选是不是只要等菌株长好接种到新的培养基上生长，看它的表型是否稳定是吗？
传代培养基上的抗生素浓度与筛选的浓度是否要一样？
同学，我现在也在做原生质体转化实验，但是我的实验卡在做原生质体这一步了，我的菌细胞壁多糖较多，你能不能把你做原生质体的经验告诉我啊，或者步骤也行，我参考参考！不甚感激啊:hand:
我们做的是丝状真菌，是用孢子悬液接在玻璃纸上，长出白白的菌丝，不同菌培养时间不一样，木霉的话12个小时，青霉不超过是11个小时，利用裂解酶裂解1.5-2小时，用擦镜纸过滤就行了
同学，我想问一下，做抗生素梯度筛选的时候，直接在含有不同浓度抗生素的板上接孢子？还是接液体菌丝体？
接种玻璃纸，要加液体培养基还是放固体培养基平板表面？我试着放平板表面，最后拿不下来。
我是做顶头孢霉的，转化率再生率都是0，用的双层平板法和山梨醇再生，求解答啊快愁死了。。。
你加我QQ吧，
请教下原生质体制备用的是什么酶啊？转化效率高吗？是否有假阳性？
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维普资讯 ７８ ４ 　Ｌ Ｅ Ｔｒ Ｅ ＲＳ 　 Ｉ Ｎ　 ＢＩ ＯＴ Ｅ Ｃ 　 Ｈ　 Ｏ　 Ｌ Ｌ ｏＧ ＯＧＹ　 　 ｖ。 Ｖ ｏ ｌ 。 ? １ ｌ 　 一 ／ Ｎｏ 一 －。 　 ? ５ ） 　 ｓ ｅ 　 ｐ ? ， 　 ２ ０ ０ ６ ＨＮ生　 物　 技　 术通文章编号： １ ０ ０ ９ — ０ ０ ０ ２ （ ２ ０ ０ ６ ） ０ ５ － ０ ７ ８ ４ — ０ ４ 　综　述　根癌农杆菌在丝状真菌转化 中的应用　杨长 得 ， 刘刚， 郑 易之 ， 邢苗　深 圳 大 学 生命 科 学 学 院 ， 深 圳 市 微 生 物 基 因工程 重 点 实验 室 ， 广 东 深圳 ５ １ ８ ０ ６ ０ 　 ［ 摘要 ］ 　 原 生 质 体 转 化 法 是 丝状 真 菌 转化 的传 统 方 法 ， 但 其 过 程 繁 琐 且 转 化 效 率低 。根 癌 农 杆 菌 介 导 的 转 化 方 法原 本 是 进　 行植 物遗 传 转 化 的标 准 方 法 ， 但 近 年 来 发 现 该 方 法 还 可 用 于 丝状 真 菌 的 转化 。 根癌 农 杆 菌介 导 的 丝状 真 菌 转 化 具 有 操作 简 　 便、 转化效率高、 重 复性 好 等 优 点 ， 从 而 可 以解 决 丝 状 真 菌 转 化难 的 问题 。在 本 文 中 ， 就 其 转 化机 制 、 特点和转化条件优化等 　方 面 的 最 新研 究进 展 进 行 了综 述 。 　［ 关键词 ］ 　 根癌农杆菌； 丝状真菌； 转化 ； 　 Ｄ Ｎ Ａ 　［ 中 图分 类 号 ］ Ｑ ９ ３ ３ ， 　［ 文献 标 识 码 ］ Ａ 　Ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　 Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　 ｔ ｕ ｍｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ 　 ｉ ｎ 　 Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　 Ｆ ｉ ｌ ａ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｕ ｓ 　 Ｆ ｕ ｎ ｇ ｉ 　ＹＡＮＧ　Ｃｈ ａ ｎ ｇ－ Ｄｅ ，Ｌ Ｉ Ｕ　Ｇａ ｎｇ ，Ｚ ＨＥＮＧ　Ｙｉ — Ｚｈ ｉ ，ＸＩ ＮＧ　 Ｍｉ ａ ｏ 　Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ 　 Ｋｅ ｙ 　 Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ 　 ｏ ｆ 　 Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ａ ｌ 　 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ 　 Ｅｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ，Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ 　 ｏ ｆ 　 Ｌ ｉ ｆ ｅ 　 Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ 　 Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ 　 Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， 　Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ 　 ５ １ ８ ０ ６ ０ ，Ｃｈ ｉ ｎ ａ 　［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｏ ｐ ｌ ｓｔ ａ 　 ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｉ ｓ 　 ｔ ｈ ｅ 　 ｔ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ 　 ｍｅ ｈｏ ｔ ｄ 　 ｆ ｏ ｒ 　 ｉ ｆ ｌ ａ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｕ ｓ 　 ｆ ｕ ｎ ｇ ｉ 　 ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ，ｂ ｕ ｔ 　 ｉ ｔ 　 ｉ ｓ 　 ｔ ｅ ｄ ｉ ｏ ｕ ｓ 　 ａ ｎ ｄ 　ｓ ｈ Ｏ Ｗ Ｓ 　 ｌ Ｏ Ｗ 　 ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｃ ｙ ． 　Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ｍｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ 　 ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　 ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｉ Ｓ 　 ｔ ｌ ｌ ｅ 　 ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｒ ｄ 　 ｍｅ ｔ ｌ ｌ ｏ ｄ 　 ｏ ｆ ｒ 　 ｔ ｈ ｅ 　 ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　ｐ ｌ ａ ｎ ｔ 　 ｃ ｅ ｉ ｌ ，ａ ｎ ｄ 　 ｒ ｅ ｃ ｅ ｎ ｌ ｔ ｙ 　 ｉ ｔ 　 ｗ ａ ｓ 　 ａ ｐ ｐ ｈ ｅ ｄ 　 ｉ ｎ 　 ｉ ｆ ｌ ａ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｕ ｓ 　 ｕｎ ｆ ｉ ｇ 　 ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ． Ｃ ｏ ｍ ｐ ａ ｒ ｅ ｄ 　 ｗ ｉ ｈ ｔ 　 ｈｅ ｔ 　 ｐ ｒ ｏ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｔ 　 ｍｅ ｈｏ ｔ ｄ ，ｉ ｔ 　 ｉ ｓ 　 ｌ ｅ ｓ ｓ 　ｔ ｅ ｄ ｉ ｏ ｕ ｓ ，ｍｏ ｒ ｅ 　ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｔ ，ａ ｎ ｄ 　 ｉｔ ｗ ｈ　ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｒ 　 ｒ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ，ａ ｎｄ 　 ｉ ｔ ｓ 　ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｈ ｓ　 ａ ａ ｄ ｄ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ 　 ｈｅ ｔ 　ｐ ｒ ｏ ｂ ｌ ｅ ｍ　 ｉ ｎ 　 ｉ ｆ ｌ ａ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｕ ｓ 　 ｆ ｕ ｎ ｇ ｉ 　ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ．Ｈ ｅ ｒ ｅ 　 ｔ ｌ ｌ ｅ 　 ｒ ｅ ｃ ｅ ｎ ｔ 　 ａ ｄ ｖ ａ ｎ ｃ ｅ ｓ 　 ｉ ｎ 　 ｔ ｌ ｌ ｅ 　 ｍ ｅ ｃ ｈ ａ ｎ ｉ ｓ ｍｓ ， ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｓ， ｒ ｎｄ ａ 　 Ｃ Ｏ ｎ ｄ Ｉ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ 　 ｏ ｆ 　 Ａ ． ｔ ｕ ｍ ｅ ｉ ｆ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ — ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　 ｆ ｉ ｌ ａ ｍ ｅ ｎ — 　ｔ ｏ ｕ ｓ 　 ｆ ｕ ｎ ｇ ｕ ｓ 　 ｒ ｔ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｍ ａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｗｅ ｒ ｅ 　 ｅｖ ｒ ｉ ｅ ｗ ｅ ｄ ． 　［ Ｋｅ ｙ 　 ｗ ｏ ｒ ｄ ｓ ］ 　Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｉ ｆ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ；ｆ ｉ ｌ ａ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｕ ｓ 　 ｆ ｕ ｎ ｕｓ ｇ ； ｒ ｔ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ；Ｔ － Ｄ Ｎ Ａ 　丝 状真菌 （ ｉ ｆ ｌ ｍｅ ａ ｎ ｔ ｏ ｕ ｓ 　 ｕｎ ｆ ｉ） ｇ 是 一类重要 的微 生物 ， 可 以 用　 于抗 生 素 、 酶制剂和精细化工产 品的生产 ， 同 时也 在 生 物 圈 的物　根 癌 农 杆 菌 介 导 的方 法成 功 地 实 现 了丝 状 真 菌 的 遗 传 转 化【 ３ 】 。这　 些 开 创 性 的工 作 将 Ａ ＭＴ应 用 于 除 了植 物 以 外 的其 他 宿 主 ， 并 为　 丝 状 真 菌 的 遗 传 转 化 开 辟 了 一 条 全 新 而 有 效 的 途 径 。 根 据　 Ｍｉ ｃ ｈ ｉ ｅ ｓ ｅ 等 的统 计 ， 目前 通 过 该 方 法 实 现 转 化 的 丝 状 真 菌 已有　质循 环 和 生 态 环 境 的 演 变 中 发 挥 作 用 。随 着 生命 科 学 的飞 速 发　展 ，对 丝 状 真 菌 进 行 遗 传 工 程 改 造 已成 为 提 高 丝 状 真 菌 生 产 能　 力 的 必 要 手 段 ，对 这 类 微 生 物 进 行 分 子 生物 学 的 研 究 也 是 深 入　６ ｏ 余 种　。随 着 方 法 的 不 断完 善 ， 根 癌 农 杆 菌 将 在 丝 状 真 菌 的转　化 中得 到越 来 越 广 泛 的应 用 。 　了解其生理 、 生化特性以及它们与动植物相互关 系的前提 ， 而 这　些 研 究 都 需 要 进 行 丝 状 真 菌 的转 化 。 传 统 的 丝 状 真菌 转 化 方 法　 是 原 生 质 体 转 化 法 。该 方法 通 过 制 备 原 生 质 体 ， 在Ｃ ａ Ｃ １ ： 、 Ｐ Ｅ Ｇ等　 的作 用 下使 外 源 Ｄ Ｎ Ａ进入细胞而实现转化Ｉ ｌ １ 。原 生 质 体 的 制 备　 和 再 生 费力 费 时 ，而 且 利 用 原 生 质 体 进 行 丝 状 真 菌 转 化 的 重 复　 性 和转 化效 率 往 往 难 以 满 足 要 求 。根 癌 农 杆 菌介 导 的 转 化 方 法　１ 　 根癌 农杆 菌 介导 丝状真 菌转 化 的机 制　１ ． １ 诱 导 机 制　Ａ Ｍ Ｔ是 通 过 Ｔ ｉ 质 粒 的毒 力 （ ｖ ｉ ｒ ｕ ｌ ｅ ｎ ｃ ｅ ） 区域 编 码 的多 种 蛋 白 　（ Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ｍｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ 　 ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　 ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ａ Ｍ Ｔ）因克　服 了原 生 质 体 转 化 法 过 程 繁 琐 、 转化效率低 、 重 复 性 差 等 缺 点 而　受到重视。 　的共 同作 用 来 完 成 的 。该 过 程 受 乙 酰 丁 香 酮 （ ａ ｃ ｅ ｔ ｏ ｓ ｙ ｉ ｒ ｎ ｇ ｏ ｎ ｅ ， Ａ Ｓ ） 　 等 酚类 化 合 物 和 阿 拉 伯 糖 、木 糖 等 单 糖 的诱 导 。该 区域 编 码 的　Ｖｉ ｒ Ａ、 Ｖ ｉ ｒ Ｇ蛋 白和 染色体 编码 的 Ｃ ｈ ｖ Ｅ蛋 白 为 此 过 程 的 调 控 蛋　 白。 在诱 导物 Ａ Ｓ的作 用 下 ， Ｖ ｉ ｒ Ａ 通 过 自我磷 酸化 而活 化 ， 活 化 的　 Ｖ ｉ ｒ Ａ可 以通 过 磷 酸 化使 Ｖ ｉ 　 活化 。 后 者作 为转 录 因子 结 合 在 毒　 力 区域 的特 定 部 位 ，引起 与 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ转 移有 关 的 操 纵 子 如 ｖ ｉ ｒ Ｂ、 　根 癌 农 杆 菌 是 一 种 革 兰 阴性 土 壤 杆 菌 ，它 能 够 在 植 物 的 受　 伤部位侵染植物细胞 ， 将其 Ｔ ｉ 质粒（ ｔ ｕ ｍ ｏ ｒ 　 ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ 　 ｐ ｌ ａ ｍ ｉ ｄ， 肿 瘤　诱 导质 粒 ） 上的Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ（ ｒ ｔ ｎｓ ａ ｆ ｅ ｒ 　 Ｄ Ｎ Ａ， 转化 Ｄ Ｎ Ａ） 转 入 植 物 细 胞　并 整合 到 植 物 的基 因组 ， 最终 导致 植 物 肿 瘤 的发 生 。因 为 这 一机　 制， 根癌农杆菌及其 Ｔ ｉ 质粒 被 用 来 进 行 植 物 细 胞 的 转 化 ， 而且 一　ｖ ｉ ｒ Ｃ、 ｖ ｉ ｒ Ｄ、 ｖ ｉ ｒ Ｅ、 ｖ ｉ ｒ Ｆ、 ｖ ｉ ｒ ｌ ｆ等 的表 达 。 Ｃ ｈ ｖ Ｅ 在 某 些 单 糖 的 作 用 下　［ 收稿 日期 ］２ ０ ０ ６ — ０ １ — ０ ６ 　 ［ 基金项 目］国家 自然科学基金项 目（ ２ ０ ２ ０ ６ ０ １ ７ ） 　 ［ 作者简介 ］杨长得 （ １ ９ ８ １ －） ， 男， 硕士研究生　 ［ 通讯作者 ］刘刚 ， （ Ｅ － ｍａ ｉ ｌ ） ｚ ｊ ｕ ｌ ｉ ｕ ｇ ＠ｓ ｚ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ 　直 沿用 至今 。 Ｂ ｕ ｎ ｄ ｏ ｃ ｋ等 首 次采 用 根 癌 农 杆 菌 介 导 的 方 法 进 行 了　酿 酒 酵母 （ Ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｏ ｍ ｙ ｃ ｅ ｓ 　 ｃ ｅ ｒ ｅ ｖ ｉ ｓ ｉ ａ ｅ ） 的 转 化　； ｄ ｅ 　 Ｇ ｒ ｏ ｏ ｔ 等 也 利 用　维普资讯 杨长得等 ： 根 癌 农 杆 菌 在 丝 状 真 菌 转 化 中 的 应 用　 被 激活 ， 从而 与 Ｖ ｉ ｒ Ａ发生相互 作用 ， 而使 Ｖ ｉ ｒ Ａ对 Ａ Ｓ的 诱 导 更　加 敏感　。 　 １ ． ２ 单 链　 ｒ － Ｄ Ｎ Ａ 的 产 生　２ ． ２ 转 化 效 率 高　７ ８ ５ 　对 于 大 多数 种 类 的 丝 状 真 菌 而 言 ， Ａ ＭＴ法 比其 他 转 化 方 法　 的 效 率 高 得 多 。ｄ ｅ 　 Ｇ ｒ ｏ ｏ ｔ 等分别用 Ａ ＭＴ法 和 Ｃ ａ Ｃ １ ２ － Ｐ Ｅ Ｇ 介 导 的　 原 生 质 体 转 化 法 进 行 了 泡盛 曲 霉 （ Ａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ 　 ａ ｗ ａ ｍ ｏ ｒ ｉ ） 的转 化四， 　 结果 Ａ ＭＴ的转 化 效 率 比原 生 质 体 法 的 转 化 效 率 高 ６ ０ ０倍 。采 用　这 ２种 方 法 对 球 孢 白僵 菌 （ Ｂ ｅ ａ ｕ ｖ ｅ ｒ ｉ ａ 　 ｂ ａ ｓ ｓ ｉ ａ ｎ ａ ） ｔ 　 、球 毛 壳 菌　Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 以 单链 的 形 式 进 入 受 体 细 胞 ， ｖ ｉ ｒ Ｃ和 ｖ ｉ ｒ Ｄ 操 纵 子 的　几 种 编 码 产 物 与 单链 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 的 形 成 有 关 。农 杆 菌 Ｔ ｉ 质粒上 Ｔ — 　Ｄ Ｎ Ａ的两侧为 ２ ４ 　 ｂ ｐ的边 界 序 列 （ ｉ ｒ ｇ ｈ ｔ 　 Ｔ — ｂ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ， Ｒ Ｂ，右 侧 边　界； ｌ ｅ ｆ ｔ 　 Ｔ — ｂ ｏ ｄｅ ｒ ｒ ， Ｌ Ｂ，左侧 边 界 ） 。ｖ ｉ ｒ Ｄ操纵子编 码 的 Ｖ ｉ ｒ Ｄ １和　 Ｖ ｉ ｒ Ｄ ２能 识别 这 ２个 边 界 序 列 ， 并 在 其 中一 条 链 上 左 右 边 界 序 列　 的特 异 位 点 进 行 切 割 产 生 缺 口 。 Ｄ Ｎ Ａ复制酶在 Ｒ Ｂ 的缺 口处 进　 行Ｄ Ｎ Ａ 的复 制 ， 当进 行 到 Ｌ Ｂ的 缺 口处 时使 完 整 的　 ｒ － Ｄ Ｎ Ａ 单 链　（ Ｃ ｈ ａ ｅ ｔ ｏ ｍ ｉ ｕ ｍ　 ｇ ｌ ｏ ｂ ｏ ｓ ｕ ｍ） ［ １ ８ １ 、 哈茨 木 霉 （ Ｔ ｒ ／ ｃ ｈ ｏ ｄ ｅ 　ｈ ａ ｒ ｚ ｉ ａ ｎ ｕ ｍ） ［ １ ９ １ 　进 行 转 化 也 得 到 了 类 似 的结 果 ， 即Ａ ＭＴ效 率 显 著 地 高 于 原 生 质　体 转 化 法 。Ｒ ｏ ｄ ｒ ｉ ｇ ｕ ｅ ｚ — Ｔ ｏ ｖ ａ ｒ 等 使 用 不 同 的 方 法 进 行 了 彩 色 豆 马　 勃（ 　 ｏ ｌ ｉ ｔ ｈ ｕ ｓ 　 ｔ ｉ ｎ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ｕ ｓ ） 转化［ ２ Ｏ ｌ ， 结果 Ａ ＭＴ效 率 比 基 因枪 法 的转　释 放『 句 。Ｖ ｉ ｒ Ｄ ２与切 下 的单 链 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ的５ 　 端进行共价结合 ， 并 在　后续 的步 骤 中通 过其 Ｃ端 的核定 位 序列 （ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ａ ｒ 　 ｌ ｏ ｃ ａ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　化 效 率 高 ５倍 。Ｃ ｈ ｉ ｒ ｓ ｔ ｏ ｐ ｈ ｅ ｒ 等 的实 验 也 表 明 Ａ ＭＴ效率 显著 地 高　于利 用 限 制 酶 介 导 （ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｉ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ 　 ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　 ｉ ｎ ｔ ｅ ｇ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ｒ Ｅ — 　ｓ ｉ ｇ ｎ ｌ， ａ Ｎ Ｌ Ｓ ）在 进 入 真 菌 细 胞 后 将 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ单 链 带 入 其 细 胞 核 【 句 。 　ｖ ｉ ｒ Ｃ操 纵 子 的 编 码产 物 Ｖ ｉ ｒ Ｃ１ 特异性地结合在 Ｒ Ｂ外 侧 的 ２ ４ 　 ｂ ｐ 　“ＭＩ ） 的 转 化 效率 叫。 　２ ． ３ 　 ｒ － Ｄ Ｎ Ａ 以 单拷 贝 的形 式 整合　ｏ ｖ ｅ ｄｒ ｒ ｉ ｖ ｅ ｒ ” 序列 ， 并 可 以增 加 单 链 Ｔ － Ｄ Ｎ Ａ 的产 生 效 率　 。 　 单链 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ转 移 包 括 穿过 农 杆 菌 的 细 胞 包 被 、 进 入 受 体 细　根癌农杆 菌介导 的丝状真 菌转化通 常使 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 以单 拷 贝　 的形 式 整 合 到 受 体 菌 的 染 色 体上 ，这 种 整 合 既 可 能 是 同源 整 合　 也 可 能 是 非 同源 整 合 ， 取决于 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 中是 否 含 与 受 体 菌 基 因组　 Ｄ Ｎ Ａ 同 源 的 序 列 。Ｂ ｕ ｎ ｄ ｏ ｃ ｋ ［ Ｚ Ｚ ￣ 等 采 用 含 酵 母 染 色 体 同 源 序 列 的　Ｔ— Ｄ Ｎ Ａ对 酿 酒 酵 母 和 粟 酒 裂 殖 酵 母 （ Ｓ ｃ ｈ ｉ ｚ ｏ ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｏ ｍ ｙ ｃ ｅ ｓ 　１ ． ３ 单链　 ｒ － ＤＮＡ 的 转 移　胞 和进 入 受 体 细 胞 核 等 过 程 ， 相 当复 杂 。该 过 程 所 涉 及 的 蛋 白也　 非常多 ， 如ｖ ｉ ｒ Ｂ操 纵 子编 码 的 一 系 列 蛋 白 、 ｖ ｉ ｒ Ｅ操 纵 子 编 码 的 几　 种蛋 白、 Ｖｉ ｒ Ｄ ４以 及 宿 主 自身 编 码 的 一 些 蛋 白 １ ４ ． ｓ ￣ 。Ｖ ｉ ｒ Ｄ ２和 Ｔ — 　 Ｄ Ｎ Ａ单 链 的 复 合 物 通过 Ⅳ型 分 泌 机 制 穿过 根 癌 农 杆 菌 的 细胞 包　被 。由 Ｖ ｉ ｒ Ｂ ６ 、 Ｖ ｉ ｒ Ｂ ７ 、 Ｖ ｉ ｒ Ｂ ８ 、 Ｖ ｉ ｒ Ｂ ９ 、 Ｖ ｉ ｒ Ｂ ｌ Ｏ 、 Ｖ ｉ ｒ Ｂ ｌ ｌ 和 Ｖ ｉ ｒ Ｄ ４在 细　ｐ ｏ ｍ ｂ ｅ ） 分 别 进 行 了转 化 ， 发现 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ通 过 双 交 换 或 单 交 换 以同　 源 重 组 的 方 式 整 合 到 酵 母 的基 因组 。 相 对 于 酿 酒 酵母 和 粟 酒 裂　 殖酵母 ， 使 用常规 转化 方法时 ， 乳 酸克 鲁维酵母 （ Ｋ ｌ ｕ ｙ ｖ ｅ ｒ ｏ ｍ ｙ ｃ ｅ ｓ 　 ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｓ ） 较 难 通 过 同源 重 组 实 现基 因 的定 点插 入 。但 在使 用农 杆 菌　 介 导 转 化 时 ，通 过 同 源 重组 实现 基 因 定 点 插 入 的 效 率 非 常 高 ｌ ＂ ２ ２ １ 。 　 当使 用 的 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ无 宿 主 菌 染 色 体 Ｄ Ｎ Ａ 的 同 源 序 列 时 ，发 生 的　 是 非 同源 重 组 ， Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ被随机地整合 到染色体上Ｉ ２ ３ １ 。以 Ａ ＭＴ法　 进 行 丝 状 真 菌 的 转 化 ，所 得 到 的大 多数 转 化 子 中 只含 有 单 拷 贝　 的　 ｒ — Ｄ Ｎ Ａ 插 入序 列 ， 较 少 存 在 多拷 贝整 合 的情 况 。如 以 Ａ Ｍ Ｔ法　 转 化尖孢 镰 刀菌 （ Ｆ ｕ ￣ ａ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｏ ｘ ｙ ｓ ｐ ｏ ｒ ｕ ｍ） ｔ 　 ４ １ 、 　 瓜 炭疽 病 菌 （ Ｃ ｏ １ ． 　 １ ｅ ｔ ｏ ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｕ ｍ 　 ｌ ａ ｇ ｅ ｎ ａ ｒ ｉ ｕ ｍ） 【 　、 盾壳霉（ Ｃ ｏ ｎ ｉ ｏ ｔ ｈ ｙ ｒ ｉ ｕ ｒ ｎ 　 ｍ ｉ ｎ ｈ ａ ｎ ｓ ） 啪等 ， 　 超过 ８ Ｏ ％的转 化 子 中 　 ｒ － Ｄ Ｎ Ａ是 以单 拷 贝 的形 式 整 合 的 。 以Ａ ＭＴ 　法转化酵母红麴 菌（ Ｍｏ ｎ ａ ｓ ｃ ｕ ｓ 　 ｐ ｕ ｒ ｐ ｕ ｒ ｅ ｕ ｓ ） 时， Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 几 乎 以全 部　胞 包 被处 形 成 一个 跨 细胞 内膜 和 细胞 外 膜 的复 合 物 。该 复 合 物　有孔 ， Ｖ ｉ ｒ Ｄ ４和　 ｒ － Ｄ Ｎ Ａ 的 复合 物 以及 与　 卜Ｄ Ｎ Ａ 转 移 有 关 的 其 他　 蛋 白如 Ｖ ｉ ｒ Ｅ ２ 、 Ｖ ｉ ｒ Ｅ ３ 、 Ｖ ｉ ｒ Ｆ等 通 过 这 个 孔 分 泌 到 细 胞 外 嘲 。Ｖ ｉ ｒ Ｅ ２ 　 是一种单链 Ｄ Ｎ Ａ 结 合 蛋 白 ，在 整 个 转 运 过 程 中 与 单 链 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 　 结合而避免后者被核酸酶降解［ ４ １ 。 单链 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 复 合 物 进 入 受体　 细 胞 的机 制 Ｅ ｔ 前 尚不 清 楚 ，但 对 由受 体 细 胞 质 向 细 胞 核 的 转 移　机 制 已有 了 一 些初 步 的认 识 。至 少 有 ２种 蛋 白引 导 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 进 入　受 体 细胞 核 。Ｖ ｉ ｒ Ｄ ２含 有 Ｎ Ｌ Ｓ ，可 以 与 宿 主细 胞 的 仅核 周 蛋 白 　 （ ｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｐ ｈ ｅ ｒ ｉｎ ） 发 生 作 用 而 被 转 移 到 细胞 核『 】 Ｏ ｌ 。 Ｖ ｉ ｒ Ｅ ３可 以 与 Ｖ ｉ ｒ Ｅ ２ 　 发生相互作用 ， 从而可以与 Ｖ ｉ ｒ Ｅ ２和 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 的 复 合 物 一 起 被 转　 移 到 受体 细胞 。 同时 ， Ｖ ｉ ｒ Ｅ ３还 可 以 和 受 体 细 胞 中 的 仅核 周 蛋 白 　单拷贝 （ ９ ０ ％以 上 ） 的形 式 整 合 到 受 体 菌 的 基 因 组 中阎。 使用 Ａ ＭＴ 　实 现 丝 状 真 菌 的 单 拷 贝 转 化 非 常 有 利 于进 行 功 能 基 因 的标 记 以　及 标 记 基 因 的分 离 。 　结 合 而 通 过 依 赖 于 仅 核周 蛋 白 的途 径 被 转 运 到 受 体 细 胞 核 中 ， 　从而引导 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 复合 物 进 入 细 胞 核 『 ｌ 】 １ 。Ｖ ｉ ｒ Ｆ的功 能 还 没 有 完 全　 弄清楚 ， 但对某些细胞的转化是必需 的， 其 作 用 可 能 是 通 过 泛 素　 样蛋 白（ ｕ ｂ ｉ ｑ ｕ ｉ ｔ ｉ ｎ ） 途 径使 某些 特异 的宿 主蛋 白死 亡Ｉ 】 ２ １ 。 　３ 转化 条件　３ ． １ 农 杆 菌 菌株 的 选 择　２ 根 癌农 杆菌 介导 丝状真 菌 转化 的特 点　２ ． １ 受 体 的 形 式 多样　迄 今 ， 国 内外 已 有数 十个 研 究 小 组 使 用 根 癌农 杆 菌 进 行 了　菌 丝 状 真 菌 的转 化 。 他 们 所 使 用 的 农 杆 菌 菌株 和 转 化 的丝 状 真　菌各不 相同 ， 在　 ｒ － Ｄ Ｎ Ａ 中所 加 的调 控 元 件 和 选 择 性 标 记 也 有 差　 异 。但 对 这 些 研 究 结 果 进 行 粗 略 的 统 计 ， 仍 能反 映不 同菌 株 对 转　传统 的丝状真菌转化方法如原生质体转化法 、 电激 法 、 脂 质　体 转 化 法 的 转 化 受 体 一 般 都 是 原 生 质 体 。 原 生 质 体 的制 备 和 再　生繁琐 、 费时 ， 而 且 受 多 种 因素 的影 响 ， 再生率低 ， 重 复 性 差 。 根　 癌 农 杆 菌 介 导 的 丝 状 真 菌 转 化 可 以使 用 多 种 形 式 的 受 体 细 胞 ， 　 如原 生质体 、 分生孢子 、 萌 发 的孢 子 、 菌 丝乃至蘑 菇子实体『 １ ］ ～ ６ ３ ， 　化 效率 的 影 响 。 从 被 使 用 的 频 度 、 转 化 效 率 等 角度 综 合 评 价 ， 应　该是 Ａ Ｇ Ｌ 一 １菌 株 的 转 化 效 果 最 好 ， 但 在 特 定 的情 况 下 其 他 菌 株　 也 能 达 到 较 高 的 转化 效 率 。使 用 Ａ Ｇ Ｌ 一 １菌 株进 行 不 同丝 状 真 菌　 转化的结果列于表 ｌ ， 在 所 有 发 表 的 文 献 中 该 菌 株 介 导 的转 化 都　因 此 根 癌 农 杆 菌 介 导 的 丝 状 真 菌 转 化 可 以避 免 制 备 原 生 质 体 ， 　 减 少 影 响转 化过 程 的 因 素 。 一 般 而 言 ， 进行 Ａ ＭＴ时 较 多 使 用 的　受 体 形 式 是 孢 子 或 萌 发 的 孢 子 ，但 也 应 注 意 不 同 丝 状 真 菌 之 间　 的 差别 。有 的种 使 用 孢 子 或 萌 发 的 孢 子 效 果较 好 ， 但 少 数 的 种 可　 能 使 用 菌 丝 或 原 生质 体 的效 果 较 好 。 　取 得 了较 好 的结 果 ，但 因 丝 状 真 菌 的 不 同转 化 效 率 存 在 一 定 的　差异 。 　３ ． ２ 共 培 养 时 间　共 培 养 时 间 的长 短 与 转 化 密 切 相关 ，因 为 根 癌农 杆菌 的 Ｔ 一 　维普资讯 ７ ８ ６ 　Ｌ Ｅ 　Ｉ Ｅ　 　ＲＳ 　 Ｉ Ｎ ＢＩ Ｏ Ｔ ＥＣＨＮＯＬ ＯＧＹ技术通讯… Ｖ ｏ １ ． ? １ ｌ ７ ， 　一 Ｎ ｏ ． ５ ） 　 ｓ ｅ 　 ｐ ． ? ＇２ ，ｚ ０ ｕ ０ ｕ ６ ｂ 　Ｄ Ｎ Ａ转移与整合需要一定的时间 。适 当延长共培养 时间能提高　转化频率 。 Ｍｕ ｌ ｌ ｉ ｎ ｓ 等 在尖 孢 镰 刀菌 、 禾 生 炭 疽菌 （ Ｃ ． ｇ ｒ ａ ｍｉ ｎ ｉ ｃ ｏ ｌ ａ ） 、 　４ 展 望　根 癌 农 杆 菌 介 导 的 丝状 真菌 转 化 可 以 应 用 于 不 同 类 型 的受　 体细胞 ， 如原生质体 、 分生孢子 、 萌 发的孢子 、 菌 丝体 等 ， 适 应 面　非 常 广 。当采 用 的 受 体 细 胞 的类 型 为 分 生孢 子 、 萌 发 的 孢 子 或菌　稻瘟病菌 （ Ｍａ ｇ ｎ ａ ｐ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ 　 ｇ ｒ ｉ ￣ ｅ ａ ） 、 哈茨木霉 、 白僵 菌 等 转 化 实 验 中 　 研 究 了 共 培 养 期 长 短 与 转 化 效 率 的关 系 ，发 现 转 化 子 的 数 量 随　着 时 间 的 延 长 而 不 断增 加 【 ｌ ４ ２ ７ ２ ９ １ 。但 共 培 养 时 间 过 长 时 ， 产 生假 阳 　性 的抗 性 菌 落 的概 率 也 高 ， 分离 、 筛 选 阳性 转 化 子 的 难 度 也 随之　 加 大 。因此 在 确 定 共 培 养 时 间 时 ， 既 要 保 证 能 形 成 足 够 数 量 的 转　化子 ， 又 要 避 免 共 培养 时 间 过 长 而 产 生 过 多 的假 阳性 转 化 菌 落 。 　 根据 多数 学 者 的 研 究 结 果 ， 采用 Ａ Ｔ Ｍ 进 行 丝状 真 菌 的转 化 时 共　 培 养 时 间 一般 为 ４ ８ 　 ｈ 。 　表 １ 根癌 农杆 菌 菌 株 Ａ ＧＬ 一 １ 对 不 同 丝状 真 菌 的 转 化 效 率　丝体 时 ，则 可 以 避 免 传 统 丝 状 真 菌 转 化 方 法 必 须 进 行 的原 生 质　 体 制 备 和再 生环 节 。 相 对 于 传 统 的 原 生 质 转 化 法　 Ａ Ｍ Ｔ操 作 较 简　单， 而 且转 化 效 率 和 重 复 性 有 显 著 的 提 高 。 由 于这 些 特 点 ， Ａ Ｍ Ｔ 　在 丝 状 真 菌转 化 中 的应 用 将 越 来 越 普 遍 。 　 当Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ中 含有 与 受体 菌 染 色体 Ｄ Ｎ Ａ 同源 的序 列 时 ， 　 Ａ Ｍ Ｔ可 以使 两 者 发 生 同 源 重 组 。 当 插 入 片 段 的两 侧 都 含 有 同源　 序 列时 ， 则会发生双交换 ， 从 而 出现 较 高 比例 的 基 因替 换 。这 个　 特点使 Ａ ＭＴ成 为 一 种 可 对 目的 基 因进 行 敲 除 或 替 换 的 有 效 手　 段 。当 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ不 含 有 与 受 体 菌 染 色 体 Ｄ Ｎ Ａ 同源 的序 列 时 ， Ａ Ｍ Ｔ 　 可以使 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 序 列 随 机 地 插 入 到受 体菌 的 染 色 体 Ｄ Ｎ Ａ 上 。 这　一特点使 Ａ Ｍ Ｔ成 为 进 行 丝 状 真 菌 基 因 插 入 突 变 的 一 种 有 效 方　法 。采 用 Ａ ＭＴ方 法 对 功 能 基 因进 行 插 入 突 变 后 ， 可 以通 过 “ 质 粒　 拯救 （ ｐ ｌ ａ ｍ ｉ ｄ 　 ｌ ￣ Ｓ Ｕ Ｃ ｅ ） ” 法和Ｔ Ａ Ｉ Ｌ — Ｐ Ｃ Ｒ技术【 ３ ３ ． ３ ４ １ 快 速 分 离 标 记 的　 基 因， 在 丝 状 真菌 功 能基 因 的克 隆 和分 析 中非 常 有 用 。 　３ ＿ ３ 共 培 养 温度　参考 文献　［ １ 】 Ｍｅ ｙ ｅ ｒ 　 Ｖ， Ｍｕ ｅ ｌ ｌ ｅ ｒ 　 Ｄ ， Ｓ ｔ ｍｗ ｉ ｇ 　 Ｔ ，ｅ ｔ 　 １． ０ 　Ｃ ｏ ｍ ｐ ａ ｒ ｉ ｓ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　 ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ 　 ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ 　 ｆ ｏ ｒ 　 Ａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ Ｕ ｕ ｓ 　ｇ ｉ ｇ ａ ｎ ｔ ｅ ｕ ｓ［ Ｊ 】 ． 　 Ｃ ｕ ｒ ｔ 　 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ， 　２ ０ ０３ ， ４３ ： ３ ７１ 　共 培 养 温 度 对 转 化 效 率 也 有 一 定 的 影 响 。 可 实 现 丝状 真 菌　 转化 的温 度范 围为 ２ ０ ｏ Ｃ － ３ ７ ｏ Ｃ，而 最 合 适 的 转 化 温 度 为 ２ １ ℃～ 　 ２ ５ ℃， 如 盛泡 曲霉 （ Ａ． ａ ｗ ａ ｍ ｏ ｒ ｉ ） ∞、 瓜炭疽病菌【 　、 灰 葡 萄 孢 菌　（ Ｂ ｏ ｔ ｒ ｙ ｉ ｓ 　 ｃ ｉ ｎ ｅ ｒ ｅ ａ ） ［ ３ 。 １ 、 Ｈ ｅ ｂ ｅ ｌ ｏ ｍ ａ 　 ｃ ｙ ｌ ｉ ｎ ｄ ｒ ｏ ｓ ｐ ｏ ｒ ｕ ｍＬ ３ ２ ￣ 等 丝 状 真 菌 转 化　的最 佳 温 度 分 别 是 ２ ２ ． ５ ｏ Ｃ － ２ ５ ｏ Ｃ、 ２ １ ｏ Ｃ ￣ ２ ４ ￣ Ｃ 、 ２ ２ ｏ Ｃ 和２ ３ ｏ Ｃ 。 Ｃ ｏ ｍ ｂ ｉ ｅ ｒ 　 等认 为 ， 对 转 化 起 关 键 作 用 的 根癌 农 杆 菌 ｖ ｉ ｒ 基 因 需 要 在 一 定 温　 度 范 围 内才 能 得 到 表 达 ， 温度 过 高 或 者 过 低 ， 这 些 基 因 的表 达 效　 率都会变低 ， 可能使 Ｔ — ＤＮ Ａ 的 转移 受 阻 。综 合 文献 报道 ， 多 种 丝　状 真 菌 转 化 的最 佳 温 度 相 差 不 大 。 　 ３ ． ４ 农 杆 菌和 受体 茵 的 比 例 　［ ２ ］ Ｂ ｕ ｎ ｄ ｏ ｃ ｋ 　 Ｐ ，ｄ ｅ ｎ 　 Ｄ ｕ ｌ ｋ — Ｒ ａ ｓ 　 Ａ ，Ｂ ｅ ｉ ｊ ｅ ｒ ｓ ｂ ｅ ｒ ｇ ｅ ｎ 　 Ａ ，ｅ ｌ 　 ｏ １ ．Ｔ ｒ ｎｓ ａ － ｋ ｉ ｎ ｇ — 　ｄ ｏ ｍ　 Ｔ— Ｄ Ｎ Ａ 　ｔ ｒ ｎｓ ａ ￣ｒ 　ｆ ｒ ｏ ｍ 　 Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　ｔ ｕ ｍ ｅ ｉ ｆ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ 　ｔ ｏ 　Ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ － 　ｒ ｏ ｍ ｙ ｃ ｅ ｓ 　 ｃ ｅ ｒ ｅ ｖ ｉ ｓ ｉ ａ ｅ 忉 ．Ｅ ＭＢ Ｏ 　 Ｊ ，１ ９ ９ ５ ， １ ４ （ １ ３ ） ： ３ ２ ０ ６ 　 ［ ３ ］ ｄ ｅ 　Ｇ ｒ ｏｔ 　ＭＪ Ａ， Ｂ ｕ ｎ ｄ ｏ ｃ ｋ 　 Ｐ ， Ｈｏ ｏｙ ｋ ａ ａ ｓ 　Ｐ Ｊ ，ｅ ｔ 　０ １． Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　ｔ ｕ ｍｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ － ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　 ｒ ｔ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　 ｉ ｆ ｌ ａ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｕ ｓ 　 ｆ ｕ ｎ ｇ ｉ ［ Ｊ ］ ．Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ 　Ｂｉ ｏ ｔ ｅ ｅ ｈ ｎ ｏ ｌ ，１ ９ ９８ ， １ ６： ８ ３ ９ 　［ ４ １ 　 Ｍｉ ｃ ｈ ｉ ｅ ｌ ｓ ｅ 　 ＣＢ ，Ｈ ｏｙ ｋ ａ ａ ｓ 　 Ｐ Ｊ ，ｖ ＆ ｎ 　 ｄ ｅ ｎ 　 Ｈｏ ｎ ｄ ｅ ｌ 　 Ｃ Ａ ，ｅ ｔ 　 １．Ａ ０ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ — 　ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ～ ｍｅ ｄｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　ｔ ｒ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ａ ｓ 　ｔ ｏ ｏ ｌ 　ｆ ｏ ｒ 　ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ 　ｇ ｅ ｎ ｏ ｍｉ ｃ ｓ 　ｉ ｎ 　在 一定 的 范 围 内 ，转 化 效 率 随 根 癌 农 杆 菌 或 者 丝 状 真 菌 受　 体 细 胞 数量 的 增 加 而 提 高 ，而 且 在 供 体 菌 和 受 体 菌 的数 量 为 一　 定 的 比例 时 ， 转 化 效 率最 大１ Ｌ １ ４ ． １ ５ ２ ９ ． ３ 　 １ 。文 献 中多 采 用 光 密 度 或 菌 液　ｆ ｕ ｎ ｇ ｉ ［ Ｊ ］ ．Ｇ ｕ ｒ ｒ 　 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ，２ ０ ０ ５ ， ４ ８ ： １ 　 ［ ５ ］ 　 Ｂ ｎｔ ａ ａ 　 Ｌ Ｍ，Ｊ ｏ ｅ ｒ ｇ ｅ ｒ 　 Ｒ Ｄ，Ｈｏ ｗ ｉ ｔ ｚ 　Ｖ Ｒ ，ｅ ｔ 　０ １ ．Ｇ ｌ ｕ － ２ ５ ５ 　 ｏ ｕ ｔ ｓ ｉ ｄ ｅ 　ｔ ｈ ｅ 　ｐ ｒ ｅ ｄ ｉ ｃ ｔ ｅ ｄ 　Ｃｂ ｖ Ｅ　 ｂ ｉ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ 　ｓ ｉ ｔ ｅ 　ｉ ｎ 　Ｖｉ ｒ Ａ 　ｉ ｓ 　 ｃ ｒ ｕ ｃ ｉ ｌ　ｆ ａ ｏｒ 　 ｓ ｕ ｇ ａ ｒ 　 ｅ ｎ ｈ ｎｃ ａ ｅ — 　的 加 入 量 来 代表 农 杆 菌 的数 量 ， 因此 由 其结 果 难 以 计 算 农杆 菌　 和 受体 菌 的最 佳 比例 。 Ｍｅ ｙ ｅ ｒ 等研 究 了供 体 菌 与 受 体 菌 比例 对 转　 化 的影 响 ， 并 对农 杆 菌 细 胞 进行 了计 数 ， 结 果 表 明 当农 杆 菌 的 细　 胞 数 与 受 体 菌 的 细胞 数之 比为 １ ２ ０ ： １ 时 转 化效 果最 佳　 １ 。 　３ ． ５ 抗性 基 因 的启 动 子　ｍｅ ｎ ｔ 　 ｏ ｆ 　 ａ ｅ ｅ ｔ ｏ ｓ ｙ ｒ ｉ ｎ ｇ ｏ ｎ ｅ 　ｐ ｅ ｒ ｃ ｅ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｂ ｙ 　 Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ［ Ｊ ］ ． 　Ｊ 　 Ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｏ ｌ ，１ ９ ９ ４ ， １ ７ ６ （ １ 　 １ ） ： ３ ２ ４ ２ 　［ ６ ］ 　Ｒ ｅ ｌ ｉ ｃ 　Ｂ ，Ａ ｎ ｄ ｊ ｅ ｌ ｋ ｏ ｖ ｉ ｅ 　Ｍ，Ｒ ｏ ｓ ｓ ｉ 　 Ｌ ，ｅ ｔ 　 １．Ｉ ０ ｎ ｔ ｅ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　 ｔ ｈ ｅ 　 Ｄ Ｎ 　 ｍｏ ｄｉ ￣ｉ ｎ ｇ 　 ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｓ 　 Ｖ ｉ ｒ Ｄ１ 　ａ ｎｄ 　 Ｖ ｉ ｒ Ｄ ２ 　 ｏ ｆ 　 Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ： 　Ａｎ ｌ ａ ｙ ｓ ｉ ｓ 　 ｂ ｙ 　ｓ ｕ ｂ ｅ ｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ａ ｒ 　 ｌ ｏ ｃ ｌｉ ａ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｉ ｎ 　ｍ ａ ｍ ｍａ ｌｉ ｎ　 ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ［ Ｊ 】 ． Ｐ ｏｃ ｒ 　Ｎａ ｔ ｌ 　Ａｅ ａ ｄ 　 Ｓ ｅ ｉ 　ＵＳ Ａ， １ ９ ９ ８ ， ９ ５ ： ９１ ０ ５ 　为 了使 抗 性 基 因 在 转 化 子 中 表 达 ，通 常使 用 一 些 可 以在 多　［ ７ ］ Ｔ ｏ ｍ　 Ｎ，Ｄ ａ ｔ ｔ ａ 　 Ａ ，Ｃ ａ ｒ ｍ ｉ 　 Ｏ Ａ，ｅ ｔ以 Ｔ ｈ ｅ 　 Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ 　ｖ ｉ ｒ Ｃ１ 　ｇ ｅ ｎ ｅ 　 ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ 　ｂ ｉ ｎ ｄ ｓ 　 ｔ ｏ 　 ｏ ｖ ｅ ｒ ｄｒ ｉ ｖ ｅ ，ａ 　Ｔ －ＤＮＡ　 ｒａ ｔ ｎｓ ｆ ｅ ｒ 　ｅ ｎ ｈ ｎｃ ａ ｅ ｒ 　种丝状真菌起作用 的组成型启 动子 ， 如构巢 曲霉 （ Ａｍ　ｕ 　 ） 的　ｇ ｏ ｄ启 动 子 等 来 启 动 抗 性 基 因 的 表 达 ［ ２ － ａ ２ ３ ２ ￣ 。 值 得 指 出 的是 ， 丝 状　［ Ｊ ］ ． Ｊ 　 Ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｏ ｌ ，１ ９ ８ ９ ， １ ７ １ （ １ ２ ） ： ６ ８ ４ ５ 　 ［ ８ 】 Ｌ ｉ ｕ 　 Ｚ Ｙ ，Ｂ ｉ ｎ ｎ ｓ 　 Ａ Ｎ．Ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｌ ａ 　 ｓ ｕ ｂ ｓ ｅ ｔ ｓ 　 ｏ ｆ 　 ｈｅ ｔ 　 Ｖｉ ｒ Ｂ 　 ｔ ｙ ｐ ｅ 　 Ｉ Ｖ 　 ｒ ｔ ｎｓ ａ — 　ｐ ｏ ｒ ｔ 　ｃ ｏ ｍｐ ｌ ｅ ｘ 　ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｓ 　ｉ ｎｖ ｏ ｌ ｖ ｅ ｄ 　ｉ ｎ 　ｔ ｈ ｅ 　ｃ ａ ｐ ａ ｃ ｉ ｔ ｙ 　ｏ ｆ 　Ａｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　真 菌 在 分 类 上 的 跨 度 非 常 之 大 ，如 果 使 用 亲 源关 系 较 远 的启 动　子， 则 有 时 难 以得 到 转 化 子 。 如 Ｇ ｏ ｄ ｉ ｏ等 使 用 构 巢 曲霉 的 印 ｄ启　 动 子 进 行 了担 子 菌 Ｈ ｙ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｍ ａ 　 ｓ ｕ ｂ ｌ ａ ｔ ｅ ｒ ｉ ｔ ｉ ｕ ｍ的转化 ， 结 果 没 有 得　 到 转 化子 ，而 采 用 来 源 于 担 子 菌 的 印 ｄ启 动 子 则 可 以 成 功 地 实　 现 转 化　。 除 了上 述 几 个 因素 ， 还有 其 他 一些 因素 ， 如抗 生 素 的浓　ｔ ｕ ｍｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ 　ｔ ｏ 　ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ 　ａ ｓ 　ａ 　ｒ ｅ ｃ ｉ ｐ ｉ ｅ ｎ ｔ 　ｉ ｎ 　ｖ ｉ ｒ Ｂ－ ｍｅ ｄｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　ｃ ｏ ｎ ｊ ｕ ｇ ｌ ａ 　 ｒ ｔ ｎｓ ａ ｆ ｅ ｒ 　 ｏ ｆ 　 ｐ ｌ ａ ｓ ｍ ｉ ｄ 　 Ｒ Ｓ Ｆ Ｉ Ｏ Ｉ Ｏ ［ ￣． Ｊ 　 Ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｏ ｌ ，２ ０ ０ ３ ， １ 　 ８ ５ （ １ 　 １ ） ： ３ ２ ５ ９ 　【 ９ ］ Ｄ ａ ｓ 　 Ａ ，Ｘｉ ｅ 　 ＹＨ ．Ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　 ｒａ ｔ ｎｓ ｐ ｏ ｓ ｏ ｎ 　 Ｔ ｎ ３ ｐ ｈ ｏ Ａ：ｉ ｔ ｓ 　 ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｅ ａ － 　ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｉ ｎ 　ｄ ｅ ｉ ｆ ｎ ｉ ｎ ｇ 　ｔ ｈ ｅ 　 ｍｅ ｍｂ ｒ ｎｅ ａ 　ｔ ｏ ｐ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ 　ｏ ｆ 　ｔ ｈ ｅ 　 Ａｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　度Ｂ 　 、 ｐ Ｈ 值　 ５ １ 等 也可 能会 影 响转 化 效 率 ， 在进 行 具 体 的转 化 过 程　 时需 要进 行 比较 ， 以选 择合 适 的转 化 条 件 。 　ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ 　 Ｄ ＮＡ 　 ｒ ｔ ｎｓ ａ ｆ ｅ ｒ 　 ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｓ ［ Ｊ ］ ．Ｍｏ ｌ 　 Ｍｉ ｅ ｏｂ ｒ ｉ ｏ ｌ ，１ ９ ９ ８ ， ２ ７ ： ４ ０ ５ 　［ １ ０ ］Ｃ ｉ ｔ ｏ ｖ ｓ ｋ ｙ 　 Ｖ， Ｂ ｌｌ ａ ￣ Ｎ ．Ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ａ ｒ 　 ｌ ｏ ｃ ｌｉ ａ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｓ ｉ ｇ ｎ ｌ ａ 　 ｂ ｉ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ 　 ｐ ｏｔ ｒ ｅ ｉ ｎ 　ｆ ｒ ｏ ｍ　Ａ 　 ｒ ｏ ｂ ｈ ｔ ｏ ｐｓ ｉ ｓ 　ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｓ 　ｎ Ｂ ＠ ｌ ｅ ＆ ｒ 　ｉ ｍｐ ｏｒ ｔ　ｏ ｆ 　Ａｇｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　Ｖｉ ｒ Ｄ２ 　ｐ ｏｔ ｒ ｅ ｉ ｎ ［ Ｊ ］ ．Ｐ ｒ ｏ　 Ｎ ａ ｔ ｌ 　 Ａ ｃ ａ ｄ 　 Ｓ ｃ ｉ 　 Ｕ Ｓ Ａ ，１ ９ ９ ７ ， ９ ４ ： １ ０ ７ ２ ３ 　 ［ １ １ 】Ｌ ａ ｃ ｏｌ ｒ ｘ 　 Ｂ ，Ｖ ａ ｉ ｄ ｙ ａ 　 Ｍ， Ｔ ｚ ｉ ｆ ｒ ａ 　Ｔ ＇ｅ ｌ 　 １ ０ ．Ｔ ｈ ｅ 　 Ｖ ｉ ｒ Ｅ ３ 　 ｐ ｏｔ ｒ ｅ ｉ ｎ 　 ｏ ｆ 　 Ａ— 　维普资讯 杨长得等 ： 根 癌 农 杆 菌 在 丝状 真 菌转 化 中 的应 用　ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　ｍｉ ｍｉ ｃ ｓ 　ａ 　ｈ ｏ ｓ ｔ 　ｃ ｅ ｌ ｌ 　 ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｒ ｅ ｑｕ ｉ ｒ ｅ ｄ 　ｆ ｏ ｒ 　 ｐ ｌ ａ ｎ ｔ 　 ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ 　７ ８ ７ 　４ ６ （ ５ ） ： ２ ８ ７ 　 ［ ２ ４ ］Ｌ ｉ 　 ＭＸ，Ｇ ｏ ｎ ｇ 　 Ｘ Ｙ，Ｚ ｈ ｅ ｎ ｇ 　 Ｊ ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ｔ ｒ ａ ｎ ｆ ｓ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　 Ｃ ｏ ｎ ｉ ｏ ｔ ｈ ｙ ｒ ｉ ｕ ｍ 　ｍｉ ｎｉ ｔ ａ ｎ ｓ ，ａ 　 ｐ ｒａ ａ ｓｉ ｔ ｅ 　 ｏ ｆ 　Ｓ ｃ ｌ ｅ ｒ ｏ ｔ ｉ ｎｉ ａ 　 ｓ ｌ ｃ ｅ ｒ ｏ ｔ ｉ ｏ ｒ ｕ ｍ，ｗｉ ｔ ｈ 　Ａｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　ｔ ｒ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ［ Ｊ ］ ． ＥＭＢ Ｏ 　 Ｊ ，２ ０ ０ ５ ， ２ ４ ： ４ ２ ８ 　 ［ １ ２ ］Ｓ ｃ ｈ ｒ ａ ｍｍｅ ｉ ｊ ｅ ｒ 　 Ｂ ，Ｒ ｉ ｓ ｓ ｅ ｅ ｕ ｗ 　 Ｅ ，Ｐ ｎｓ ａ ｅ ｇ ｒ ａ ｕ 　 Ｗ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　ｔ ｈ ｅ 　 ｖ ｉ ｒ ｕ ｌ ｅ ｎ ｃ ｅ 　 ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ 　 Ｖｉ ｒ Ｆ 　 ｏ ｆ 　 Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ 　 ｗ ｉ ｔ ｈ 　 ｐ ｌ ｎｔ ａ 　ｈ ｏ ｍｏ ｌ ｏ ｇ ｓ 　 ｏ ｆ 　 ｔ ｈ ｅ 　 ｙ ｅ ａ ｓ ｔ 　 Ｓ ｋ ｐ ｌ 　 ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ［ Ｊ ］ ． Ｃ ｕ ｒ ｔ 　 Ｂ ｉ ｏ ｌ ，２ ０ ０ １ ， １ 　 １ （ ４ ） ： ２ ５ ８ 　 ［ １ ３ ］ｄ ｏ ｓ 　 Ｒ ｅ ｉ ｓ 　 ＭＣ ，Ｐ ｅ ｌ ｅ 　ｎ ｅ ｌ ｌ ｉ 　 Ｆ ｕ ｎ ｇ ａ ｒ ｏ 　 ＭＨ，Ｄ ｅ ｌ ｇ ａ ｄ ｏ 　 Ｄ ｕ ａ ｒ ｔ ｅ 　 Ｒ Ｔ ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ． 　ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ［ ］．Ｆ Ｊ Ｅ ＭＳ 　 Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ 　 Ｌ ｅ ｔ ｔ ， ２ ０ ０ ５ ， ２ ４ ３ ： ３ ２ ３ 　［ ２ ５ ］Ｃ ａ ｍｐ ｏ ｙ 　Ｓ ，Ｐ ｅ ｒ ｅ ｚ 　 Ｆ ’Ｍａ ｒ ｔ ｉ ｎ 　 Ｊ Ｆ ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ 　 ｒａ ｔ ｎｓ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｎｔ ｓ 　 ｏ ｆ 　 ｈｅ ｔ 　ａ ｚ ａ ｐ ｈ ｉ ｌ ｏ ｎ ｅ 　 ｐｉ ｇ ｍｅ ｎｔ — － ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ 　 Ｍｏ ｎ ａ ｓ ｃ ｕ ｓ 　ｐ ｕ ｒ ｐｕ ｒ ｅ ｕ ｓ 　ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ 　ｂ ｙ 　 ｐ ｒ ｏ — 　Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ－ ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ 　ｔ ｒ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｏ ｆ 　ｔ ｈ ｅ 　ｅ ｎ ｔ ｏ ｍ ｏ ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ 　 ｆ ｕ ｎ ｇ ｕ ｓ 　 Ｂ ｅ ａ ｕ ｖ ｅ ｒ ｉ ａ 　 ｂ ａ ｓ ｓ ｉ ａ ｎ ａ ［ ］ Ｊ ．Ｊ 　 Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ 　 Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ． 　２ ０ ０ ４ ，５８ ： １ ９ ７ 　ｔ ｏ ｐ ｌ ｓｔ ａ 　 ｒ ｔ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｎｄ ａ 　 Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ－ ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　Ｄ Ｎ Ａ 　 ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ［ ］ Ｊ ． 　Ｃｕ ｒ ｒ 　 Ｇｅ ｎ ｅ ｔ ，２ ０ ０３ ， ４３ ： ４ ４ ７ 　［ ２ ６ ］Ｄ ｅ ｇ ｅ ｆ ｕ 　 Ｙ，Ｈ ｎｉ ａ ｆ 　 Ｍ．Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ － ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　 ｔ ｒ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｒ — 　ｍａ ｉｏ ｒ ｎ 　ｏ ｆ 　 Ｈｅ ｌ ｍｉ ｎ ｔ ｈ ｏ ｓ ｐｏ ｒ ｉ ｕ ｍ　 ｔ ｕ ｒ ｃ ｉ ｃ ｕ ｍ， ｔ ｈｅ 　ｍａ ｉ ｚ ｅ 　ｌ ｅ ａ ｆ —ｂ ｌ ｉ ｇ ｈｔ 　ｆ ｕ ｎ ｕｓ ｇ 　［ １ ４ ］ Ｍｕ ｌｌ ｉ ｎ ｓ 　 Ｅ Ｄ ，Ｃ ｈ ｅ ｎ 　Ｘ ，Ｒ ｏ ｍ ａ ｉ ｎ ｅ 　 Ｐ ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ－ Ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　Ｔｒ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｏ ｆ 　 Ｆｕ ｓ ａ ｒ ｉ ｕ ｍ　 ｏ ｘ ｙ ｓ ｐｏ ｒ ｕ ｍ． Ａｎ 　 ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｔ 　ｔ ｏ ｏ ｌ 　ｆ ｏ ｒ 　ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ — 　［ Ｊ ］ ．Ａ ｒ ｃ ｈ 　 Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ，２ ０ ０ ３ ， １ ８ ０ ： ２ ７ ９ 　 ［ ２ ７ ］Ｆ ｌ ｏ ｗ ｅ ｓ ｒ 　 Ｊ Ｌ ，Ｖ ｉｌ ａ ｌ ｎｃ ａ ｏ ｕ ｒ ｔ 　 Ｌ Ｊ ．Ｐ ｒａ ａ ｍ ｅ ｔ ｅ ｓ ｒ 　 ｆｆ ａ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ 　 ｔ ｈ ｅ 　 ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｃ ｙ 　 ｏ ｆ 　ｔ ｉ ｏ ｎ ｌ ａ 　 ｍｕ ｔ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｓ 　 ｎｄ ａ 　 ｇ ｅ ｎ ｅ 　 ｒ ｔ ｎｓ ａ ｆ ｅ ｒ ｆ ］． Ｊ Ｐ ｈ ｙ ｔ ｏ ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，２ ０ ０ １ ， ９ １ ： １ ７ ３ 　［ １ ５ ］Ｔ ｓ ｕ ｊ ｉ 　 Ｇ ，Ｆ ｕ ｊ ｉ ｉ 　 Ｓ ，Ｆ ｕ ｊ ｉ ｈ ａ ｒ ａ 　 Ｎ ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ — ｍ ｅ — 　ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　ｔ ｒ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｆ ｏｒ 　ｒ ｎｄ ａ ｏ ｍ　 ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ｌ　 ｍｕ ａ ｔ ａ ｇ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ 　ｉ ｎ 　Ｃ Ｄ 　Ａｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ － ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　 ｒ ｔ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　 Ｃ ｏ Ｕ ｅ ｔ ｏ ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｕ ｍ　 ｇ ｒ ａ ｍｉ ｎ ｉ ｃ ｏ ＭＪ ］．Ｃ ｕ ｒ ｔ 　 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ，２ ０ ０ ５ ， ４ ８ ： ３ ８ ０ 　［ ２ ８ 】Ｋ ｎｇ ａ 　 Ｃ Ｈ，Ｐ ｒｋ ａ 　 Ｓ Ｙ，Ｌ ｅ ｅ 　 Ｙ Ｈ，ｅ ｔ 　 ａ １ ．Ａ 　 ｄ ｕ ａ ｌ 　 ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｂ ａ ｓ ｅ ｄ ，ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ— 　ｅ ｄ 　ｇ ｅ ｎ ｅ 　ｒ ｅｐ ｌ ａ ｃ ｅ ｍｅ ｎ ｔ 　ｔ ｏｌ 　ｆ ｏ ｒ 　Ｍ ａ ｇ ｎ ａ ｐ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ 　ｇ ｍｅ ａ 　ａ ｎｄ 　Ｆ ｕ ｓ ａ ｒ ｉ ｕ ｍ　ｌ ｅ ｔ ｏ ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｕ ｍ 　 ｌ ａ ｇ ｅ ｎ ａ ｒ ｉ ｕ ｍ［ ］． Ｊ Ｊ 　 Ｇ ｅ ｎ 　 Ｐ ｌ ｎｔ ａ 　 Ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｌ ， ２ ０ ０ ３ ， ６ ９ ： ２ ３ ０ 　 ［ １ ６ ］Ｋ ａ ｔ ｈ ｅ ｒ ｉ ｎ ｅ 　 Ｆ ，Ｓ ｎｄ ａ ｒ ａ 　 Ｊ ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ 　 ｎｄ ａ 　 ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ ｅ ｄ 　 ｄ ｉ ｓ ｕｐ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ，ｖ ｉ ａ 　Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ — ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　 ｒａ ｔ ｎｓ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ， 　 ｏ ｆ 　ａ 　 ｔ ｒ ｙ ｐ ｓ ｉ ｎ 　ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ 　 ｇ ｅ ｎ ｅ 　 ｆ ｒ ｏ ｍ 　 ｔ ｈ ｅ 　 ｖ ａ ｓ ｃ ｕ ｌ ｒ　 ａ ｗ ｉ ｌ ｔ 　 ｆ ｕ ｎ ｕｓ ｇ 　 Ｖ ｅ ｒ ｔ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ　 ｄ 　Ｃ ｕ ｒ ｒ 　 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ，２ ０ ０ ４ ＇ ４ ５ ： １ ０ ４ 　ｏ ｘ ｙ ｓ ｐ ｏ ｒ ｕ ｍ［ ］．Ｆ Ｊ ｕ ｎ ｇ 　 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ 　 Ｂ ｉ ｏ ｌ ， ２ ０ ０ ５ ， ４ ２ ： ４ ８ ３ 　［ Ｊ ］ ． 　［ ２ ９ ］Ｒ ｈ ｏ 　 ＨＳ ，Ｋ ｎｇ ａ 　 Ｓ ，Ｌ ｅ ｅ 　 ＹＨ．Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ — ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　ｔ ｒ ａ ｎ ｆｏ ｓ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｏ ｆ 　ｔ ｈｅ 　ｐ ｌ ｎｔ ａ 　 ｐ ａ ｈｏ ｔ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ 　ｆ ｕ ｎ ｕｓ ｇ ， Ｍａ ｇ ｎ ａ ｐ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ 　ｇ ｒ ｉ ｓ ｅ ａ 　［ １ ７ ］Ｆ ｎｇ ａ 　 ＷＧ ，Ｚ ｈ ｎｇ ａ 　 Ｙ Ｊ ，Ｙａ ｎｇ 　 Ｘ Ｙ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　 ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ — 　ｍｅ ｄｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　ｔ ｒ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｏ ｆ 　Ｂｅ ａ ｕ ｖ ｅ ｒ ｌ ａ 　ｂ ａ ｓ ｓ ｉ ｎ ａ 　ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ 　ａ ｌ ｌ 　ｈ ｅ ｒ ｂ ｉ ｃ ｉ ｄ ｅ 　［ Ｊ ］ ．Ｍｏ ｌ 　 Ｃ ｅ ｌ ｌ ，２ ０ ０ １ ， １ ２ （ ３ ） ： ４ ０ ７ 　 ［ ３ ０ ］Ｍｉ ｃ ｈ ｉ ｅ ｌ ｓ ｅ 　 Ｃ Ｂ ，Ｒ ａ ｍ 　 Ａ Ｆ ，Ｈ ｏｙ ｋ ａ ａ ｓ 　 Ｐ Ｊ ，ｅ ｔ 　 ａ １ ．Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ— ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ — 　ｅ ｄ 　ｔ ｒａ ｎｓ ｆ ｏ ｍ ａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｌ ｅ ａ ｄ ｓ 　ｔ ｏ 　 ｉ ｍｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｄ 　ｇ ｅ ｎ ｅ 　ｒ ｅ ｐ ｌ ａ ｃ ｅ ｍｅ ｎ ｔ 　 ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｃ ｙ 　 ｉ ｎ 　ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ｎｃ ａ ｅ 　 ｇ ｅ ｎ ｅ 　 ａ ｓ 　 ａ 　 ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｍａ ｒｋ ｅ ｒ ［ ］．Ｊ Ｊ 　 Ｉ ｎ ｖ ｅ ｒ ｔ 　 Ｐ ａ ｈｏ ｔ ｌ ，２ ０ ０ ４ ， ８ ５ ： 　１ ８ 　Ａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ 　 ａ ｗ ｏ ｍｏ ｒ ／ ［ Ｊ ］ ．Ｆ ｕ ｎ ｇ 　 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ 　 Ｂ ｉ ｏ ｌ ，２ ０ ０ ５ ， ４ ２ ： ９ 　 ［ ３ １ ］Ｒｏ ｌ ｌ ｎｄ ａ 　 Ｓ ，Ｊ ｏ ｂ ｉ ｃ 　 Ｃ ，Ｆ ￣ ｖ ｒ ｅ 　 Ｍ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ— ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　 ｔ ｒ ｎｓ ａ — 　ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｏ ｆ 　Ｂｏ ｔ ｒ ｙ ｉ ｓ 　ｃ ｉ ｎ ｅ ｍａ ， 　 ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｅ 　ｐ ｕ ｒ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｏ ｆ 　ｍｏ ｎ ｏ ｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ 　 ｔ ｒ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ａ ｎｄ 　ｒ ａ ｐ ｉ ｄ 　ｃ ｏ ｎ ｉ ｄ ｉ ａ — － ｂ ｓｅ ａ ｄ 　ｉ ｄｅ ｎ ｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｏ ｆ 　 ｔ ｈ ｅ 　ｔ ｒａ ｎｓ — 　［ １ ８ ］高 兴 喜 ，杨 谦 ．根 癌 农 杆 菌 介 导 的 球 毛 壳 菌 遗 传 转 化 及 Ｔ — Ｄ Ｎ Ａ 插　 入 突 变 体 的 获 得　 ．微 生 物 学 报 ，２ ０ ０ ５ ， ４ ５ （ １ ） ： １ ２ ９ 　 ［ １ ９ ］高 兴 喜 ，杨 谦 ，宋 金 柱 ，等．根 癌 农 杆 菌 介 导 的木 霉 遗 传 转 化 方 法　．高 技 术通 讯 ，２ ０ ０ ４ ， ５ （ ５ ） ： ３ ２ 　ｆ ｅ ｒ － Ｄ Ｎ Ａ 　 ｈ ｏ ｓ ｔ 　 ｇ ｅ ｎ ｏ ｉｃ ｍ 　 Ｄ Ｎ Ａ 　 ｌ ｆ ｎｋ ａ ｉ ｎ ｇ 　 ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ［ Ｊ ］ ． 　Ｃ ｕ ｒ ｔ 　 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ， 　２ ０ ０３ ， ４ ： １ ６ ４ 　［ ２ ０ ］Ｒ ｏ ｄ ｒ ｉ ｇ ｕ ｅ ｚ — Ｔ ｏ ｖ ｒ　 ａ Ａ Ｖ，Ｒ ｕ ｉ ｚ — Ｍｅ ｄ ｒ ｎｏ ａ 　 Ｒ ，Ｈ ｅ ｒ ｒ ｅ ｒ ａ － Ｍａ ｒ ｔ ｉ ｎ ｅ ｚ 　 Ａ， ｅ ｔ 　 ｏ １ ． 　Ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ 　 ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ 　 ｔ ｒａ ｎｓ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｏ ｆ 　 ｔ ｈ ｅ 　 ｅ ｃ ｔ ｏ ｍｙ ｃ ｏ ｒ ｒ ｈ ｉ ｚ ｌ　 ｆ ａ ｕ ｎ ｕｓ ｇ 　［ ３ ２ ］Ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｅ ｒ 　 Ｊ Ｐ ，Ｍｅ ｌ ａ ｙ ａ ｈ 　 Ｄ，Ｒａ ｆ ｉ ｅ ｒ 　 Ｃ ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ￡ 嘶　ｏ ２ ｉ ｔ ｈ 　 ｔ ｉ ｎ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ｕ ｓ ［ ］ Ｊ ．Ｊ 　 Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ 　 Ｍｅ ｈｏ ｔ ｄ ． ２ ０ ０ ５ ． ６ ３ ： ４ ５ 　 ［ ２ １ ］Ｒ ｏ ｇ ｅ ｒ ｓ 　 Ｃ Ｗ，Ｃ ｈ ｌｌ ａ ｅ ｎ 　 ＭＰ ，Ｇ ｒ ｅ ｅ ｎ 　 Ｊ Ｒ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ｕ ｓ ｅ 　 ｏ ｆ 　 Ｒ Ｅ ＭＩ 　 ａ ｎ ｄ 　 Ａ— 　ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕｍ— － ｍｅ ｄｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｔ ｏ 　ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｙ 　ｐ ａ ｈｏ ｔ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ 　ｍｕ — 　 ｔ ａ ｎ ｔ ｓ 　ｏ ｆ 　 ｈｅ ｔ 　ｂ ｉ ｏ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ 　 ｆ ｕ ｎ ｕｓ ｇ 　 Ｃｏ ｎ ｌ ｏ ｔ ｈ ｒ ｙ ｉ ａ ｍ　ｍｉ ｎｉ ｔ ａ ｎ ｓ 　 ．Ｆ ＥＭ Ｓ 　Ｍｉ — 　 ｃ ｍｂ ｉ ｏ ｌ 　 Ｌ ｅ ｔ ｔ ．２ ０ ０ ４． ２ ４１ ： ２ ０ ７ 　ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ— ｍｅ ｄｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　ｔ ｒａ ｎｓ ｆ ｏ ｍ ａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ａ ｓ 　ａ 　ｔ ｏｌ 　ｆ ｏｒ 　ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ｌ　ｍｕ ａ ｔ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｓ 　ｉ ｎ 　ｔ ｈｅ 　ｓ ｙ ｍｂ ｉ ｏ ｔ ｉ ｃ 　ｅ ｃ ｔ ｏ ｍ ｙ ｃ ｏ ｒ ｒ ｈ ｉ ｚ ｌ ａ 　ｆ ｕ ｎ ｕｓ ｇ 　Ｈｅ ｂ ｅ ｌ ｏ ｍａ 　 ｃ ｌｉ ｆ ｎ ｄ ｒ ｏ ｓ ｐ ｏ ｒ ｕ ｍ 　．Ｆ ＥＭＳ 　 Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ 　 ｅｔ Ｌ ｔ ，２ ０ ０ ３ ， ２ ２ ０ ： １ ４１ 　［ ３ ３ ］Ｌ ｉ ｕ 　 ＹＧ ， Ｍｉ ｔ ｓ ｕ ｋ ａ ｗ ａ 　 Ｎ， Ｏ ｏ ｓ ｕ ｍ ｉ 　 Ｔ ，ｅ ｔ 　ａ １ ．Ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｔ 　ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｎｄ ａ 　 ｍａ ｐ ｐ ｉ ｎ ｇ 　 ｏ ｆ 　 Ａ 　 ｒ ａ ｂ ｉ ｄ ｏ ｐ ｓ ｉ ｓ 　 ｔ ｈ ａ ｌ ｉ ａ ｎ ａ 　 Ｔ － Ｄ Ｎ Ａ 　 ｉ ｎ ｓ ｅ ￣ｊ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ 　ｂ ｙ 　 ｔ ｈ ｅ ｒ — 　 ｍａ ｌ 　 ｓｙ ａ ｍｍｅ ｔ ｒ ｉ ｃ 　 ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｌ ａ ｃ ｅ ｄ 　 Ｐ Ｃ Ｒ ［ ］． Ｊ Ｐ ｌ ｎｔ ａ 　 Ｊ ，１ ９ ９ ５ ， ８ （ ３ ） ： ４ ５ ７ 　 ［ ３ ４ ］Ｌ ｉ ｕ 　 ＹＧ ， Ｗｈ ｉ ｔ ｔ ｉ ｅ ｒ 　 Ｒ Ｆ ．Ｔ ｈ ｅ ｍａ ｒ ｌ　 ｓｙ ａ ｍｍｅ ｔ ｒ ｉ ｃ 　 ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｌ ａ ｃ ｅ ｄ 　 Ｐ Ｃ Ｒ ：ａ ｕ ｔ ｏ ｍａ ｔ — 　ｂｌ ａ ｅ 　ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ａ ｎｄ 　ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ 　ｏ ｆ 　 ｉ ｎ ｓ ｅ ￣ ｅ ｎ ｄ 　ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｓ 　ｆ ｒ ｏ ｍ　Ｐ１ 　【 ２ ２ ］Ｂ ｕ ｎ ｄ ｏ ｃ ｋ 　 Ｐ ，Ｍｒ ｏ ｃ ｚ ｅ ｋ 　 Ｋ ，Ｗｉ ｎ ｋ ｌ ｅ ｒ 　 Ａ Ａ，ｅ ｔ 　 ｏ １ ．Ｔ － Ｄ Ｎ Ａ 　 ｆ ｒ ｏ ｍ 　 Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ — 　ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ　 ｔ ｕ ｍｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｔ ｓ 　ａ ｓ 　ａ ｌ ｌ 　ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｔ 　ｔ ｏｌ 　ｆ ｏｒ 　ｇ ｅ ｎ ｅ 　ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ ｉ ｎ ｇ 　ｉ ｎ 　Ｋ ｌ ｕ ｙ ｖ ｅ ｒ ｏ ｍ ｙ ｃ ｅ ｓ 　 ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｓ ［ ］ Ｊ ．Ｍｏ ｌ 　 Ｇ ｅ ｎ 　 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ，１ ９ ９ ９ ， ２ ６ １ ： １ １ ５ 　［ ２ ３ ］Ｇ ｏ ｄ ｉ ｏ 　 Ｒ Ｐ ，Ｆ ｏ ｕ ｃ ｅ ｓ 　 Ｒ，Ｇｕ ｄ ｉ ｎ ａ 　 Ｅ Ｊ ，ｅ ｔ 　ｏ １ ．Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ 　 ｔ ｕ ￣ｆ ａ － 　ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ— ‘ ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ 　ｔ ｒ ｎｓ ａ ｆ ｏ ｍａ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ 　ｏ ｆ 　ｔ ｈ ｅ 　ａ ｎｔ ｉ ｔ ｕ ｍｏ ｒ 　ｃ ｌ ａ ｖ ａ ｒ ｉ ｃ 　ａ ｃ ｉ ｄ— － ｐ ｒ ｏ — 　ｎｄ ａ 　 ＹＡ Ｃ 　 ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｓ 　 ｆ ｏ ｒ 　 ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ｏ ｏｍｅ ｓ 　 ｗ ｌ ａ ｋ ｉ ｎ ｇ ［ ］ Ｊ ．Ｇ ｅ ｎ ｏ ｍｉ ｃ ｓ ，１ ９ ９ ５ ， ２ ５ （ ３ ） ： 　６ ７ ４ 　ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ 　 ｂ ｓｉ ａ ｄ ｉ ｏ ｍ ｙ ｃ ｅ ｔ ｅ 　 Ｈ ｙ ｐ ｈ ｏ ／ ｏ ｍ ａ 　 ｓ ｕ ｂ ｌ ａ ｔ ｅ ｒ ｉ ｔ ｉ ｕ ｍ ［ ］．Ｃ Ｊ ｕ ｒ ｒ 　 Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ，２ ０ ０ ４ ， 　
７８ ４ Ｌ Ｅ Ｔｒ Ｅ ＲＳ Ｉ Ｎ ＢＩ ＯＴ Ｅ Ｃ Ｈ Ｏ Ｌ Ｌ ｏＧ ＯＧＹ ｖ。 Ｖ ｏ ｌ 。 ? １ ｌ 一 ／ Ｎｏ 一 －。 ? ５ ） ｓ ｅ ｐ ? ， ２ ０ ０ ６ …（一）概况（二）瑕疵 （三）示例 （四）其他 一、概况 1. 作业要求： 根据给定的材料，联系实际办案经验，完整制作一套查处海洋违法案件的法律文书。 （1）选择文书：依据有关的法律规范，按照现行的海洋行政案件承办流程，即立案至结案各个办案阶段，准确使…18《盘古开天地》 【重点段解读】 有一天，盘古忽然醒了。他见周围一片漆黑，就抡（lūn）起大斧头，朝眼前的黑暗猛（měng）劈（pī）过去。只听一声巨响，混沌一片的东西渐渐分开了。轻而清的东西，缓（huǎn）缓上升，变成了天；重而浊（zhúo）的东…深度分析中国经济进入十年最低谷的原因 日 09:16来源：凤凰国际智库 445人参与8评论 当前，中国经济持续下行，从实体经济到金融行业，从传统企业到创业型公司，中国经济正在经历近十年未遇的寒潮。 深度分析中国经济进入十年最低谷的…就爱阅读网友整理上传,为您提供最全的知识大全,期待您的分享，转载请注明出处。
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