猪树突状细胞在猪传染性胃肠炎病毒感染中的作用及机制研究--《河南农业大学》2013年硕士论文
猪树突状细胞在猪传染性胃肠炎病毒感染中的作用及机制研究
【摘要】：猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)所致的以呕吐、严重腹泻、脱水和对7日龄以内仔猪高度致死率(通常可达100%)为特征的急性高度接触性肠道传染病。我国从第一次分离出该病毒后,在全国各地便不断有从猪场分离出该病毒的报道,其流行危害进一步加重。本病主要在冬末春初爆发,但最近儿年的调查结果显示,该病在春末夏初也有发病,而且在河南省的中小型的养猪场中发病率大约为15%～23%,给我国的养猪业造成了严重的经济损失。目前对该病的研究主要集中在诊断、治疗和疫苗的研制方向上,但实践证明收效不住。这主要是因为之前对TGEV的致病机制,特别是对TGEV惑染的分子机制了解过少造成的。而作为体内最大的抗原提呈细胞—树突状细胞(Dendritic cell, DC),可以直接激活初始型T细胞,同时产生一系列细胞因子参与机体的免疫调节作用。DC已经被证实能够在冠状病毒感染和治疗中发挥作用,但它是否是TGEV的靶细胞,并且是否能在TGEV惑染中发挥作用,并没有被报道过。因此,本研究从猪外周血.中诱导分化出了DC,建立了体外诱导培养猪DC的体系；同时研究了TGEV对DC的感染特性和在DC内复制的能力,以及TGEV感染对DC分泌细胞因子的影响,以期揭示DC与TGEV的相互作用关系,探讨和分析TGEV的感染机制,特别是该病的分子致病机制,为有效防控TGE和提高对该病的免疫效果提供理论基础。1.采集健康猪的外周血,分离淋巴单核细胞,并用GM-CSF、IL-4和TNF-α联合诱导单核细胞向树突状细胞的分化,用倒置显微镜观察细胞的成长和分化过程,以及imDC和mDC的形态。结果显示：在rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α联合诱导培养10天后,通过倒置显微镜可以观察到细胞培养过程中的形态的变化,在诱导成熟之后具有典型的具有树突状细胞的DC形态。可以初步证实我们已成功建立了从猪外周血中体外诱导培养DC的方法,为我们下一步研究TGEV及其他病原微生物对DC的致病机制提供了新的试验思路和试验模型。2.为了解TGEV对猪DC的感染特性及其在DC中的复制能力,将TGEV体外感染成熟猪DC,于感染后1、3、12、24、48和72h收集上清及细胞。将细胞上清液感染ST细胞,通过检测细胞的病变情况,来验证细胞的毒性。提取细胞中的RNA,立即进行反转录,然后进行PCR和荧光定量RT-PCR的扩增,分析TGEV是否能感染DC,以及该病毒是否能在DC内增殖。结果显示：TGEV感染DC后1h就能检测到病毒,而且随着感染时间的延长,DC中的TGEV含量逐渐增加,表明TGEV能够成功感染DC,且能在DC内复制和增殖。3.为了解TGEV感染对DC分泌细胞因子的影响,采用双抗夹心ELISA法检测TGEV、惑染猪DC后1、3、12、24、48和72h的细胞上清液中的IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-α和IFN-γ的含量：用Real-time PCR技术检测TGEV感染mDC后不同时间的免疫相关因子(IL-6、IL-8、IL-12p35、IL-12p40、IL-17、IL-18)在mRNA转录水平的变化。结果显示,TGEV感染DC后引起IL-6、IL-10、IFN-α在蛋白水平表达量上调,其中以IFN-α的上调尤为显著;TNF-α的含量有所下降,IFN-γ的含量没有明显的变化。在细胞中IL-12 p35的表达在24 h达到高峰IL-12p40、IL-6和IL-18的表达上升,其中IL-12p40在感染后72h达到高峰,而IL-6和IL-18在48h达到高峰;IL-8在病毒感染后其表达量逐渐降低,直至72h达到最低点；IL-17的表达量在感染病毒前后变化不大,以上数据表明TGEV感染DC后引起了相关细胞因子表达的变化,该试验的结果为进一步研究TGEV与DC的相互作用关系奠定r基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：河南农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：S858.28【目录】：
致谢4-6中文摘要6-8缩略语英汉对照8-10文献综述10-21引言21-22试验一 猪外周血树突状细胞的分离及鉴定22-28 1 材料与方法22-24 2 结果24-26 3 结论与讨论26-28试验二 TGEV对猪外周血树突状细胞感染特性的研究28-35 1 材料与方法28-31 2 结果31-33 3 结论与讨论33-35试验三 TGEV感染猪外周血树突状细胞后对相关因子表达水平的影响35-46 1 材料与方法35-39 2 结果39-42 3 结论与讨论42-46全文总结46-47参考文献47-56Abstract56-58
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第四十一章 猪突战术
&&&&俘虏兵的人数加上苏鹏原来的100多，居然达到1860多人，按照蒋浩然的指示，殷东来很快按原来的编制，将他们编成炮营、突击营、机枪营、尖刀营。每个营380人，选出一名副营长，由各营长决定副连排长。至于营长和各连排长，蒋浩然是准备等刘大昆他们回来，将这几个营补充进去，让自己原来的老兵来担任，毕竟他们都是各师的精英，这样可以提升部队的战斗力，也有利于自己完全掌控这支队伍。剩下的近400人交给了苏鹏，蒋浩然觉得这小子像个打仗的料，让他组成一个机动营，以备不时之需。&&&&从鬼子的仓库领到了武器装备，这些俘虏兵马上就有了军人的气质，这种弹药管够，武器哪样趁手捡哪样的日子他们可没享受过，一个个咧开着嘴巴像娶了新媳妇一样。&&&&马回岭镇建在两座山谷中间，设东、南、北三门，西面是陡坡峻岭人畜无法站立，东面是星子方向山势虽不如西面险要，但也易守难攻。南北两门扼守着从九江至德安的唯一通道。蒋浩然的这一搅合，将自己丢在敌人心脏不说，也生生将日军两个师团的生命通道完全切断。当然，如果薛岳同意的话，日军也可以象106师团，走万家岭穿过南山，往西至阳新。&&&&时间紧迫，让蒋浩然一分钟也不敢耽搁，找来几个会开车的士兵，将四辆汽车开出去策应刘大昆。命令炮营将23门150mm榴弹炮运往东面山谷，摆成掎角之势与南门相互策应，机枪营警戒南门，突击营警戒北门，剩下的人将所有的弹药及燃油，分散运至低洼处，避免鬼子的炮弹殉爆，造成不必要的伤亡。&&&&蒋浩然那边的战备紧张有序，刘大昆他们的战火却烧得如火如荼。在一个小时里，鬼子不计损失连续发起四次冲锋都被打退。还好鬼子正集中优势火力在猛攻德安，他们遇到的只是鬼子的运输大队，火力和战斗力都相对薄弱，但终究也是一个大队1000多人。本来他们就是来打突袭的，为了保证快速，弹药都带得不多，一门150榴弹炮早在鬼子的第一次冲锋的时候，许彪一高兴“咣、咣、咣”一顿造，直接将鬼子轰得哭爹叫娘，让他痛快得直呵呵。等鬼子第二次冲锋的时候，许彪才端着空炮弹箱子傻了眼，一气之下，塞了两颗手雷到炮管里轰了走人，又玩他的掷弹筒去了。&&&&蒋浩然第三道撤退命令又下来了，搞得刘大昆头都是大的。他也想退，可就算是留一个连阻击，面对近千人的冲锋能挡多久，鬼子是运输大队，光汽车都有十几辆，他们一旦失去了这有利的依托，被鬼子的汽车一追上，他们不是死得更快？本来预计是将鬼子打残打怕，趁着他们喘息的机会一把火点了仓库就走人。可没想到这些鬼子都象发了疯似的，一次接一次的冲锋，丝毫都不给他们喘息的机会。这不，第五次冲锋又开始了，看来鬼子是领了死命令了，不消灭他们是不会放弃了。而且这一次??????刘大昆一看，傻了眼。&&&&“通信兵？马上给团座回电，就说我刘大昆对不起团座，不能将兄弟们带回去了。”刘大昆惊悚地发现鬼子竟然摆出了“猪突战术”。&&&&“猪突战术”是日军脑残的武士道精神的变种，所有的鬼子赤膊，头戴类似当时女性用的那种带子。喊着“天皇陛下万岁”　像野猪一样不顾一切低头猛冲的战法。&&&&刘大昆终于明白日军为什么，每次用一两个小队，不间断的向他们发起冲锋，原来是用一小部分士兵的性命，来消耗掉他们的子弹，然后集体发起冲锋。因为刘大昆他们依托的是鬼子的物资仓库，鬼子不敢用炮和手雷，迫于无奈只好采取这种玉碎的攻击。而这正好攻击了刘大昆的命门，因为他们大部分都是使用的汤姆逊冲锋枪，没有枪刺。在没有子弹的情况下还不如一把军工铲。这样跟鬼子的三八大盖一拼，纵是一个个都是兵王，在人数武器都不占优势的情况下，其结果可想而知。&&&&但就算是没有胜算，这仗还是要打的，哪怕是拼光了也不能让小鬼子好过。“许彪，带几个人给我将鬼子的仓库点了。兄弟们，鬼子上来了！将手里的子弹、手雷造光，跟鬼子拼了！”&&&&机枪哒哒哒地响起来，随着子弹的打光，枪声渐弱直至全无。最后几颗手雷也丢了出去，鬼子并没有因为前面的倒下，而放弃冲锋。一个个叫嚣着，踏着同伴的尸体往上冲，眼看就要冲进刘大昆他们的掩体了，所有的将士都握紧了手里没有子弹的枪，准备做最后一搏。&&&&突然，从北侧杀出一支队伍，打头的两个人端着捷克式，冲进战壕疯狂地朝着敌人扫射，一个口里叫嚣着：“营长，我们来了！”&&&&另一个大声道：“兄弟们给我狠狠地杀，弹药手，他妈的弹药手死到哪里去了？”&&&&刘大昆没听清他说的是什么，但刘大昆认识他们，他们正是蒋浩然派去66军送信的两个广东兵。“好小子，来得正是时候，给老子狠狠地操！弹药手，给我拿几个弹夹过来？”&&&&日军很快一排排地被收割，决死冲锋撞到金属洪流是一件很恐怖的事情。血肉横飞的场面还是让人胆寒，在自知破敌无望的情况下，日军残余很快潮水般地退了下去。&&&&看着退下去的鬼子，刘大昆拍了拍广东兵的肩膀：“兄弟，这次真是多亏了你们，没办法呀！团座已经连发了三道金牌，命令我马上撤到马回岭去，可一直被鬼子咬着走不开，你看你们能否??????”&&&&刘大昆的声音越说越小直至全无，因为他真的有些说不出口了，人家刚救了你们，哪里还好意思让他们在这里帮你阻敌，你自己拍拍屁股撤退，如果不是蒋浩然逼得紧，打死他这种话他都说不出口。&&&&“行，营长，你就把心放在肚子里，有我们在，绝不让鬼子前进一步。快走吧，团座那脾气可不太好，等下你又要挨爆栗子了。”广东兵想都没想就答应了。&&&&听到广东兵的话，刘大昆只觉鼻子一酸，眼泪就哗哗流了下来。谁都知道在这阻敌意味着什么。但他同时也知道现在不是矫情的时候，低头抹了一把眼泪，哽咽着：“好兄弟，如果有来生我一定还跟你做兄弟！”&&&&另一个广东兵呵呵一笑：“营长你什么时候也变得这么娘们样了。得了，快走吧，跟团座说下辈子我们还做他的兵！”&&&&刘大昆动情地抱了他们一下，猛一回头，吼了一声：“走！”抖着肩，低着头快步往前冲。后面的将士“啪”地给他们敬了一个标准的军礼，默默地跟在刘大昆的后面一路狂奔。
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