大肠癌转移淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库-临床医学论文-论文联盟
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大肠癌转移淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 作者：刘锐 孙立娟 何成彦 周劲松
【摘要】 & 目的 构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库。方法 术中剥取老年大肠癌患者系膜内转移淋巴结，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR，克隆于pComb3 载体,再经电转化大肠杆菌XLI?Blue菌株,形成噬菌体抗体库，最后通过免疫印记法鉴定初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达。结果 从系膜内转移淋巴结中扩增出650 bp重链Fd和轻链基因产物，轻链基因产物插入测得转化菌数为4.7×106，鉴定插入率为70%；重链Fd基因产物测得转化菌数为3.5×106，插入率为60%；免疫印迹法鉴定成功建立噬菌体Fab抗体库，库容量达1.4×106。结论 筛选大肠癌特异性抗原和相应噬菌体抗体，对大肠癌发病机制的研究以及探讨早期诊断方法有重要意义。
【关键词】 & 大肠癌；噬菌体；抗体
　　目前所知的与大肠癌相关的抗体不仅有限，而且特异性不高，因此寻找大肠癌相关特异性抗原以及高特异性、高亲和性抗体一直备受学者关注。抗体技术已
到基因工程阶段，人源性基因工程抗体异源性弱，利用抗体工程技术可提高其亲和力，延长半衰期。用PCR技术克隆抗体可变区基因和在大肠杆菌中表达有抗体活性的免疫球蛋白分子片段，是基因工程抗体技术的两个关键基础条件。噬菌体抗体库技术就是在此基础上发展起来并得到。目前国内外已有学者开展了大肠癌抗体库的研究，并建立了相应库容的大肠癌噬菌体抗体库〔1，2〕。本研究首先从大肠癌患者转移的淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库，并为进一步研究奠定基础。
　　1& 资料与方法
　　1.1& 病例选择&
　　随机选取5例于我院行大肠腺癌（C期2例，D期3例）根治术的患者，年龄均＞60岁,术中剥取系膜内转移淋巴结3～5枚，共18枚（直径均1 cm以上，将所取淋巴结剖为两半，一半留作建库用，一半送检病理），切取大肠癌及正常大肠黏膜层组织各1 g左右。术后这5例患者的切除标本均经病理诊断证实为大肠腺癌，所取18枚淋巴结中，14枚病理诊断证实为转移淋巴结。切取大肠癌组织及正常大肠黏膜层组织各1 g左右。随即置液氮中保存备用。
　　1.2& 载体、菌株和辅助噬菌体&
　　采用噬菌体载体pComb3,由The Scripps Research Institute提供，含质粒CO1E1的起始位点、F1噬菌体的复制起始位点及氨苄青霉素（Amp）抗性基因；轻链及重链Fd的表达均受Lacz启动子控制。整个载体大小4 890 bp。宿主菌采用大肠杆菌XLI?Blue,由The Scripps Research Institute提供,基因型Tn10上带有四环素（Tet）抗性基因。辅助噬菌体采用VCSM13，由The Scripps Research Institute提供，含卡那霉素（Kan）抗性基因，滴度1 012 pfu/ml。自行培养扩增后4℃保存。
　　1.3& 主要试剂&
　　RT?PCR和PCR试剂盒购自Promega，限制性内切酶和连接酶购自 Promega。RT?PCR和PCR引物参照The Scripps Research Institute提供的引物组设计,由上海基康生物技术公司合成。其他化学分析试剂、细菌培养平皿等为国产。
　　1.4& 淋巴细胞的分离纯化、细胞总RNA的提取（Trizol法）、cDNA的合成（Gibco BRL法）& 均按试剂盒说明进行。
　　1.5& PCR扩增Fab抗体基因
　　1.5.1& 引物序列&
　　见表1。表1& 引物序列（略）
　　1.5.2& PCR扩增Fd及轻链基因&
　　(1)在250 μl薄壁PCR反应Eppendorf管中加入：cDNA 2 μl;5′端引物（60 pmol/L）1 μl; 3′端引物（60 pmol/L）1 μl;去离子水71 μl 置94℃ 4～5 min后，立即置于冰上，瞬时离心，在管中加入：10×PCR缓冲液10 μl;25 mmol/L MgCl2 6 μl;10 mmol/L dNTPs 8 μl;Taq酶(5 U/μl)0.5～1 μl，瞬时离心后，加入1～2滴液体石蜡。(2)反应条件：94℃，1 min；52℃，1 min；72℃，2 min。35个循环，72℃延伸10 min，置于4℃。(3)每个反应管中各取5 μl PCR反应物，加入适量TAE缓冲液及DNA凝胶电泳加样缓冲液，在0.8%～1%琼脂糖凝胶中电泳。
　　1.6& PCR产物的纯化（spin?X纯化方法）。
　　1.7& Fd和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立
　　1.7.1& 噬菌体载体pComb3 DNA的制备&
　　将pComb3载体DNA转化XLI?Blu感受态菌，挑取单个菌落接种入30～40 ml SB?A+培养液，次日转种500 ml SB?A+培养过夜DNA提取试剂盒1提取质粒DNA，最后制成5 μg/μl浓度左右的质粒DNA。转贴于论文联盟
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M13噬菌体的生物学特性及其在分子生物学领域的应用
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>> 人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建及筛选
人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建及筛选
&　　摘要：目的构建人丙型肝炎病毒(HCV)特异性噬菌体抗体库，制备人源抗HCV单克隆抗体(mAb)。方法用常规RTPCR法，直接从5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中，扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因，与噬菌体载体pComb3连接，构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行5轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。结果RTPCR可有效地扩增出Fd和κ基因，并以此构建成容量为1.2×107的噬菌体抗体库。经5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集，抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达96％。结论抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCVmAb的制备，为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。
　　中图号：Q782　文献标识码：A　文章编号：00)03-0189-04
Construction and screening of human hepatitis C virus-specific phage antibody combinatorial library
ZHANG Jian-qiong　ZHANG Xue-ping　XIE Wei　LIN Ling　SHAN Xiang-nian
　　（Department of Microbiology ＆ Immunology, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China）
　　WANG Yan
　　（Navy General Hospital Beijing, China）
　　Abstract: Aim Human monoclonal antibodies to hepatitis C virus NS4 mosaic antigen were generated from phage antibody combinatorial library. Methods Employing routine RT-PCR, the human Fd and κ light chains genes were amplified in human peripheral blood lymphocytes from patients infected with HCV by sets of oligonucleotide primers. Phage antibody library was constructed with the Fd and κ chain genes using pComb3 as vector. The affinity selection and ELISA were adopted for identification of specific phage antibodies to HCV. Results HCV-specific phage antibody library was constructed using Fd and κ genes and pComb3 vector. The library size was about 1.2× 107. The HCV-specific phage antibodies were highly enriched after five rounds of biopanning against HCV NS4 mosaic antigen and positive clones were detected upto 96％ by ELISA. Conclusion HCV-specific antibody library and human monoclonal antibodies to HCV can be very useful as molecular tools for research diagnosis and therapy of HCV infection.
　　Keywords: ph HCV; human monoclonal antibody ▲
　　丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎和散发性非甲非乙型肝炎的主要病因，至少有50％的HCV感染者发展为慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。HCV是单链正股RNA病毒，基因组约为9.5kb。HCV基因组有高度的变异性，目前HCV已分为11个基因型和70余个亚型〔1〕。由于HCV基因序列的高度异质性，使HCV的血清学检测和疫苗的研制面临重重困难，在被动免疫中应用中和抗体可能性也受到阻碍〔2〕。Farci等〔4〕的实验表明，在HCV慢性感染者体内有特异性中和抗体。病毒的包膜蛋白是宿主免疫系统的攻击目标，抗HCVE2包膜蛋白超变区(HVR1)的特异性抗体，能封闭HCV吸附培养的人成纤维细胞〔3〕，并能与两株不同基因型的HCV发生交叉反应。因此，制备人源性抗HCV抗体，对于HCV的诊断、治疗、制备疫苗及发病机制的研究等均有一定的价值。噬菌体抗体库技术为人源mAb的制备提供了有效的手段〔5〕。我们用常规RT-PCR技术，从丙型肝炎患者外周血淋巴细胞中扩增抗体基因，构建人源性噬菌体抗体库，并从中筛选到多株抗HCVNS4多基因型嵌合抗原的噬菌体抗体。
　　1　材料和方法
　　1.1材料噬菌粒pComb3购于美国Scripps研究所。辅助噬菌体VCSM13和HRP-羊抗M13抗体为Pharmacia公司产品。M-MLV，Trizolreagent为ISSN细胞与分子免疫学杂志(JCellMolImmunol))
　　Gibco公司产品。限制性内切酶和T4DNA连接酶均为Promega公司产品。其它有关化学试剂均为国产分析纯。HCVNS4多基因型嵌合蛋白，由美国CDC孟继鸿教授惠赠。SB，SOC和LB培养液按常规方法自配。
　　1.2方法
　　1.2.1人外周血淋巴细胞的分离从本院附属医院门诊随机取5例经第2代ELISA试剂检测血清抗HCVIG强阳性，PCR检测HCVRNA阳性的慢性丙型肝炎患者的外周血。每例采血10mL，用淋巴细胞分层液按常规方法制备人外周血淋巴细胞，并用冷PBS洗3次，混合后用倒置显微镜计数，分装(每管5×106细胞)。5例患者经HCV5′端非编码区型特异性引物PCR分型，4例为1b型，1例为3型。
　　1.2.2总RNA提取和cDNA第1链的合成以Trizolreagent提取细胞总RNA，按说明书操作。取RNA2μL测A260nm和A280nm值鉴定其浓度和纯度。另取5μLRNA，用6g/L琼脂糖凝胶电泳检查总RNA的完整性。取10μgRNA溶液，加入Olig。(dT)4μL(0.4μg)，于70℃变性8min，冰浴5min。分别加入5×Buffer10μL，2.5mmol/LdNTP10μL，0.1mol/LDTT5μL，RNA酶抑制物40U和M-MLV400U，用DEPC处理水补足体积至50μL，37℃水浴1h，95℃5min，冰浴10min，于-20℃储存。
　　1.2.3引物设计及扩增Fd和κ基因PCR所用人抗体引物，根据Kang〔6〕的设计加适当改动和简并，由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化。IgG1CH3′端引物为：5′-GCATGTACTAGTTTTGTC-
　　ACAAGATTTGGG；VH5′端引物P1为：5′-SAGG-TGCAGCTCGAGSAGTCTGG(由VH1a与VH3a简并与)；P2为：5′-SAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG(由VHlf与VH3f简并)；P3为：5′-CAGGTGCAGC-TRCTCGAGTCGGG(由VH与VH4f简并)。
　　Cκ3′端引物为：5′-GCGCCGTCTAGAACTAAC-ACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTACGGGCAAG；
　　Vκ5′端引物为：5′-GAMATYGAGCTCACSCAGTC-TCCA(由Vκ1a与Vκ3a简并)。其中M=A或C，S=C或G，Y=C或T。重链引物中分别含有内切酶XhoI和SpeI的识别序列(下画线部分)；轻链引物中分别含有内切酶SacI和XbaI的识别序列(下画线部分)。每管以5μLcDNA为PCR反应的模板，分别对Fd和κ基因进行扩增。
　　1.2.4大肠杆菌的电穿孔转化将2.5mL过夜培养的XL1-Blue菌液，接种在400mL含有四环素10mg/L的SB中，37℃培养至A600nm值为0.5。置冰浴中15min，于4℃离心弃上清，用100mL/L冷甘油水将细菌洗涤3次后，悬于4mL100mL/L甘油中即为感受态细胞。分装(每管0.2mL)，于液氮中冻5min后，取出，置-70℃冻存。按Bio-Rad基因脉冲仪说明书中所述方法进行电穿孔转化。
　　1.2.5噬菌体抗体库的构建κPCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，以QIAGEN凝胶提取Kit纯化，SacI＋XbaI双酶切，再以PCR产物纯化Kit纯化。然后用T4DNA连接酶使之与相应酶切纯化的噬菌粒pComb3连接，电穿孔转化XL1-Blue细胞，扩增转化后的细菌。扩增后提取质粒得到含轻链片段的pComb3。对其进行XhoI＋SpeI双酶切，并与用相应酶切的重链FdPCR产物连接，电穿孔转化XL1-Blue。转化后的细菌加2mL预热的SOC，置37℃振荡培养1h后，转移至SOC固体平板(含氨苄青霉素100mg/L，四环素10mg/L)，于37℃培养24h。用SB洗下菌苔，取20μL菌液加入20mL含氨苄青霉素的SB中，37℃培养至A600nm约为0.5。加入约1011pfu的辅助噬菌体VCSM13，37℃培养1h，再加入终浓度为70mg/L的卡那霉素，振荡培养过夜。离心、收集上清，加入PEG6000到40g/L，NaCl到30g/L，置冰浴1h后，于4℃以12000r/min离心。弃上清，以3mLPBS溶解沉淀，再以12000r/min离心5min，弃去不溶物，收集上清即为噬菌体抗体库。
　　1.2.6噬菌体抗体库的筛选将HCVNS4嵌合蛋白以每孔100ng包被ELISA板条，用30g/LBSA封闭、PBS洗后，加入噬菌体抗体库100μL(约1012cfu)，37℃温育2h。吸出噬菌体抗体液，以PBST洗1次(第2轮洗5次，第3，4，5轮各洗10次)，PBS洗1次，加入100μL洗脱液(0.1mol/LHCl，以甘氨酸调至pH2.2，并含1g/LBSA)于室温静置10min。将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6μL2mol/LTris中和，并加入2mLXL1-Blue，于37℃静置20min后，再加入20mLSB(含氨苄青霉素和四环素)，取10μL稀释铺盘测定cfu。其余细菌置37℃培养2h后，加入VCSM13和卡那霉素。噬菌体的沉淀和收集均按步骤1.2.5中的程序进行。反复进行“吸附→洗脱→扩增”5次淘洗，以使特异性噬菌体抗体高度富集。
　　1.2.7单克隆噬菌体抗体的制备及鉴定将经第5轮筛选、洗脱的噬菌体感染XL1-Blue后划平板，过夜培养。随机挑选细菌菌落，接种于4mL含氨苄青霉素和四环素的SB中，置37℃振荡培养过夜。取200μL加到4mL含同样量抗菌素的SB中，再37℃振荡培养2h，加入40μL的VCSM13培养2h后，加卡那霉素至70mg/L，置30℃振荡培养过夜。离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，置4℃保存。将待检噬菌体抗体与等量10g/LBSA混合后，置室温孵育20min，加到已经HCVNS4嵌合蛋白包被和BSA封闭的ELISA板中，于37℃温育2h。用PBST洗4次、PBS洗2次后，加入HRP-羊抗M13抗体进行结合反应，以TMB显色。实验中采用VCSM13作为阴性对照。
　　2　结果
　　2.1细胞总RNA的提取采用Trizolreagent提取RNA法，每5×106个淋巴细胞可得到6～10μgRNA(A260nm/A280nm=1.5～1.8)。总RNA经琼脂糖凝胶电泳分析，可见28sRNA，18sRNA及5sRNA3条带，其中28sRNA与18sRNA带之间有类似Smear现象，为不同分子量的mRNA
　　2.2Fd基因和κ轻链基因的扩增用Kang设计的3′端及简并后的P1,P2和P33条5′端重链引物，κ链3′端及简并的5′端引物配对后，对5例HC患者混合外周血淋巴细胞的cDNA进行扩增，均可见浓的特异性扩增带。与分子量标准相比较，其DNA片断的大小约为700bp，与推测的抗体重链Fd及κ轻链基因的大小相同技术服务Technical Service
> 技术服务 > 噬菌体展示技术服务
噬菌体展示
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作者: 信息员
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噬菌体展示（Phage Display）技术是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术，以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。应用噬菌体展示，可合成、筛选到许多想要的蛋白（如融合肽、抗体、酶）。这些蛋白具有预期的催化特性或结合亲和力，或者具有用于胞内、胞外诊断、人体疾病免疫治疗和生物催化作用时所需的特异性。
陕西脉元生物科技有限公司可为客户提供多种类型的噬菌体展示文库构建及其筛选服务，包括肽库、限制性肽库、骨架蛋白库、纳米库、cDNA文库以及scFv/Fab抗体库等，通常库容可达到n*108，最高可达n*109-10。
DNA片段展示多采用M13噬菌体展示系统（包括pComb3、pCANTAB5e、pcDNA3.1等噬菌体载体，以及VCSM13、M13K07等辅助噬菌体等）。
1、噬菌体展示库的构建-1
噬菌粒重组载体构建及电转化
将全套DNA片段连接至噬菌粒载体，随后电转化大肠杆菌TG1，同时使用平板计数及DNA测序的方法鉴定展示文库的库容。
2、噬菌体展示库的构建-2
获得噬菌体展示库
将辅助噬菌体加入到对数生长期的TG1菌液中进行噬菌粒拯救；培养过夜后，离心收集上清即或得噬菌体展示库。
抗体库的滴度测定
抗体库的滴度测定
&& 取少量上述获得的噬菌体展示库，梯度稀释后进行噬斑培养实验，观察噬斑生长情况以判断噬菌体展示库的滴度；根据库的滴度，确定后续淘洗时菌液的加入体积。
3、噬菌体展示库的富集筛选
使用靶标抗原报备酶联板，加入噬菌体抗体进行孵育，随后进行洗板洗脱。将洗脱下来的噬菌体抗体进行中和后，再次感染细菌，并进行第二轮的淘洗，重复3-5轮，每一轮都必须进行滴度测定。
服务项目与费用详情
噬菌体展示技术服务项目：噬菌体展示抗体库构建
免疫细胞收集，总RNA提取，反转录成cDNA
以上cDNA为模板，PCR扩增抗体基因片段，并连接至载体（例如pComb3或Pcantab5e载体）
将构建好的载体电转化至大肠杆菌菌株
（1）以上转化菌株复苏后，梯度稀释，并涂布平板，计算阳性克隆；（2）挑选20个阳性单克隆，提取质粒后，进行酶切测序；（3）通过阳性克隆数和酶切验证的结果，计算抗体库库容。
抗体库生产
通过辅助噬菌体拯救获得噬菌体展示抗体库
低温（干冰）运输
噬菌体展示技术服务项目：抗体筛选
SDS-PAGE或其他方法检测抗原质量
预制Fab/ScFv抗体库
人或鼠来源，108至109库容
4轮洗淘，抗体亲和力超过10-7
结合噬菌体的检测（大约40个单克隆）
噬菌体扩增（240元/克隆）
ELISA检测（120元/克隆）
噬菌体DNA提取（120元/克隆）
噬菌体DNA测序（120元/克隆）
抗体检测（5-10个单克隆）
从以上已测序的结合噬菌体中，挑选5-10株不同序列的噬菌体进行抗体的可溶性表达，并进行ELISA鉴定。
实验报告（测序结果等）；抗体基因片段的cDNA
噬菌体展示技术服务项目：IgG的重组表达生产
VL和VH基因片段的密码子优化和基因合成
全抗体重组表达载体的构建
瞬时表达（293/CHO细胞）
抗体制备和纯化（1.0mg）
附加抗体制备和纯化（3600元/mg）