Griess试剂测巨噬细胞NO含量 - 实验交流 - 生物秀
标题: Griess试剂测巨噬细胞NO含量
摘要: [Griess试剂测巨噬细胞NO含量] 我最近在做Griess试剂测细胞炎症反应产生的NO含量，用的6孔板，一般吸光度值做到0 2-0 4之间。做标曲的话用100uL 100umol L的NaNO2与等体积Griess试剂反应也只做到0 9的吸光度值，所以细胞反应中的响应值变动范围相对就比较低。后来换用了碧云天的试剂盒，原理也是Gries 关键词:[血清 培养基 试剂 无血清培养基 吸光度 响应值 巨噬细胞]……
我最近在做Griess试剂测细胞炎症反应产生的NO含量，用的6孔板，一般吸光度值做到0.2-0.4之间。做标曲的话用100uL 100umol/L的NaNO2与等体积Griess试剂反应也只做到0.9的吸光度值，所以细胞反应中的响应值变动范围相对就比较低。后来换用了碧云天的试剂盒，原理也是Griess试剂反应，按它上面的最大量50uL 100umol/L的NaNO2与100uLGriess试剂反应，（终浓度33.3umol/L）,吸光度值做到0.5多，我想继续往下面做，但老师说这样做误差太大，让我找原因，但试了很久都差别不大。想问下大家做的反应响应值大致都是多少的，如果都是这样我就不在这上面耗时间了。拜谢。回复我们用哪个promega做的话，吸光度相对都比较低，要做四个平行，效果还行，碧云天的货常出问题啊回复前辈，我的步骤是这样的，细胞密度是3*10^5，24h后换无血清培养基（担心胎牛血清对药物有影响），适应性培养12h后，换成加药的培养基（无胎牛血清），然后养24h，在535nm测吸光度值，平时大多响应值是在0.3左右。最近经常出现空白培养基和细胞组的响应值高于脂多糖组及其他实验组。不知道前辈有没有遇到这类困扰？希望能够指点下小妹。回复你是 普通培养基没有用血清 还是用的培养可以用的无血清培养基，如果是普通培养基 不加血清，可能细胞已经处于应激状态了，NO可能已经有变化了，你可以直接试试有血清的，或者说血清对你实验其他问题影响比较大，可以试试买个无血清培养基来用回复
你是 普通培养基没有用血清 还是用的培养可以用的无血清培养基，如果是普通培养基 不加血清，可能细胞已经处于应激状态了，NO可能已经有变化了，你可以直接试试有血清的，或者说血清对你实验其他问题影响比较大，可 ... 你好，希望请教您一个问题。
用LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症反应，应该选择哪种LPS？我现在一头雾水，很想得到您的帮助回复
你是 普通培养基没有用血清 还是用的培养可以用的无血清培养基，如果是普通培养基 不加血清，可能细胞已经处于应激状态了，NO可能已经有变化了，你可以直接试试有血清的，或者说血清对你实验其他问题影响比较大，可 ... 好的，真的受益很多。我不知道还有培养用的无血清培养基，我就直接用的加双抗的基础培养基来做了。真心谢谢您。回复
你好，希望请教您一个问题。
用LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症反应，应该选择哪种LPS？我现在一头雾水，很想得到您的帮助... 我用的是sigma标品，大肠杆菌(Escherichia coli)来源的，要买原装的。不过貌似来源影响不大。
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LONZA X-VIVO 15 无血清培养基 详细说明
LonZA X-VIVO 15 无血清培养基
产品中文名称：LonZA X-VIVO 15 无血清培养基
产品英文名称：LonZA X-VIVO& 15 Chemically Defined, Serum-free Hematopoietic Cell Medium,with gentamicin, L-glutam...
LONZA X-VIVO 15 无血清培养基 详细说明
LonZA X-VIVO 15 无血清培养基
产品中文名称：LonZA X-VIVO 15 无血清培养基
产品英文名称：LonZA X-VIVO& 15 Chemically Defined, Serum-free Hematopoietic Cell Medium,with gentamicin, L-glutamine, and phenol red
保存温度：2～8℃ 货号：04-418Q 市场价格：￥1519
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销售的X-VIVO系列无血清培养基是由世界著名的LONZA公司美国生产，该X- VIVO系列无血清培养基是化学成分明确的无血清培养基，X-VIVO无血清培养基提供一个营养成分完全且平衡的体外环境，适合多种细胞类型的无血清培养，包 括LAK细胞、TIL细胞、T细胞、巨噬细胞、干细胞、人体组织的冰冻保存等。LONZA公司生产的所有X-VIVO系列无血清培养基都是在cGMPs洁净车间里生产，X-VIVO系列无血清培养基已被列入美国FDA产品管理档案中。
X-VIVO&系列培养基获得美国FDA备案
X-VIVO系列无血清培养基的特点
●不含任何外源生长因子、人造细胞增殖刺激因子或不明成分的添加剂。
●不含任何蛋白激酶C刺激因子，尤其适用于活化的人和鼠淋巴细胞第二信号系统的研究。
●它的配方完全并且包含药物级别的人白蛋白、重组人胰岛素及巴氏消毒转铁蛋白。
◆X-VIVO 15TM经过优化使之适合于无血清条件下肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的增殖，其配方有助于外周血及人类肿瘤中分离纯化的CD3+细胞的增殖。同时还用于维持人类单核细胞、巨噬细胞及细胞系、粒细胞和自然杀伤细胞（NK）的生长。
◆X-VIVO 20TM经过改进和优化有助于单核细胞耗竭的高密度的外周淋巴细胞制备LAK细胞。
LonZA X-VIVO系列无血清培养基适应的细胞类型
● Human T cells 人T细胞
● Human and murine macrophages 人和鼠巨噬细胞
● Peripheral Blood Lymphocytes 外周血淋巴细胞
● Cryopreservation of human tissue 人体组织的冰冻保存
● Proliferation of draining lymph node lymphocytes 引流淋巴结中的淋巴细胞的增殖
● Human and murine Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) 人和鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）
● Human and murine Lymphokine Activated Killer (LAK) cells 人和鼠淋巴因子激活杀伤细胞（LAK）
● Human and murine hematopoietic stem cells (colony formation and proliferation) 人和鼠造血干细胞（克隆形成和增殖）
X-VIVO产品的应用
◆TIL的增殖
◆PBL的增殖
◆干细胞的培养
◆树突状细胞的培养
◆器官的冰冻保存和移植
◆人单核细胞和巨噬细胞的培养
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LonZA 04-418Q X-VIVO& 15 Chemically Defined, Serum-free Hematopoietic Cell Medium, with gentamicin, L-glutamine, and phenol red 1 L/瓶 ￥1519
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LonZA 04-448Q X-VIVO& 20 Chemically Defined, Serum-free Hematopoietic Cell Medium, with gentamicin, L-glutamine and phenol red 1 L/ 瓶￥1519
应用：造血细胞无血清培养基，应用于树突状等细胞的培养
上海华雅思创生物科技有限公司
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联系人：勾娜娜
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【原创】人单核源性巨噬细胞培养方案（monocyte-derived macrophage,MDM）
楼层直达：
这个帖子发布于2年零211天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
分离外周血单个核细胞（PBMC）1. 300ul肝素（1000IU/ml）至50ml无菌管中，湿润管壁。30ml人外周血，轻轻混匀。2. 向血中加18ml(血量的60%) 无菌3%右旋糖酐（3%dextran in 1XDPBS），轻轻混匀。
室温静置1小时。这时可见红细胞沉在管底。3. 取上清至新的50ml无菌管中，1150rpm(290xg)离心12分钟。离心机设置：without brake（把brake调至0即可）。4. 弃上清，轻弹，将细胞沉淀打散重悬。加12ml预冷的ddH2O, 混匀，8秒后立即加入预冷的4ml 无菌0.6M KCL。然后
立即加预冷的1XDPBS至50ml.
备注：此步骤为低渗休克，动作要领就是液体的加入时间点一定要快！5. 1300rpm(363xg)，离心5分钟。离心机的brake调回正常（9）。
此步离心之后，如果细胞沉淀中还有很多红细胞残留，请把步骤4重复一遍。6. 弃上清，用2.5ml的1xDPBS重悬细胞。
在15ml无菌离心管中加入3ml LymphoPrep(室温保存)，然后将2.5ml细胞悬液缓缓加在分离液上面。
注意加悬液时动作轻柔，不要将悬液打入分离液中，保持清晰的分离界面。7. 400g,室温离心30分钟。WITHOUT brake(0).8. 细胞液分成四层：DPBS液体层，PBMC细胞层（白色的细胞层），分离液体层，中性粒细胞层（白色细胞沉淀）。
在新的50ml无菌离心管中放置25ml预冷的RPMI-1640(无血清！)，用巴氏吸管将需要的PBMC细胞层吸到培养基
中，轻轻吹打均匀。 9.
1200rpm离心10分钟。Brake ON(9).
弃上清，弹打重悬细胞，加入25ml预冷的RPMI-1640(无血清！)，900rpm离心10分钟。Brake ON(9).
再次弃上清，弹打重悬细胞，加入25ml预冷的RPMI-1640(无血清！)，900rpm离心10分钟。Brake ON(9).10. 三次洗涤过后，28ml预冷的RPMI-1640(2%FBS)重悬细胞。计数细胞（30ml外周血数出来2.2X 10 8次方细胞）。
按照每个10CM dish养5-10 X 7次方细胞，将细胞放到4个培养皿中培养。
37度，5%二氧化碳，孵育2小时。11. 将1XDPBS在37度水浴箱提前预热至少30分钟。
将孵育2小时的培养皿取出，镜下观察，可见很多细胞。轻轻摇动培养皿，可见一层白白的细胞附在培养皿底层
（这就是本实验要的monocyte）。
将预热的1XDPBS从培养皿一侧缓缓加入，微微摇动培养皿进行洗涤，然后弃上清。洗涤三次。
备注：动作要快，洗涤不要太用力，禁止吹打（因为此时细胞贴壁不牢）。12. RPMI-1640(GIBCO,已含 2mM l-glutamine，10mM HEPES, 1mM Na pyruvate), 自己加10%FBS, 5%human AB
serum，1%青霉素链霉素。
记得提前预热此培养基30分钟以上。
将预热的培养基加到细胞里。13. 3天后全量换液一次。
6天后可以得到MDM细胞。
不知道邀请谁？试试他们
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我自己试过，这个PROTOCOL不错，很实用。大家可以试试。
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最近养的人巨噬细胞，铺板之后细胞贴壁很好，但是第二天会有细胞漂浮，细胞状态一直不好。
连着4次培养的细胞都这样。找不出来原因在哪，快疯了。
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I find oneIsolation of monocytes by adhesion and cultivationMaterials and reagents? Peripheral blood? 3.8% sodium citrate? 24-well tissue culture plates? 15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes? Ficoll-Histopaque (Sigma)? 1 M CaCl2? 6% Dextran T-500 (Sigma)? Saline? 16 × 125-mm centrifuge tubes? Hanks’ buffered saline? RMPI 1640 medium? Antibiotics? Trypsin-EDTA solution (BioW Intergen)Protocol1. Centrifuge freshly drawn peripheral blood with 0.11 ml of 3.8% sodiumcitrate/ml of blood at 1000g at room temperature for 20 min.2. Remove plasma from cells. Place approximately 8 ml plasma intonew tube and spin for 15 min at 1000g at room temperature.3. Add 5 ml of 6% dextran to cells. Bring volume up to 50 ml withsaline. Invert several times, loosen cap, and let sit for 30 min at roomtemperature.4. Put the remaining plasma into a sterile bottle and add 20 μl CaCl2/mlof plasma (this is now considered to be an autologous serum). Incubateat 37°C for 1 hr.5. Dilute part of the serum 3× with saline.6. Remove supernatant from the dextran sedimentation tube and spinat 350g for 10 min at room temperature. Discard supernatant andsave cells.7. Resuspend these cells in diluted serum (1 to 4 × 106/ml). Place 8 mlcell solution into each of 16 × 125-mm tubes and underlay with 3 mlFicoll-Histopaque. Centrifuge at 1000g for 25 min at room temperature.8. Monocytes are in the band at the interface of the gradient. Removethis layer, put the cells into a 50-ml tube and fill with cold Hanks’buffered saline. Wash twice by centrifugation at 350g for 10 min at 4°C.9. Dilute cells to 2 to 3 × 106/ml with Hanks’ buffered saline. Add 0.1%autologous serum (from Step 4) and place 1 ml cells/well in a 24-well tissue culture plate. Incubate for 2 hr at 37°C.10. Aspirate nonadherent cells, wash once with RPMI 1640, add 2 mlRPMI 1640 medium supplemented with 5% autologous serum andantibiotics, and incubate for 3 to 4 days in a humidified 37°C, 5%CO2 incubator.11. Resulting monocytes/macrophages can be removed by Trypsin-EDTAsolution (aspirate medium from wells, add 0.2 ml Trypsin-EDTA solutioninto each well, and incubate for 5 to 10 min at 37°C). Checkunder the microscope. Pool cells from all wells into a 50-ml tube, addRMPI 1640 medium, and centrifuge at 350g for 10 min at 4°C).Comments1. The resulting population depends on the time of incubation. It iseither a mixture of monocytes and macrophages (with a minor contaminationof other cell types) or, in the case of 4-day or longerincubations, it consists of macrophages only.2. If a sterile cell suspension is required, perform all steps in a laminarflow hood
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yyc12596 最近养的人巨噬细胞，铺板之后细胞贴壁很好，但是第二天会有细胞漂浮，细胞状态一直不好。
连着4次培养的细胞都这样。找不出来原因在哪，快疯了。
在10cm dish中放5X10-7细胞，10ml培养基，3天换液一次，细胞营养不够，所以会漂浮。巨噬细胞会长成f巨噬细胞，细长梭型。
改进方法：20ml培养基，每两天换液一次，AB serum可以提高到10%的比例。细胞长得很好，s-巨噬细胞。就是圆形，有小毛刺样。
6孔板，每孔5X10-6细胞，每孔3ml培养基，3天换液一次。
结论：之前细胞漂浮是细胞营养不够，不贴壁。
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楼主，新手中的新手问个问题，提出来的单核细胞不用加刺激因子就能分化成巨噬细胞么？
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