中华医学会超声医学新技术研讨会——疑难问题解答——宏基因组学测序FAQ
宏基因组学测序FAQ
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1. 宏基因组测序可以用于疾病研究吗，研究一个疾病需要多少样本数？可以，通过肠道微生物与疾病关联分析的方法，对肥胖，肠炎以及糖尿病等疾病进行研究，一般需要疾病的样本约35例，对照组35例,每个样本的数据量约2.5G.具体的情况视疾病差异可作调整。对于疾病的研究，建议分成2步实施，首先对样本进行16S rDNA和whole genome的survey，评估样本的的复杂程度以及宿主的污染情况。第二步根据普查研究的结果，挑选具有代表性的样本进行深度测序，降低了项目实施的风险。 2. 人肠道相关疾病的宏基因组研究需要对照吗？需要，因为样品提取过程中，提取方法的差异，对物种丰度的影响较大，所以需要同时提取疾病组和对照组的样本。虽然我们有人肠道的参考基因集，但是样本大部分来自欧洲，虽然也有中国人的肠道微生物数据，这只能作为分析时的参考，不能与具体样本进行对比分析。 3. Whole genome metagenomics sequencing是否可以构建大片段文库测序?小片段文库测序的数据，一般可以得到1-2k的contigs，对于常规的基因研究已经足够；针对简单的环境样品，在小片段文库的基础上，构建大片段文库测序，组装可以获得更长的序列，得到更好的分析结果。 4. RNA病毒可以进行宏基因组研究吗？须先将病毒RNA链反转成DNA单链，再根据第一链DNA合成第二链，提供双链DNA样品才能进行测序。 5. 16S rDNA测序与全基因组宏基因组测序的区别？16S测序以分类研究为核心，可以提供物种分类，物种丰度以及系统进化分析。宏基因组测序除了能提供物种分类，物种丰度分析之外，还能做基因功能以及代谢通路相关的研究。 6. 宏基因组学可以研究哪些环境中的微生物群落？a．人体微生物，包括口腔，肠道，胃，呼吸道，鼻腔，生殖道，血液，皮肤等等部位的微生物群落。b.动物微生物，包括瘤胃，昆虫肠道等等部位的微生物。c.环境微生物：包括土壤，海洋，湖水，矿地，极地微生物等等。d.植物内生菌：植物的菌根等等。e.工业微生物:酿酒微生物，发酵微生物，沼气微生物等等。f.特殊环境的微生物：矿井、 黄石公园、 古代动物的尸骨、火山口… 7. 能否定制个性化信息分析，如何进行？可结合合作伙伴的需求，协商确定个性化信息分析服务内容。
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上期专题给大家讲述了微生物16S测序专题，本期的宏基因组测序专题开讲啦~
16S rDNA测序及宏基因组测序都是研究微生物的重要方法，那么问题来了：这两者到底有什么区别呢？什么情况下需要做16S测序？什么情况下需要做宏基因组测序？什么情况下需要二者结合使用呢？
那么在开始宏基因组测序专题前，小编需要给大家解决一个非常重要的问题――16S测序和宏基因组测序的主要区别是什么？
在解决这个问题前，小编先要来说说什么是宏基因组测序：
宏基因组测序（MetagenomicsSequencing）是对环境样品中全部微生物的总DNA（也称宏基因组：Metagenomic）进行高通量测序，主要研究微生物种群结构、基因功能活性、微生物之间的相互协作关系以及微生物与环境之间的关系。宏基因组测序研究摆脱了微生物分离纯培养的限制，扩展了微生物资源的利用空间，为环境微生物群落的研究提供了有效工具。
微生物测序研究常用手段包括16S等扩增子测序和宏基因组测序，这两者技术手段的主要区别如下：一、测序原理不同16S rDNA基因存在于所有细菌的基因组中，具有高度的保守性。该序列包含9个高变区和10个保守区（如下图），通过对某一段高变区序列（V4区或V3-V4区）进行PCR扩增后进行测序，得到1500bp左右的序列。宏基因组测序则是将微生物基因组DNA随机打断成500bp的小片段，然后在片段两端加入通用引物进行PCR扩增测序，再通过组装的方式，将小片段拼接成较长的序列。图 细菌16S区域二、研究目的不同
16S测序主要研究群落的物种组成、物种间的进化关系以及群落的多样性。宏基因组测序在16S测序分析的基础上还可以进行基因和功能层面的深入研究（GO、Pathway等）。三、物种鉴定深度不同
16S测序得到的序列很多注释不到种水平，而宏基因组测序则能鉴定微生物到种水平甚至菌株水平。对于16S测序而言，任何一个高变区或几个高变区，尽管具有很高的特异性，但是某些物种（尤其是分类水平较低的种水平）在这些高变区可能非常相近，能够区分它们的特异性片段可能不在扩增区域内。宏基因组测序通过对微生物基因组随机打断，并通过组装将小片段拼接成较长的序列。因此，在物种鉴定过程中，宏基因组测序具有较高的优势。Tips：通常情况下，在微生态研究中，建议同时结合宏基因组测序和16S测序两种技术手段，可以更高效、更准确地研究微生物群落组成结构、多样性以及功能情况。
今天的宏基因组专题普及内容就介绍到这了，有问题的伙伴们欢迎留言给小编一起讨论哦～下期见！什么？！本期专题就结束了吗？还能再来点干货吗？当然没问题~关注我们的公众号！精彩内容尽将呈现~
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联系人：吴先生【美吉生物】宏基因组测序常见问题
1.宏基因组测序总DNA的提取有哪些注意事项？
获得高质量的环境样品总DNA是宏基因组测序能否成功的关键。为了提取的DNA能够代表特定环境样品中的微生物种类，取样时必须严格遵循采样标准，尽量避免对样品的干扰，缩短保存和运输的时间，以尽可能地保持样品的微生物原貌。若要对功能基因簇进行研究，在提取DNA时，既要尽量完全地抽提出样品中的DNA，又要使获得的DNA保持较大的片段，因此在DNA提取时要在最大提取量和最小剪切力之间进行折中。
2.采用Illumina高通量测序平台进行宏基因组测序，应如何构建文库？
从环境样品中提取总DNA后，进行测序文库制备，具体步骤如下：① 用物理方法将DNA随机打断成200～500bp的片段；②
对DNA末端进行平滑化及修复处理；③ 3’末端加“A”碱基；④ DNA两端加上“Y”型接头；⑤ PCR扩增使两端连上不同的接头序列；⑥
检测文库质量。
3.在宏基因组学研究中，功能基因簇研究的技术路线是什么？
功能基因簇的研究方法是通过构建宏基因组文库（BAC、Fosmid、Cosmid），用表型功能的方法筛选阳性克隆并进行测序。具体技术路线如下：
4.如何进行pathway分析?
常用的pathway数据库包括KEGG、Reactome、BioCyc、RegulonDB、
WikiPathwans等。其中，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes）共包含19个子数据库，能对基因功能、基因组信息进行系统分析，并将基因和表达作为一个整体网络进行研究。其子数据库GENES中包含完整或部分的测序基因组序列；Pathway数据库中包含基因功能信息，如膜转运、信号传递、代谢、细胞周期等。KEGG的另一个数据库LIGAND中则储存了大量的化学信息，包括化学物质、酶、催化反应等。另外，KEGG还提供了出色的整合代谢途径查询，结果中不仅包含了所有的可能代谢途径，而且还对参与各步反应的酶进行了全面的注释，如氨基酸序列、PDB链接等。
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宏基因组学在基因发现中的应用分析报告.ppt 21页
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宏基因组学在基因发现中的应用 一、宏基因组学简介 宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学 其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA（也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息
为什么要研究宏基因组学？ 在自然条件下,微生物广泛参与Ｃ、Ｎ、Ｏ和Ｓ等重要元素的循环转化,并在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应、环境污染物降解等方面发挥着重要作用 微生物通过其群落而非单一个体来执行这些重要功能,而目前人们对微生物的认识主要基于实验室纯培养的单一微生物物种,对微生物群落作为整体的功能的认识远远落后于对其个体的认识 二、研究方法及应用 研究方法以基因组测序技术为依托 主要程序： 1、从环境样品 (例如土壤 )中直接提取 DNA;
2、将 DNA克隆到合适的载体中; 3、将载体转化到宿主细菌建立环境基因组文库; 4、对得到的环境基因组文库进行分析和筛选
宏基因组学的应用： 三、在基因发现过程中的应用 宏基因组文库的筛选方法是新基因发现的一种新策略 基因组文库的构建是揭示新基因的前提，如何有效地利用文库中丰富的资源,挖掘新的生物分子是关键 由于环境基因组的高度复杂性,需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因
第1类基基于克隆子的特殊代谢活性(功能驱动) 第2类于核酸序列差异分析(序列驱动) 第3类基于底物诱导基因的表达 第4类基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其它技术.
1、功能分析法 以活性测定为基础 ,通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆 依赖于功能基因或编码功能蛋白在外源宿主中的表达
能够在各种选择性平板上通过可见性状筛选的到产生脂酶、淀粉酶、七叶苷水解酶、甘油脱水酶及抗菌活性的克隆子 方法一：对具有特殊功能的克隆子进行直接检测 ； 方法二：基于异源基因的宿主菌株与其突变体在
选择性条件下功能互补生长的特性进行
2、序列分析法 根据已知的基因和基因表达产物的保守序列设计引物和探针，通过杂交或PCR扩增鉴定出已知基因的同源物,进而筛选阳性克隆子 对鉴定新的基因成员有一定的局限性 ,但它已被有效地用于鉴定系统发育学中的标志基因(如 16S rRNA基因 )和带有高度保守域的酶基因(如聚酮化合物合成酶、葡萄糖酸还原酶和腈水合酶等 )
2.1 随机鸟枪法（Shotgun sequencing）
将一条完整的目标序列随机打断成小的片段 ,分别测序 ,然后利用计算机根据序列间的重叠关系进行排序和重新组装, 并确定它们在基因组中的正确位置 。 优点：为筛选新的天然产物提供了一种可选择的途径, 从中挖掘上百万个新基因,揭示不可培养微生物的代谢途径.
缺点：耗费大,需大量人力和物力；与个体微生物基因相比,对序列片段进行分析则极为困难。
2.2 焦磷酸测序( Pyrosequencing)
焦磷酸测序技术是在焦磷酸盐测序法的基础上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔 ,将基因组 DNA进行随机切割 ,批量地进行整个测序反应，能够在相同的时间内破译 6 × 106组以上的基因组序列 ,比 Sanger法要快100倍 ,提高了测序的效率。 由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。 原理：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物为5'-磷酰硫酸、荧光素。 测序过程:
脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)
DNA聚合酶↓（能和DNA模板的下一个碱基配对）
添加到测序引物的3’末端
↓ （释放）
焦磷酸(PPi)
ATP硫酸化酶↓加入 APS
特异的检测峰
↗ （微弱光检测）
ATP→→→→氧化荧光素（产生可见）
加入荧光素
3、底物诱导基因表达法 第一步：以 p18GFP为载体构建宏基因组文库； 第二步：在无底物情况下以异丙基 —β2D硫代半乳糖苷
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宏基因组测序在疾病研究中的应用解决方案
<span style="color:#. 研究背景
& & & 微生物广泛地存在于人类所处的生活环境中；同样地，微生物对人类健康的影响也具有多样化的特点。已有研究发现，牙周炎/口腔癌（口腔），IBD/CRC/IBS（肠道），银屑病（皮肤）；糖尿病，冠心病，肾结石，肝硬化，胰腺癌，肝癌，慢性阻塞性肺病，肺囊性纤维化，尿道炎/阴道炎/宫颈癌（生殖泌尿）；自闭症，精神分裂症（神经），白血病（循环）等疾病均与微生物有关。因此，研究疾病患者体内微生物群落结构及基因功能对疾病的治疗和预防具有重要意义。
<span style="color:#. 研究方法
& & &&16S rDNA扩增子测序：通过选择特定通用引物，对16S rDNA特定区域进行PCR扩增，进而通过新一代测序技术对该区域进行测序，来分析样本中微生物的群落结构多样性。
& & &&宏基因组测序：利用二代测序技术对样品中微生物的群体基因组进行测序，从而解析微生物群体的物种多样性、进化关系、基因组成、功能多样性及微生物与环境/宿主之间的关系，为发掘和研究特定功能的新基因提供了便利。
<span style="color:#. 研究思路
<span style="color:#. 样本要求
<span style="color:#. 分析流程
<span style="color:#. 分析结果展示
16S rDNA扩增子测序部分分析结果示例
a) 样本间OTU分布和物种组成
b) 微生物群落结构在不同样本组间是否存在差异（PCA, NMDS和PCoA）
PCA（主成分分析）：运用方差分析，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够最大反映方差值两个特征值。如果两个样品距离越近，则表示这两个样品的组成越相似。
NMDS（非度量多维定标法）：非度量多维定标法常用于比对样本组之间的差异，可以基于进化关系或数量距离矩阵。图中点之间的距离越近，反映样本间组成越相似。
PCoA（主坐标分析）：是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过PCoA 可以观察个体或群体间的差异。图中点之间的距离越近，反映样本间组成越相似。
c) 哪些物种在不同组间存在着差异（LEfSe分析）
LEfSe（Linear discriminant analysis Effect Size）线性判别分析是用于发现不同生物条件或环境下的两组或多组样本中最能解释组间差异的基因或功能特征。不同的区域表示不同分组，树枝中红色节点表示在红色组别中起到重要作用的微生物，绿色节点表示在绿色组别中起到重要作用的微生物类群，黄色节点表示的是在两组中均没有起到重要作用的微生物类群。
d) 哪些因素影响了物种的组成（RDA/CCA分析）
RDA/CCA分析主要用来反映菌群与环境因子之间的关系。RDA 是基于线性模型，CCA是基于单峰模型。分析可以检测环境因子、样品、菌群三者之间的关系或者两两之间的关系。环境因子之间的夹角为锐角时表示两个环境因子之间呈正相关关系，钝角时呈负相关关系。环境因子的射线越长，说明该影响因子的影响程度越大；备注：需要客户提供环境因子数据
a) 物种注释和丰度信息
b) COG注释和KEGG注释
c) 组间LEfSe差异判别分析
<span style="color:#. 案例解析
案例1、口腔微生物与肺部微生物及炎症关系的研究
& & &&近年来肺部微生物与宿主的关系已开展了很多研究，由健康人的研究结果可总结为两种类型，分别是pneumotype（SPT）和pneumotype（BPT）。SPT型的Prevotella 和 Veillonell等细菌较多；而BPT型则细菌含量少，多数为试剂和仪器造成的背景菌为主。SPT可以真实反映上呼吸道微生物结构，而BPT主要反映环境引起的误差。目前已有研究发现，健康人的肺泡灌洗液样本中富集了口腔微生物，同时淋巴细胞和中性粒细胞数目增多。但是慢性呼吸道炎症人群中肺部微生物在炎症和免疫中的机制还不清楚。因此，我们运用多组学的方法对此炎症现象进行研究。本研究收集49个个体的肺泡灌洗液（BAL）和上呼吸道样本，分为NYU 、OSU和LHMP三组，利用 Illumina Miseq +454测序平台进行16S rDNA测序，后续进行&-多样性、PCA、群落结构、KEGG注释、LEfSe组间差异比较等生物信息学分析。
原文出处： Segal L N, Clemente J C, Tsay J C J, et al. Enrichment of the lung microbiome with oral taxa is associated with lung inflammation of a Th17 phenotype. Nature Microbiology, 031.
案例2、婴儿肠道微生物的宏基因组研究
& & &&众所周知，新生婴儿肠道处于几乎无菌的状态，随着年龄的增长，其肠道微生物与刚出生时有显著不同。那么人类肠道中的微生物是如何建立起来的，又有哪些因素影响了微生物呢？本文作者利用宏基因组方法研究了瑞士98对母婴的肠道微生物，同时比较了顺产和剖腹产，以及母乳喂养和奶粉喂养对婴儿肠道菌群的影响。研究发现：不同月龄婴儿的肠道微生物组成和功能有显著差异，其中一岁婴儿的肠道菌群与母亲的肠道菌群结构更加相似；并且随着婴儿的不断成长，微生物的种类逐渐减少，而物种的丰富度增加。顺产的婴儿肠道微生物与母亲的更加相似。停止母乳喂养可以加速婴儿肠道微生物的成熟。标志微生物的改变显示婴儿肠道微生物的非随机变化。营养的改变和异型生物质的代谢的变化标志肠道微生物的成熟。本研究选取98个婴儿（新生儿，4个月，12个月）及母亲的粪便样品（15个剖腹产，83个顺产），采用 Illumina Hiseq2000测序平台的PE100测序方法，进行后续的&-多样性、&-多样性、KEGG、CAZy注释等生物信息学分析，从而分析不同月龄、不同喂养方法、不同分娩方式出生的婴儿肠道微生物的差异。
原文出处：B&ckhed F, Roswall J, Peng Y, et al. Dynamics and stabilization of the human gut microbiome during the first year of life. Cell host & microbe. 2015
上海伯豪生物技术有限公司（以下简称&伯豪生物&）2008年12月成立，是一家以科技服务、疾病与健康检测服务、分子检测产品的开发和生产为主营业务的高新技术企业。伯豪生物成立之初依托于上海生物芯片有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心，建立了生物芯片、基因测序、生物标志物筛选验证、分子检测、基因编辑、生物样本分析和生物信息技术平台。公司于日获得高新技术企业认定（2014年通过复审）；2012年3月获批浦东新区企业研发机构。2015年9月，公司完成B轮融资，携手东富龙（证券代码:300171）共创测序服务新局面。2016年，伯豪生物获批成立上海市院士专家工作站；并入选国家发展和改革委员会第一批基因检测技术应用示范中心，承担运行&高发肿瘤及遗传性疾病基因检测示范中心&。
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