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ELISA的概念、原理、操作步骤
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。&(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。&(二) 操作步骤方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10&g/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过一夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以&+&、&-&号表示。也可测O&D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O&D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。&方法二 用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10&g/ml，每孔加0.1ml，4℃过一夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同&双抗体夹心法&的4、5、6。&(三) 试剂器材1. 试剂(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):NaCO3 1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4&12H2O 2.9克 NaCl &8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml(3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10%使用。(4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克/L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml 0.75% H2O232&l(7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3% H2O2 2&l(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。(9) 正常人血清和阳性对照血清。&2. 器材:(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50&l及100&l加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。&(四) 注意事项1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。(2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10&g／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10&g／ml。(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取&方阵法&(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
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3秒自动关闭窗口ELISA实验操作中值得关注的细节大盘点_解螺旋_传送门
ELISA实验操作中值得关注的细节大盘点
医生科研助手
特别福利：关注 "解螺旋" 微信公众号，回复关键词"6月"可索取2016年6月资源包 "实验常用protocol+质粒图谱大全"。（）作者：解螺旋·子非鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手导语酶联免疫吸附测定（ELISA）因其具有敏感性高、特异性强等优点，被广泛应用于临床检测中的各种抗原和抗体的测定。尽管ELISA操作简单，但是小实验里也蕴含着大文章，ELISA操作各个环节对实验的检测效果影响较大，稍不注意就会产生假阳性或假阴性的结果。现在小鱼就跟大家818应用ELISA应该了解的一些常识。 ELISA分类及具体过程 一般，ELISA可分为以下四大类：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争抑制ELISA。其他的ELISA都隶属于这四类ELISA或由这四类ELISA组合衍生。 ELISA的具体操作的视频链接：回复ELISA，即可查看这几类ELISA操作的具体原理及其protocol。下面分析ELISA实验操作中可能影响结果的原因，并给出相应的解决方法。 样品收集和保存用于ELISA测定最常用的临床标本是血清（浆）。要注意避免严重溶血，因为血红蛋白中含有具有类似过氧化物活性的血红素基团，在孵育时很容易吸附于固相，与HRP底物反应产生假阳性。 样品采集及血清分离中要注意避免细菌污染，一方面细菌分泌的酶可能对抗原抗体等蛋白产生分解作用，另一方面，细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶会对相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 样品应该要避免反复冻融。因反复冻融所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。另外，样品混匀时，不要剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。 一般而言，如果在收集样品的当天进行检测，可将样品及时储存在4℃备用；而对隔天再检测的样本，应及时分装后冻存在-20℃备用，若要长期保存样品，最好将其置于-70℃冻存。试剂准备 在实验开始前，需将试剂盒从冰箱中拿出来在室温放置20min，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡，也可使温育时反应孔内的温度能较快的达到所要求的高度，以满足测定要求。 其次，目前商品中ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验过程中对其所提供的浓缩液进行稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应该保证质量。此外，底物反应液应该反应显色前进行现配现用。同时，为了保证实验的均一性，实验中所有试剂在加样前必须摇匀。 加样 因ELISA的灵敏度较高，则应该按规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。 加样品时，单孔用量要求：≥20ul/指标，如需要做2个复孔则血量≥60ul/指标。如果用量充足，最好提供50ul/孔/指标。具体用量也需根据试剂盒的要求而定。 吸取样品时，加样枪头不应粘附多余的液体；加样时不可90度向孔中滴加液体，否则会导致液体残留在吸头上，加样不准确。正确加样方法应为45度，吸头贴着孔壁和液面的交界处加入。加样时速度不可过快，否则无法保证微量加样的准确性和均一性；要避免样品加在孔壁上部而产生非特异性吸附。不可将样品溅出以避免对邻近孔产生污染。 孵育 一般，孵育时间与温度成反比，即温度越高，所需时间相对较短。最常用的孵育温度为37℃，孵育1-2h。 孵育时应贴封片或加盖，避免样品或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗。孵育时，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。同时，应严格控制孵育时间，避免因时间过长导致紧附于反应孔周围的非特异性结合。 孵育时，要尽量排除“边缘效应”，即96孔板的外周孔显色较中心孔深。究其原因，是因为96孔板周孔与中心孔的表面或热力学特征不同。因此，可采用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至孵育温度（37℃）。 洗板 为了确保ELISA测定的特异性，洗板可清除非特异性结合物质，减少背景信号，增加分析的信噪比。 手工洗板时，拍板要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离。使用半自动洗板时，应经常检查冲洗头是否通畅，若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出。为了达到较好的洗涤效果，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，即在机器洗涤后再进行人工洗板1-2次。 以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05% Tween20的中性PBS，其中，吐温20的浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低实验的灵敏度。 显色 目前以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。显色剂配制后放置时间过长（肉眼可见浅蓝色的TMB时）要弃之不用。 在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。 显色反应条件一般为37℃或室温反应15-30分钟。加终止液时，要避免气泡产生而引起的假阳性。 读板 读板时要保证酶标板清洁，同时也要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。 通常，单波长读板的测定值一般是指以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长读板的测定值一般是敏感波长如450nm的吸光值与非敏感波长下如630nm的吸光值之差，可排除板内脏物的影响。 同时，由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。 数据结果分析ELISA的测定结果可分为两种：定性测定和定量测定。前者只需确定阴性或阳性即可；后者则需要给具体的数值。在定量测定中，经常要将标准品所获得的吸光值进行标准曲线的绘制。下面则简单介绍用excel绘制标准曲线的方法 1）输入相应数据2）选中相应数据3）选择表格中，菜单栏中的插入|散点图中第一个类型 4）选中“图表工具”中的“快速布局”中fx图标，即可得到以下图表。Excel版本较低的可以直接跳到第6）步。5）点中坐标轴标题，可做修改。修改后可获得以下标准曲线。6）或者在较低版本的excel中，在“图表工具”选项中，选择趋势线|线性趋势线。7）选中图表中的趋势线，右键，选择“设置趋势线格式”，在弹出的对话框中，将“显示公式”勾选上，点击关闭，也获得标准曲线。8）可将试验管中所测的吸光度值代入图表中的公式Y=1.001x+0.0171后可得到所求成分的含量，即X的值。 ELISA的疑难杂症 1）显色浅，灵敏度低2）假阳性多，本底高甚至花板3）重复性不好4）白板精彩内容回顾（回复左边数字查看）：51：一个神奇的网站：检索、分享、同行互助一站搞定52：干货 |三天征服高冷女神Chip记53：Endnote，知道这些才算够！54：分享 | 高水平SCI的七步成文法55：论文投稿开始要求图形摘要了，怎么弄？56：3款语言神器，从此告别英文写作图样图森破57：Pubmed检索实用指南：精准搜索和全文下载58：干货 | 除了找文献，Pubmed还能干这些59：如何在七天内写出一篇漂亮的英文综述60：想和期刊编辑愉快的扯淡，你需要这些…（编辑信件回复模板集萃）回复SCI、国自然、信号通路、CNS、实验工具、统计查看相应专栏文章！投稿邮箱： .cn合作微信：helixlife6公告：经与讲师沟通，为提升授课效果，Meta分析课程时间将调整至07.16（周六下午）-07.17（周日上午、下午），请已报名学员注意！
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6月29日 22:55
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这是一个重定向条目，共享了的内容。为方便阅读，下文中的酶联免疫吸附剂测定已经自动替换为ELISA，可点此恢复原貌，或使用备注方式展现目录1971年Engvall和Perlmann发表了（enzymelinkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附剂测定）用于定量测定的文章，使得1966年开始用于定位的酶标技术发展成液体中微量物质的。1 酶联免疫吸附剂测定基本原理这一的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相表面，并其活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起。用的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接，故可根据颜色反应的深浅刊物或。由于酶的催化很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的度。2 方法类型和操作步骤酶联免疫吸附剂测定可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶的底物。根据试剂的来源和标本的以及的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。2.1 （一）双抗体夹心法双抗体夹心法（图15-4）是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
图15-4双抗体夹心法测抗原示意图
（1）将抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
2.2 （二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原上两个不同的分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双一步不但简化了操作，缩短了，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的酶联免疫吸附剂测定提高到新水平。
图15-5双位点一步法示意图
在一步法测定中，应钩状（hookeffect），类同于中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现结果。2.3 （三）间接法测抗体间（图15-6）是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
图15-6间接法测抗体示意图2.4 （四）竞争法竞争法（图15-7）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。
（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
图15-7竞争法测抗原示意图
2.5 （五）捕获法测IgM抗体血清对某些抗原的特异性常和特异性IgG同时存在，后者会IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法（图15-8），先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
图15-8捕获法测IgM抗体示意图
（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
（2）加入稀释的血清标本：保温反应清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
（4）加对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为反应。2.6 （六）应用亲和素和生物素的酶联免疫吸附剂测定亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个分子亲密结合。现在使用更多的是从中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的，生物素－亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与、和酶等多种类型的分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高酶联免疫吸附剂测定的敏感度。
亲和素－生物素在酶联免疫吸附剂测定中的应用有多种形式，可用于间接，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规酶联免疫吸附剂测定中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。桥联法ABC-酶联免疫吸附剂测定（avidinbiotincomplex-酶联免疫吸附剂测定）夹心法测抗原的过程见图15-9。
图15-9桥连法ABC-酶联免疫吸附剂测定夹心法测抗原示意图
3 酶联免疫吸附剂测定的技术要点酶联免疫吸附剂测定的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的。3.1 试剂的制备酶联免疫吸附剂测定的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。3.1.1 （一）固相载体可作酶联免疫吸附剂测定中载体的物质很多，最常用的是聚。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为，可制成各种形式。在酶联免疫吸附剂测定测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。
酶联免疫吸附剂测定载体的主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最入分光光度计中比色。小珠一般为直径0.6cm的圆球，表面经磨砂处理后吸附大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于酶联免疫吸附剂测定测定的也称为酶联免疫吸附剂测定板，国际通用的标准板形是8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联或12联孔条的，放入座架后，大小与标准酶联免疫吸附剂测定板相同。酶联免疫吸附剂测定板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的酶联免疫吸附剂测定检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。
良好的酶联免疫吸附剂测定板应该是吸附性能好，值低，孔底高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯酶联免疫吸附剂测定板由于配料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大。因此每一的聚苯乙烯制品在使用前须其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被酶联免疫吸附剂测定板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgG抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。反应条件，使各读数在0.8左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10％。
与聚苯乙烯类似的塑料为聚。作为酶联免疫吸附剂测定固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。
为不同固相在某一酶联免疫吸附剂测定测定中的优劣，可用以下方法加以：用其它测定方法选出一个典型的阳性标本和一个典型的标本。将它们分别进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的酶联免疫吸附剂测定操作步骤进行测定，然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别最大，这种载体就是这一酶联免疫吸附剂测定测定的最合适的固相载体。
除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如膜、膜等，这类测定形式将在本章第五节“膜载体的酶免疫测定”绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，固相微粒悬浮在溶液中，具有液应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的仪器。
3.1.2 （二）抗原和抗体在酶联免疫吸附剂测定实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体高、亲和力强。
酶联免疫吸附剂测定所用抗原有三个来源：天然抗原、抗原和合成抗原。天然抗原取材于动物或、培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分后才可应用，因此也称提纯抗原（purifiedantigen）。重组抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，质少。因此虽然制备合成抗原有较高的技术难度且要求较为昂贵的仪器设备和试剂，其应用仍十分普遍，特别是对那些天然抗原不易得到的试验，更显出其独到之处。
用于酶联免疫吸附剂测定的抗体有多的和单克隆的。成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经铵纯化的IgG可进一步用各种分子筛提纯。也可用亲和层析法提纯特异性IgG，如用酶IgG后提取的Fab片段，则效果更好。3.1.3 （三）免疫吸附剂固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯酶联免疫吸附剂测定板为载体，通常将抗原或抗体溶于（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于酶联免疫吸附剂测定板孔中在4℃过夜，经后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面有能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1％～5％清包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的酶联免疫吸附剂测定板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。
3.1.4 （四）酶和底物酶联免疫吸附剂测定中所用的酶要求纯度高、催化反应的高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或质稳定，继续保留着它的活性部分和催化。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和，价格低廉，有色产物易于测定，光高。酶联免疫吸附剂测定中最常用的酶为过氧化酶（HRP）和从粘膜或提取的（）。
HRP在蔬菜辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约18％；分子量为44kD；是一种，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP催化下列反应：
上式中DH2为供氢体，H2O2O为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于子醇的和的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H2O2方便。许多可作为HRP的供氧体，在酶联免疫吸附剂测定中常用的供氢体底物为邻苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基（3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS[2，2＇-azino-bis（3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6）]。
OPD为在酶联免疫吸附剂测定中应用最多的底物，高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。HRP催化OPD的反应如下：
HRP的纯度用RZ（ReinheitZahl，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥3.0。应注意的是酶变性后，RZ可不变而活力降低，故重用时更重要的指标为活力。以单位表示：1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。
在酶联免疫吸附剂测定中另一常用的酶为碱性磷酸酶。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。一般采用对酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。反应式如下：
在酶联免疫吸附剂测定中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在酶联免疫吸附剂测定中一般均采用HRP。
除HRP和AP以外，在商品酶联免疫吸附剂测定试剂中应用的酶尚有、和脲酶等。β-苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），经酶水解后产生物质4-甲基伞酮（4-mehtylumbelliferone），可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液pH改变，可使变色；另外，在内没有内源酶（酶的化学发光底物见第十八章）。
3.1.5 （五）结合物酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学不同，可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原，基本上可参考标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。
1．交联法戊二醛是一种双团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。举例如下：
2～5mg纯抗体与5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸缓冲液1ml中，4℃下对同上缓冲液。磁力搅拌下，缓慢加入1％戊二醛0.05ml，在室放置2小时。在4℃下对0.05mol/LpH8.0Tris缓冲液透析平衡，即得酶标抗体。
辣根过氧化物酶可于50％饱和度硫酸铵中。用上法交联后可用50％饱和度硫酸铵沉淀酶标抗体，弃去上清中游离酶。
戊二醛一步法操作简便、有效，而且好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。
制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。
2．过盐氧化法本法只用于HRP的交联。该酶含18％，过碘酸盐将其分子表面的氧化为。用（NaBH4）中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈，各批实验结果不易重复。
按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响酶联免疫吸附剂测定中最后的测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多，分离大分子的方法均可应用。硫酸铵操作简便，但效果不如用SephadexG-200的好。
3.2 最适工作浓度的选择在建立某一酶联免疫吸附剂测定测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例，介绍最适工作浓度的选择方法。3.2.1 （一）间接法测抗体1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。
（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。
（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸（A），绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。
2．棋盘选择包被抗原工作浓度
（1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。
（2）将性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，保温，洗涤。
（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，保温，洗涤。
（4）加底物显色。加酸终止反应后读取A值。
（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果，表中数字为A值。从表中可见1:200为最舒适的工作浓度。
表15-1 间接包被抗原工作浓度的选择
抗原稀释度
3.2.2 （二）夹心法测抗原在夹心法酶联免疫吸附剂测定法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度，举例如下（表15-2）：
表15-2 夹心酶联免疫吸附剂测定包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
包被抗体的浓度及酶标抗体稀释度
强阳性（25ng/ml）
弱阳性（1.5ng/ml）
（1）抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml，分别在酶联免疫吸附剂测定板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。
（2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗涤。
（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:0和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中，保温，洗涤。
（4）加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。
（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml，酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘。3.3 测定方法的标准化要使酶联免疫吸附剂测定测定得到准确的结果，不论是定性的还是定量的，必须严格按照的方法制备试剂和实施测定。主要试剂的制备要点已如前述，其他一般性试剂，如包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应终止液等，配制时不可掉以轻心。缓冲液可于冰箱中保存，使用前应观察是否变质。的质量在酶联免疫吸附剂测定中也至关重要，最好使用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使空白值升高。
测定的实施中，应力求各个步骤操作的标准化，下面以板式酶联免疫吸附剂测定为例，介绍有关注意事项。3.3.1 （一）加样在酶联免疫吸附剂测定中除了包被外，一般需进行45加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。3.3.2 （二）保温在酶联免疫吸附剂测定中一般有二次，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各酶联免疫吸附剂测定板不应叠在一起。为避免，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是的，传热容易。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃，酶联免疫吸附剂测定板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。3.3.3 （三）洗涤洗涤在酶联免疫吸附剂测定过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在酶联免疫吸附剂测定测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯（吐温，Tween）一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧去水酯，为非型的物质，常作为助。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号，结合的为，在酶联免疫吸附剂测定中最为常用。它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。
洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。
酶联免疫吸附剂测定板的洗涤一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗涤液注满板孔；③放置2min，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。3.3.4 （四）比色如阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。如用比色计测定结果，准确性决定于酶联免疫吸附剂测定板底的平整与透明度和比色计的质量。相关文献
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