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【求助】关于细菌接合转移的细节求教，请做过此类实验的大虾不啬赐教
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这个帖子发布于6年零118天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
感谢各位大虾的帮忙，说明下情况小弟最近正在做细菌的结合转移实验，前期做过两轮，但实验结果不甚理想，觉得盲目地做还是不行，所以想针对接合转移的细节向大虾求教一二：1.供体菌与受体菌不来源于一个菌属，是否影响接合转移实验的成功率：
因为小弟所研究的供体菌为鲍曼不动杆菌，而实验室所有的受体菌均为大肠杆菌（目前大部分文献中也都是使用EC600或者J53的大肠杆菌，有极少数文献使用了沙门氏菌作为受体菌），供体菌属于莫拉菌科的鲍曼不动，而受体菌是属于肠杆菌科的大肠埃希，这两者进行接合转移是否存在影响，还是只要存在F质粒并且菌体具有性菌毛就能相互传播？？？2.菌体发酵时间问题
这个问题可能不算是接合转移的问题，因为实验和书本基本都是说取对数期的菌体做实验最佳，但对于每种菌甚至每株菌的生长对数期都是不一样的，查过相关文献，大部分都是以OD600 在0.4-0.6时为该菌株的对数期，但问题是培养基的量，接种的原始种子菌的量都没有一定的规定，因为种子菌的量会直接影响到OD600的数值，原本就很浓的菌液只培养一小段时间自然会很快达到OD600在0.4-0.6
基本上没有类似“0.5个麦氏浊度1ml 加到500ml的LB肉汤培养基中，37℃ 150-180转/分培养16小时”之类的描述......3.是否需要在培养基中加入一定浓度的抗生素
小弟对于第一步的在供体菌和受体菌培养时加入所对应的抗生素，理解是为了防止接种时带入其他杂菌以致影响培养（不知道是否还有其他的原因，希望大虾指点），那么对于进行接合转移时，供体菌和受体菌共同培养的培养基中是否应该加入各自对应的抗生素呢？？
如果加入抗生素会不会对接合子带来什么抗生素的压力诱导呢，还是应该在整个接合转移的过程中均不使用抗生素（基本上在超净工作台里工作，带入杂菌的可能性还是很小了）？？？3.接合子接种抗生素筛选平板时的接种方式：
实验室的师姐说对于接合子接种抗生素平板筛选时，她是直接将静置后的混合菌液摇匀然后用接种环挑去一环划线接种于抗生素平板，也有文献写是去适量菌液然后涂布在抗生素平板上，看起来后者似乎更好些，但问题是这个适量菌液到底是多少呢？4.接合转移有效率的指标
因为很少有文献提到接合转移的有效率问题，基本上都是报道成功或者失败，因此小弟想到底通过什么指标来反映那种温度、PH值、接种量等等条件下最佳的接合转移情况呢？
在国内一篇文献《大肠埃希氏菌耐药性水平传递研究》（西北农业学报，只帅，席魅力等）探讨了不同受供体比例、不同温度、不同时间等，但对于接合转移有效率的影响，但没有具体列出评价有效率的指标，在网络上看到，使用“接合转移率=（接合子菌数/受体菌菌数）*100%”来计算，但问题是一般的细菌计数（我所知道的就是将菌液比例稀释后与琼脂混匀倒板计数；直接涂布计数；类似细胞计数板计数这三种，也有说采用分光光度计的方式来与麦氏浊度比较）都很粗糙，这样是否能达到标准呢？？？以上就是小弟在接合转移实验中遇到的问题，希望各位大虾不啬赐教啊
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1.肠杆菌科细菌容易接合，鲍曼不动杆菌难度大，本人做过一两次没成功。个人觉得，EC600容易接合，且对利福平耐药，容易筛选。J53不好接合，而且很多临床分离菌对喹诺酮类耐药，所以用奈啶酸做筛选也不合适。2.对数生长期大概就是LB肉汤摇菌3-4小时。像肺炎克雷伯菌这种生长迅速的3h差不多了，EC600和鲍曼不动杆菌生长都比较慢，4h差不多。3.供体菌和受体菌共同培养的培养基不用加抗生素。接种方式。根据接合效率而定，结合效率高的10-20ul足以，可以长出几十或几百个单菌落，接合效率低的可以加100-200ul（如果量太大琼脂板吸收不了），用接种环均匀涂布。细菌长的一团糟除了可能是接种量太大，很多时候是因为筛选平板的抗生素浓度太低。4.个人认为接合效率也是粗略估计，很难绝对准确。很多文献都是写10-6~10-8。
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一个实验做到如此细致,不容易~~~不知道你研究这个结合转移效率的目的, 一般做结合就是为了把一些不好转化的质粒送进去, 根本不在乎这个效率, 只要有一个结合成功的菌落生长起来, 就是实验成功.相信你肯定不是仅仅转个质粒~~~研究大肠杆菌获得外源基因的能力？
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blowapc 一个实验做到如此细致,不容易~~~不知道你研究这个结合转移效率的目的, 一般做结合就是为了把一些不好转化的质粒送进去, 根本不在乎这个效率, 只要有一个结合成功的菌落生长起来, 就是实验成功.相信你肯定不是仅仅转个质粒~~~研究大肠杆菌获得外源基因的能力？主要是觉得每次看文献都很郁闷，特别是微生物方面的文章，一个摇菌就说过夜，到底过夜是多久啊——10小时也可以说是过夜、15小时也可以说是过夜啊...还有就是看见有些文献写到了接合转移的效率，其实我也是想尝试对于不同温度、PH值等等因素来探讨接合转移的影响问题“研究大肠杆菌获得外源基因的能力？”这个还真没考虑到，目前是因为师姐毕业时发现一个耐药基因，而且定位是在质粒上，但问题就是做了几次接合转移都未成功，老板想让我沿着这个做下去，而实验室里的接合转移都没有个什么规范操作....所以有些郁闷了
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江南菜仔 1.肠杆菌科细菌容易接合，鲍曼不动杆菌难度大，本人做过一两次没成功。个人觉得，EC600容易接合，且对利福平耐药，容易筛选。J53不好接合，而且很多临床分离菌对喹诺酮类耐药，所以用奈啶酸做筛选也不合适。2.对数生长期大概就是LB肉汤摇菌3-4小时。像肺炎克雷伯菌这种生长迅速的3h差不多了，EC600和鲍曼不动杆菌生长都比较慢，4h差不多。3.供体菌和受体菌共同培养的培养基不用加抗生素。接种方式。根据接合效率而定，结合效率高的10-20ul足以，可以长出几十或几百个单菌落，接合效率低的可以加100-200ul（如果量太大琼脂板吸收不了），用接种环均匀涂布。细菌长的一团糟除了可能是接种量太大，很多时候是因为筛选平板的抗生素浓度太低。4.个人认为接合效率也是粗略估计，很难绝对准确。很多文献都是写10-6~10-8。谢谢大虾了，那个“用接种环均匀涂布”，是直接密集划线？因为想起做MIC时用无菌棉签均匀涂布或者玻璃制的涂布装置均匀涂布，这样可行吗？
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江南菜仔 1.肠杆菌科细菌容易接合，鲍曼不动杆菌难度大，本人做过一两次没成功。个人觉得，EC600容易接合，且对利福平耐药，容易筛选。J53不好接合，而且很多临床分离菌对喹诺酮类耐药，所以用奈啶酸做筛选也不合适。2.对数生长期大概就是LB肉汤摇菌3-4小时。像肺炎克雷伯菌这种生长迅速的3h差不多了，EC600和鲍曼不动杆菌生长都比较慢，4h差不多。3.供体菌和受体菌共同培养的培养基不用加抗生素。接种方式。根据接合效率而定，结合效率高的10-20ul足以，可以长出几十或几百个单菌落，接合效率低的可以加100-200ul（如果量太大琼脂板吸收不了），用接种环均匀涂布。细菌长的一团糟除了可能是接种量太大，很多时候是因为筛选平板的抗生素浓度太低。4.个人认为接合效率也是粗略估计，很难绝对准确。很多文献都是写10-6~10-8。J53的话，我实验室这边是用叠氮化钠筛选的，这个感觉还可以，确实不同种属间确实难以转移些...
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目的是让菌液均匀分布在平板上，用什么涂、怎么涂都关系不大了，关键是不要把污染菌带进去。另外，供体菌和受体菌共同培养时不要摇，孵箱静置即可，一般过夜，有的2-4h也能接合过去。
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江南菜仔 目的是让菌液均匀分布在平板上，用什么涂、怎么涂都关系不大了，关键是不要把污染菌带进去。另外，供体菌和受体菌共同培养时不要摇，孵箱静置即可，一般过夜，有的2-4h也能接合过去。恩，谢谢大虾了，因为似乎没有找到一个比较规范化的程序，我们实验室都是大家自己摸索一个程序然后做的出来就一直这样做的我师姐给我的方法就是供体菌或受体菌约1个菌落置于5ML的LB肉汤培养基中，37℃，180转每分摇12小时（我也不知道这样摇菌会不会老掉）；然后供体菌、受体菌各取500微升加入到4ML的LB肉汤中，37℃，80转每分摇4小时；静置4小时；最后用抗生素平板接种培养但碰到另外个师兄又稍有不同了....感觉很混乱，正好我想研究下不同的温度、PH值环境等对于接合转移有效率情况的影响，但看了文献基本都是很模糊的说...
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ixiaocai 主要是觉得每次看文献都很郁闷，特别是微生物方面的文章，一个摇菌就说过夜，到底过夜是多久啊——10小时也可以说是过夜、15小时也可以说是过夜啊...还有就是看见有些文献写到了接合转移的效率，其实我也是想尝试对于不同温度、PH值等等因素来探讨接合转移的影响问题“研究大肠杆菌获得外源基因的能力？”这个还真没考虑到，目前是因为师姐毕业时发现一个耐药基因，而且定位是在质粒上，但问题就是做了几次接合转移都未成功，老板想让我沿着这个做下去，而实验室里的接合转移都没有个什么规范操作....所以有些郁闷了质粒大不大?如果大小凑合,直接提质粒,然后电击转化,电击转化bac,fosmid都可以转,大肠杆菌电击感受态制作方便,不知道你们这个实验用电击行不行?
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江南菜仔 目的是让菌液均匀分布在平板上，用什么涂、怎么涂都关系不大了，关键是不要把污染菌带进去。另外，供体菌和受体菌共同培养时不要摇，孵箱静置即可，一般过夜，有的2-4h也能接合过去。如果是消耗型抗生素,例如氨苄,就不能用涂布了吧?
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blowapc 如果是消耗型抗生素,例如氨苄,就不能用涂布了吧?这个是什么原理呢？请大虾讲解一下
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blowapc 质粒大不大?如果大小凑合,直接提质粒,然后电击转化,电击转化bac,fosmid都可以转,大肠杆菌电击感受态制作方便,不知道你们这个实验用电击行不行?电转可能设备条件不允许，貌似几个熟悉的实验室都没有电转的设备
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ixiaocai 这个是什么原理呢？请大虾讲解一下消耗型抗生素，怎么说呢，就是使用过程中会出现消耗~~~比如氨苄，我们做TA克隆的时候，培养时间较长会有卫星菌落生长，这就是抗生素被消耗掉了，让本来没有抗性的细菌生长~~~
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ixiaocai 电转可能设备条件不允许，貌似几个熟悉的实验室都没有电转的设备如果质粒大小适中，电转应该最方便。你那个质粒多大？如果合适，找个公司寄过去，让他们给做了得了~~找找周围其他单位有没有电转仪，借用一下也可以~~~如果大小比较合适，要不就寄给我，我给你转了~~呵呵~~
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blowapc 如果质粒大小适中，电转应该最方便。你那个质粒多大？如果合适，找个公司寄过去，让他们给做了得了~~找找周围其他单位有没有电转仪，借用一下也可以~~~如果大小比较合适，要不就寄给我，我给你转了~~呵呵~~谢谢斑竹，太热心了我师姐说当时测的一个大小是14K的样子不过，感觉当时她做的有些不太严谨，因为当时她说提取质粒的时候只提取到一个质粒，正好就是那个携带耐药基因的质粒甚是怀疑...目前正在手工提质粒，然后准备逐个切胶回收再PCR验证
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14k电转够了哈~~
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看到各位前辈们的帖子感觉有点像找到了救星 我打算做质粒的传递 一个大肠杆菌从提取的质粒想看是否可以传递进乳酸杆菌中 不知是否可行 请指教 谢谢！
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受体菌应该是没有接合转移能力的菌株吧，请问有耐链霉素的受体菌大肠杆菌吗，受体菌有什么要求
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各位大侠，小硕在做转座子突变体库（E.coli），用接合转移将含有转座子和转座酶基因的质粒转入受体菌。但是效率不是很高。宿主和受体都是大肠，接合条件是37度4小时。担心接合时间长，突变体库的重复性会比较高（接合早的会复制）。故在考虑用Ca2+转化或者电转（这两个应该重复只由插入时的重复造成，个人认为）。有没有哪个大侠看到过有关电转、钙转、接合之间转化效率的研究。做转座子突变体库适不适合用钙转或者电转？
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zt滔滔江水 各位大侠，小硕在做转座子突变体库（E.coli），用接合转移将含有转座子和转座酶基因的质粒转入受体菌。但是效率不是很高。宿主和受体都是大肠，接合条件是37度4小时。担心接合时间长，突变体库的重复性会比较高（接合早的会复制）。故在考虑用Ca2+转化或者电转（这两个应该重复只由插入时的重复造成，个人认为）。有没有哪个大侠看到过有关电转、钙转、接合之间转化效率的研究。做转座子突变体库适不适合用钙转或者电转？ 效率可能跟细菌生长的装态有关，你用的什么转座子？以前做过一次转座突变库，用的IPTG诱导型的，效率还凑合，几百个是没问题，再多了也不想筛，后期工作量太大了也麻烦。
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用的是put mini Tn5 cm。载体是一个自杀质粒，因此直接结合转移，氯霉素抗性上长的一般都是。
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zt滔滔江水 用的是put mini Tn5 cm。载体是一个自杀质粒，因此直接结合转移，氯霉素抗性上长的一般都是。 IPTG诱导型的？
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IPTG诱导型的？ 没有任何诱导。
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zt滔滔江水
没有任何诱导。 携带转座子的质粒，如果一直保持常态表达转座酶，那么它的宿主菌基本上就被搞得不像样子了。宿主菌在培养过程中受得了几个插入？建议你去查一下质粒的信息，我认为质粒上的转座酶应该是诱导型的。
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携带转座子的质粒，如果一直保持常态表达转座酶，那么它的宿主菌基本上就被搞得不像样子了。宿主菌在培养过程中受得了几个插入？建议你去查一下质粒的信息，我认为质粒上的转座酶应该是诱导型的。 斑竹，我的质粒是自杀的，在要构建突变体文库的这个大肠杆菌菌株中无法复制。
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zt滔滔江水
斑竹，我的质粒是自杀的，在要构建突变体文库的这个大肠杆菌菌株中无法复制。 你没有充分理解我的意思。你的质粒在λπ的菌中才能生长，也就是供体菌，比如sm10, s17-1等。如果质粒的转座酶是持续表达型，你是无法成功接活这些供体菌。这就像做一个可以腐蚀所有材料的液体一样，不可能成功，因为没有东西能够装这个液体。你可能没有充分了解你的质粒的遗传背景，建议查清楚质粒的全序列，或者结构图，了解每一部分的功能，然后再动手。我以前做过tn10，是IPTG诱导型的
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你没有充分理解我的意思。你的质粒在λπ的菌中才能生长，也就是供体菌，比如sm10, s17-1等。如果质粒的转座酶是持续表达型，你是无法成功接活这些供体菌。这就像做一个可以腐蚀所有材料的液体一样，不可能成功，因为没有东西能够装这个液体。你可能没有充分了解你的质粒的遗传背景，建议查清楚质粒的全序列，或者结构图，了解每一部分的功能，然后再动手。我以前做过tn10，是IPTG诱导型的 醍醐灌顶！受教受教！确实如斑竹所言。我再去查查资料。转座子是别人给的，没怎么问清楚。。。
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你没有充分理解我的意思。你的质粒在λπ的菌中才能生长，也就是供体菌，比如sm10, s17-1等。如果质粒的转座酶是持续表达型，你是无法成功接活这些供体菌。这就像做一个可以腐蚀所有材料的液体一样，不可能成功，因为没有东西能够装这个液体。你可能没有充分了解你的质粒的遗传背景，建议查清楚质粒的全序列，或者结构图，了解每一部分的功能，然后再动手。我以前做过tn10，是IPTG诱导型的 一天都在查相关资料，说明书也看了好几遍了，都没有提到诱导。我还看了一些国内的中文文献和硕士博士论文，英文也看了两篇，都是一般的接合转移的操作。。。就是接合时间有点长。（而我担心，如果转座无需诱导的话，接合子就可以是转座子，接合时间过长，早期的接合子都复制了，突变体库重复度不就高了）附上说明书（扫描的，纸张两侧有浅色页码），里面有protocols，就是一般的接合操作。。。疑惑中。。。
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一天都在查相关资料，说明书也看了好几遍了，都没有提到诱导。我还看了一些国内的中文文献和硕士博士论文，英文也看了两篇，都是一般的接合转移的操作。。。就是接合时间有点长。（而我担心，如果转座无需诱导的话，接合子就可以是转座子，接合时间过长，早期的接合子都复制了，突变体库重复度不就高了）附上说明书（扫描的，纸张两侧有浅色页码），里面有protocols，就是一般的接合操作。。。疑惑中。。。 刚才查了一下，好像跟我做的还不一样......我用的mini tn10回头找一下protocol
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zt滔滔江水
一天都在查相关资料，说明书也看了好几遍了，都没有提到诱导。我还看了一些国内的中文文献和硕士博士论文，英文也看了两篇，都是一般的接合转移的操作。。。就是接合时间有点长。（而我担心，如果转座无需诱导的话，接合子就可以是转座子，接合时间过长，早期的接合子都复制了，突变体库重复度不就高了）附上说明书（扫描的，纸张两侧有浅色页码），里面有protocols，就是一般的接合操作。。。疑惑中。。。这是我用的转座子，plac启动子，IPTG诱导型的如果不诱导，就可以表达.......那宿主菌怎么可能受得了呢？我也不能理解了.......
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各位大侠，小弟有一事请求：如果供体菌和受体菌都是大肠杆菌，（其中供体菌耐金霉素，受体菌不耐）接合后，将菌液涂布在含有金霉素的LB培养基上面，在此平板上面长出的细菌如何确定就是接合子而不是供体菌？谢谢！
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摇摇椅葡萄架 各位大侠，小弟有一事请求：如果供体菌和受体菌都是大肠杆菌，（其中供体菌耐金霉素，受体菌不耐）接合后，将菌液涂布在含有金霉素的LB培养基上面，在此平板上面长出的细菌如何确定就是接合子而不是供体菌？谢谢！ 尽量找一个受体耐受而供体不耐受的抗生素作为筛选标记
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各位老师好，J53等这些受体菌的资料哪儿找啊？
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请问下你怎么鉴别结合子的，用EC600做受体菌时，pcr么？
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are16．membered
milbemycins
macrolideantibioticswith
variouskindsofmites．5-oxime
outstandingactivityagainst
derivativesof
milbemycins
effectiveanthelmintics．TheC5
duetoitsketo．chemical
properties
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