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openresty/1.9.7.4扬麦158×淮麦18组合早代PPO活性变异及其遗传分析_甜梦文库
扬麦158×淮麦18组合早代PPO活性变异及其遗传分析
Ｙ ９５０６６８分类号 密级 单位代码于 可 ０３６４ Ｓ０３０９０１０２００４名微雇业大学学位论文扬麦１５８×淮麦１８组合早代ＰＰＯ活性变异及其遗传分析Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｊｓ＆ｔｈｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＰＰＯ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｙａｎｇｍａｉ １５８×Ｈｕａｉｍａｉ １８’ｓ Ｅａｒｌｙ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ研究 导 教生：蓥俊指师：呈佳矗煎握农学硕士申请学位门类级别：专 研 业名 方 学称： 向： 院：佐物遣焦直弛 佳塑星厦堕良究 在所盘堂瞳答辩委员会主席：２００６年６月摘要以多ｍ（Ｌ．ＤＯＰＡ／ＭＯＰＳ）为底物，用３种不同的方法分别测定了来源不同的２０个 小麦样品的ＰＰＯ活性，通过比较３种不同的测定方法，而选出一种快速、高效、稳 定检测ＰＰＯ活性的方法。并用选定的方法测定了小麦组合（扬麦１５８×淮麦１８）早代（Ｆ２ 群体和Ｆ２：３家系群体）的ＰＰＯ活性。最后用单个分离世代群体遗传模型分析方法对该 组合的Ｆ２群体、Ｆ２：３家系群体ＰＰＯ活性进行遗传分析，结果表明： １．全麦粉过滤法（方法３）和全麦粉离心法（方法２）Ｎ定的ＰＰＯ活性比全籽粒浸提法 （方法１）高。３种方法测定的２０个来源不同的小麦样品ＰＰＯ活性差异均达到极显著水 平，但全麦粉过滤法（方法３）－－个重复问的变异系数最小，只有２．７４％。全麦粉过滤 法和全麦粉离心法测定的ＰＰＯ活性相关系数最高，达０．９５３。此外，全麦粉过滤法所 需的反应时间较短，所需的样品量和试剂量均较少。综合来看，全麦粉过滤法是一种 高效、经济、快速、稳定测定ＰＰＯ活性的好方法。 ２．用全麦粉过滤法分析小麦组合（扬麦１５８×淮麦１８）早代（Ｆ２单株和Ｆ２：３家系群体） 的ＰＰＯ活性，结果表明，Ｆ２单株群体和Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性分布均呈明显的偏 态分布，且Ｆ２单株和Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性极显著相关，相关系数为Ｏ．７２７，显示 了较高的遗传效应。因此，在品质遗传改良中，对ＰＰＯ活性实施旱代选择能够取得 明显的效果。 ３．用单个分离世代群体遗传模型分析方法对杂交组合扬麦１５８×淮麦１８的Ｆ２群 体、Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性进行遗传分析，结果表明，该组合的ＰＰＯ活性主要受 两对主基因控制，且主基因表现为加性．显性效应。Ｆ２群体控制ＰＰＯ活性的主基因遗 传率为７３．９２％，Ｆ２ ３家系群体中两对主基因遗传率为８８．４４％。关键词：小麦；检测方法；ＰＰＯ活性；遗传分析ＡｂｓｔｒａｃｔＴａｋｉｎｇ ＤＯＰＡ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ（ＰＰＯ）ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆ ２０ ｗｈｅａｔ ｓａｍｐｌｅｓａｒｅａｓｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａ ｒａｐｉｄ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｓｔａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｔｏ １ ５８ Ｘｍｅａｓｕｒｅ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ（ｐｐｏ）ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＹａｎｇｍａｉＨｕａｉｍａｉ １ ８（Ｆ２ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ Ｆ２：３ ｆａｍｉｌｙ ｇｒｏｕｐｓ）．Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓｏｎｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＹａｎｇｍａｉ １５８×Ｈｕａｉｍａｉ １８（Ｆ２ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ Ｆ２：３ｆａｍｉｌｙｇｒｏｕｐｓ）ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄａｓｆｕｌｌｏｗｓ：１，Ｔｈｅ ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆｗｈｏｌｅ－ｍｅａｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｏｆｗｈｏｌｅ－ｍｅａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ ａｒｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅｓｅｅｄｓ ｓｏａｋｉｎｇ．Ｔｈｅｏｎｅｓｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆｖａｒｉａｎｃｅｏｆ ｔｈｅ ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ２０ ｗｈｅａｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｒｅａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ，ｂｕｔ ｔｈｅ ＣＶ ｏｆ ｔｈｅ ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｗｈｏｌｅ―ｍｅａｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｗａｓ ｔｈｅ ｌｅａｓｔ，ｏｎｌｙ ２．７４．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆｗｈｏｌｅ－ｍｅａｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｗｈｏｌｅ―ｍｅａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ ｗａｓＡｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｓｈｏｒｔ，ｔｈｅ ｑｕａｎｔｕｍａｓｈｉｇｈａｓＯ．９５３．ｒｅｑｕｉｒｅｄｏｆｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｏｆ ｗｈｏｌｅ―ｍｅａｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｗａｓ ｂｏｔｈ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｔｔｌｅ．Ｉｎｓａｍｐｌｅｏｆａｎｄ ｒｅａｇｅｎｔｗｅｒｅｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｗｈｏｌｅ．ｍｅａｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌｓＣａｎｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｈｅａｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｒａｐｉｄｌｙ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｔａｂｌｙａｎｄｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ． ２．ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＹａｎｇｍａｉ１ ５８ Ｘ Ｈｕａｉｍａｉ １ ８（Ｆ２ ａｎｄ Ｆ２３ｆａｍｉｌｙｇｒｏｕｐｓ １ ｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆｗｈｏｌｅ―ｍｅａｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ：ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｆ２ ｇｒｏｕｐｓａｎｄＦ２：３ ｆａｍｉｌｙ ｇｒｏｕｐｓ ｂｏｔｈ ｓｈｏｗｅｄ ｓｋｅｗｅｄ ｃｕｒｖｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｆ２ ｇｒｏｕｐｓａｎｄＦ２．３ｆａｍｉｌｙｇｒｏｕｐｓ Ｗａｓ ０．７２７ａｔ１％ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ，ｓｈｏｗｉｎｇａｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｇｅｎｅｔｉｃｅｆｆｅｃｔ．Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃａｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｑｕａｌｉｔｙ，ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｈａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ．３．Ｔｈｅ ×Ｈｕａｉｍａｉ １ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓｏｎＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｙａｎｇｍａｉ １ ５８８（Ｆ２ ｇｒｏｕｐｓａｎｄ Ｆ２，３ ｆａｍｉｌｙ ｇｒｏｕｐｓ）ｗａｓｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ，Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｔｗｏ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｅｓｈａｄ ａｄｄｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｔｈｅｍａｊｏｒｇｅｎｅ ｉｎｈｅｒｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ７３．９２％ｉｎ ｔｈｅ Ｆ２ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ８８．４４％ｉｎ Ｆ２：３Ｋｅｙｆａｍｉｌｙ ｇｒｏｕｐｓ．ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓｗｏｒｄｓ：Ｗｈｅａｔ；Ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄｓ；ＰＰＯ独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签字日期：莎解，月朋学位论文版权使用授权书学位论文作者签名：熏垒盛：本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文（保密的学位论文在解密后适 用本授权书）。学位论文作者签名：受丕５量签字日期：ｃＩ．，彳年６月ｐ日指导教师签名：，呈鲤 签字日期：％年ｇ月脚盯电话： 邮编：学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通信地址：弓口小麦是世界Ｉ二最早栽培植物之一，它对人类的文明和文化的发展起了重要的作 用；目前，小麦已成为世界上分布范围最广，种植面积最大，总产量最多，营养价值 最高的粮食作物之一，小麦含有丰富的各种微量元素和蛋白质，养活了约占全世界 １／３的人口，我国与许多发达国家一样，在小麦生产上都经历了由重视产量到产量、 品质并重，进而发展到重视品质的过程［１“。２０世纪８０年代中期以前，我国小麦育 种偏重于提高产量、抗病和早熟等，并取得了很大的成就［２，５１。但是，在解决温饱问 题之后，为了适应国民经济发展和人民生活水平的提高的需要，大力发展优质小麦生 产和育种是符合我国国情的，可以减少部分优质小麦或专用粉的进口，具有重要的经 济意义，而对于小麦品质的改良，是在８０年代后期才开始得到重视的郾】。 小麦品质是由许多因素构成的综合而相当复杂的概念，由于人们对小麦面粉使用 的目的不同，对品质的要求也就不同，通常所说的小麦品质，主要包括营养品质和加 工品质，加工品质又包括磨粉品质（第一次加工品质）和食品加工品质（第二次加工品 质）”】。小麦营养品质是指小麦籽粒中含有的为人体所需要的各种营养成分，它不仅包 括其营养成分含量多少，而且包括各营养成分是否全面和平衡，对于消费者来说，不 仅要求较高的营养价值，同时还要求色、香、味俱全【１，５】。随着人民生活水平的不断 提高，磨粉品质和食品工业以及消费者心理都对小麦品质提出了新的要求。磨粉工业 要求面粉色泽洁白、灰分少、出粉率高、耗能少等；食品工业则根据不同食品种类而 要求不同的面粉品质【５】。 小麦面粉及面粉基食品的色泽，是小麦磨粉品质及其面粉基食品品质的主要评价 指标，特别是馒头、饺子、面条等食品对面粉白度的要求相当高悔趴。我国小麦面粉等级标准对白度有了明确要求：１级大于７６％，２级大于７５％，三级大于７２％㈣】。面条、馒头、饺子等面食品是我国人民的主食。根据Ｈｏｕ等对相关的研究所作的综述 表明，面条，馒头类食品对色泽的要求相当严格，色泽评分占总评分的９％一４５％Ｌｍ］。 白色光亮的面食品深受消费者的喜爱，面粉厂为了迎合消费者“求白的喜好”，大量 使用增白剂（主要是苯甲酰，ＢＰＯ），严重影响人体健康，人民日报２００１年２月１３日 报道，我国６０％的面粉增白剂严重超标；２００３年３月份的全国质量检测结果指出， 我国５０％的面粉增白剂严重超标，超标幅度达３－４倍［１…。长期食用这些含有此增白剂 的食品会增加肝脏的负担，导致‘陧性中毒，同时还会破坏维生素Ａ、Ｅ等，从而降低其营养价值【６’““”。由于人们对ＢＰＯ的危害性的认识已经逐步加深，因此，很多国家已经明令禁止向面粉中添加增白剂，我国也作出了相关规定［８】。因此，从遗传途径来 改良面粉自度显得十分必要。小麦籽粒ＰＰＯ活性与面粉的白度及其面粉基制品的外观品质密切相关，ＰＰＯ活 性高的品种其面粉及制品在加工、储藏过程中易褐变，在面条和饺子蒸煮前的几个甚 至几十个小时的贮存期间或挂面干燥过程中，颜色褐变现象十分普遍【２¨。主要是由于 ＰＰＯ催化酚类物质发生氧化还原反应产生醌类物质所致，颜色在面粉及面条加工与储 藏过程中的形成通常有四条途径：（１）存在于小麦籽粒中的天然色素，（２）面粉中无色 前体物质通过酶促褐变形成有色物质，（３）通过非酶促褐变（包括美拉德反应、焦糖化反应以及碱降解反应）形成有色物质，（４）由加工设备或工艺过程引起的颜色。这种褐变严重影响小麦面粉及其制品的品质，倍受面粉和育种家的关注１２ＵＪ。面粉白度受许多 复杂的遗传和非遗传的因素所控制，遗传因素方面研究最多的也是最为重要的一个因 素就是多酚氧化酶（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ＰＰＯ）１１４，１５］。虽然影响面条（团）颜色及稳定性的 因素很多，但ＰＰＯ活性及其相应的底物是引起其褐变的主要原因，它可解释面条（团） 颜色变异的５０．７０％ｔ２２∞１。单籽粒多酚氧化酶活性与面团颜色褐变程度的相关系数高 达０．７．Ｏ．８［１７２３．２４］。选择低多酚氧化酶活性的籽粒不仅可以降低面条（团）颜色变暗的 程度而且可以明显提高面粉中黄色素含量的稳定性【２…。因此，了解小麦多酚氧化酶 （ＰＰＯ）的研究现状以为进一步研究多酚氧化酶（ＰＰＯ）活性的遗传及其与面条（团）色泽 的关系从而对改良面条（团）的色泽具有重要意义。文献综述ｌ多酚氧化酶的种类多酚氧化酶（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，简称ＰＰＯ）是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。最早发 现于１８９５年，多酚氧化酶是自然界分布极广的一种酶，广泛的存在于自然界，动植 物，微生物体内均有ｐｐｏｔ２５，２６］。１９３７年，Ｋｕｂｏｗｉｔｚ在Ｗａｒｂｕｒｇ实验室中第１次分离 出多酚氧化酶。此后，对多酚氧化酶的研究不断地深入，植物多酚氧化酶（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ＰＰＯ，ＥＣｌ．１４．１８．１）是一类多基因家族表达产物。多酚氧化酶是一种含Ｃｕ２＋的 膜结合蛋白，具有底物专一性，主要与植物色素的生成及其产品的色变有关，它催化天 然底物酚类化合物，使其发生氧化而形成棕褐色的醌类物质和水，醌又再经非酶促反 应聚合，形成深色物质（羟醌和黑色素等）［２”。褐变不仅影响产品的外观、风味、营养 和加工性能，而且还大大降低耐贮性。 多酚氧化酶大体上可分为２类：漆酶和儿茶酚氧化酶，习惯上常把儿茶酚氧化酶 称为儿茶酚酶、酪氨酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶或甲酚酶，它与漆酶有明显区别。 儿茶酚酶不是严格存在于植物体的特定部位，它普遍存在于植物器官和组织；漆酶的 催化底物范围很广，可以催化单酚、三酚、邻和对位二酚以及氨基酸［２８，２９］。酚酶作用 的底物有儿茶酚，花色素，绿原酸，咖啡酸，黄酮醇等，对ＰＰＯ进行活性分析，可 采用多种底物：邻苯二酚，邻苯三酚，酪氨酸，绿原酸、多巴及多巴氨［３０－３２］。酶学界 根据ＰＰＯ催化的底物不同和底物中酚羟基的位置和数目将多酚氧化酶分为三大类： 单酚氧化酶［酪氨酸酶（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ，ＥＣ １．１４＋１８．１）］、双酚氧化酶［儿茶酚氧化酶（ｃａｔｅｃｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ＥＣｌ．１０．３．２）或邻苯二酚氧化酶（ｏ．ｄｉｐｈｅｎｏｌ ｏｘａｄｉｓｅ），对苯二酚氧化酶 ＠．ｄｉｐｈｅｎｏｌｏｘａｄｉｓｅＯｆｌａｃｃａｓｅ，Ｅｃ１．１０．３．１）１、、漆酶（１ａｃｃａｓｅ，ＥＣｌ．１０．３．１）∽２５，３３ｑ ５１。动物中以酪氨酸酶为主；植物中主要含有邻苯二酚酶和酪氨酸酶；而对苯二酚酶主要存在于真 菌和部分植物中［１６ｔ１８，”】。２多酚氧化酶的分布和定位ＰＰＯ是核基因编码的铜金属酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。２０世纪６０年代以来，曾从不同的植物中分离出ＰＰＯ，如梨、苹果、马铃薯、桃、葡萄、茶叶、荔枝、烟草、百合、小麦、玫瑰、甘蔗等口“５０】。其中茶叶、葡萄、荔枝以及番茄等 蔬菜ＰＰＯ含量较为丰富，而小麦等谷物作物中ＰＰＯ不是太丰富。ＰＰＯ相当稳定，甚至 在土壤中已腐烂的植物残渣上都可检测到ＰＰＯ的活性。ＰＰＯ是一类质体酶，主要存在 于叶绿体，黄色体，白色体等内膜上，与分布于细胞质中的酚类底物在正常情况下是 隔离的，只有当膜破裂，酶释放出来，酶才会催化酚氧化，导致褐变【５卜５ ３１。在植物体内，多酚氧化酶的底物存在于液泡中，通常处于潜伏状态，只有当组织损伤引起亚细胞区域化改变时才被激活，引起褐变。在没有质体的组织，如植物筛管等，不含ＰＰＯ［２５，２６］ｏ研究表明，有活性的ＰＰＯ定位于正常细胞的质体中。叶绿体的ＰＰＯ存在于类囊体上，其它类型质体的ＰＰＯ存在于各种囊泡上。定位于类囊体的ＰＰＯ究竟是结合于类 囊体膜上，还是溶解在膜腔中，目前尚无定论。虽然几乎所有的质体中都包含ＰＰＯ， 但在某些组织中很难检测到ＰＰＯ活性：例如Ｃ４植物的维管束鞘细胞和保卫细胞的质体 ［５４］ｏ因此，多酚氧化酶存在于含有质体的植物组织，而含有质体的植物组织不一定都 存在多酚氧化酶。 就其组织定位来讲，多酚氧化酶广泛存在于植物的各器官和组织，如花器官、分 生组织、叶片、块茎、根中，ＰＰＯ在植物组织和器官中的分布具有时空特异性，幼嫩 部位的ＰＰＯ活性显著高于成熟或衰老部位１５５】；另外，环境胁迫以及化学物也能诱导 ＰＰＯ的表达，植株组织受到机械损伤或病虫害的侵染，该部位的ＰＰＯ活性也将上升 １１４，５６，５７］。对小麦来说，从植株幼苗到成熟籽粒都含有ＰＰＯ，但是其活性和种类有所差 异。小麦籽粒在发芽初期，ＰＰＯ活性可上升５０－－１００倍，籽粒的ＰＰＯ活性随着成熟而逐渐下降【１ｔ５８】。ＰＰＯ在小麦植株中的分布不均一，也存在一定的规律性，从上至下，ＰＰＯ同工酶数目和活性逐渐减少或降低。ＰＰＯ同工酶种类以未成熟的籽粒最为丰富，共有 ９条谱带【３甜。小麦受精后不久就可以检测到ＰＰＯ活性，随后逐渐升高，直至受精后４１ 天ＰＰＯ活性达到最大，以后随着成熟ＰＰＯ活性不断降低［１”。籽粒中的ＰＰＯ主要存在于 麸皮中，面粉中［拘ＰＰＯ活性随着出粉率的增加而上升［５ ９１。 多酚氧化酶是由核基因编码，在细胞质中合成，通过一定方式转运至质体内而成 为具酶活性的形式，其在植物体内与类囊体膜结合在一起唧－６２１。对多酚氧化酶的细 胞定位研究（包括分级分离研究、细胞化学研究和免疫细胞化学研究等）表明多酚氧化酶是严格的质体酶，有活性的多酚氧化酶广泛分布于完整细胞的质体【６１，６¨”。如马铃薯块茎淀粉体、顶端分生组织细胞质体、胚轴细胞质体、根细胞质体、表皮细胞质 体、胡萝ｈ培养组织质体、有色体、白色体以及许多种植物的叶绿体。马铃薯叶片中 ＰＰＯｍＲＮＡ含量不同，只在幼嫩叶片中能检测到，免疫检测发现，从顶芽到第１１个叶芽中的ＰＰＯ分布是恒定的蛳Ｊ。葡萄幼嫩的正在生长的浆果、叶片、根中有高水平的ＰＰＯ基因表达，而在成熟组织中却较少［６７】。细胞碎片梯度离心的分级分离结果表明，富含 叶绿素或其它质体色素的部位也富含多酚氧化酶【６＆”ｊ，Ｈｅｍ＇ｙ等Ａ１６８］在将部分分离与 植物多酚氧化酶细胞化学结合起来的研究中还发现，在细胞化学上可以检测到多酚氧 化酶活性的唯一结构是质体碎片。Ｌｉｅｂｅｒｅｉ等人还进～步破碎质体并分离了富含叶绿 素ａ的类囊体颗粒，这些颗粒上包含了多酚氧化酶，它们与光合系统无关［６２】。Ｐａｒｓｈ等人［７０】将研究酪氨酸酶在动物组织中定位的细胞化学技术应用于植物组织多酚氧化酶的定位研究，固定的组织切片在一个含ＤＬ一二羟苯丙氨酸（ＤＯＰＡ）反应混合物的磷酸缓冲液或二甲胂酸缓冲液中进行孵育，多酚氧化酶作用于ＤＯＰＡ而产生的被氧化的 ＤＯＰＡ（ＤＯＰＡ醌）是一种极度嗜锇分子，因此，组织在含ＤＯＰＡ反应缓冲液中孵育后用锇酸固定，很易探测ＤＯ队醌的位置，植物多酚氧化酶的这些细胞化学研究为多酚氧化酶属于质体酶的论点提供了强有力的证据。马铃薯、玉米和杂交杨伊ｏｐｕｌｕｓ×Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）等植物在细胞质中合成ＰＰＯ前体，由Ｎ一端第一段导肽导入叶绿体质体基质，然后基质中的金属型内肽酶ＳＳＰ切除导肽；如果有光，则由Ｎ．端第二段导 肽导入类囊体成为成熟的具有潜在酶活性的酶蛋白。其中间体与成熟蛋白在质体内的 比率受植物种类、叶龄、生长条件、光照条件以及质体的发育阶段等多种因素的影 ［７１，７２］。ＰＰＯ位于类囊体的膜上还是腔中，目前尚无定论。有些ＰＰＯ至少阶段性地与类 囊体膜外缘非紧密性结合，因此通过超声波、温和型去垢剂和酶解等方法能纯化ＰＰＯ。 番茄ＰＰＯ基因家族中，ＰＰＯＡ、ＰＰＯＡ’和ＰＰＯＣ编码产物的Ｃ．端有２个疏水ｎ．螺旋（６０ａａ）， 可能是膜结合区，但ＰＰＯＥ基因产物却能溶于并积累在类囊体基质中，其氨基酸序列 中也无膜结合区［７３】。Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ等（７４】发现甜菜（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓｌ．）根中的ＰＰＯ主要是与类囊 体膜相结合，类囊体腔中也存在非活性状态的ＰＰＯ，但这也可能是分级分离造成的假 象。过去曾有人报道认为，多酚氧化酶也存在于质体以外的细胞器，这很可能是一种假 像，首先，实验中没有采取排除酚类的过氧化物氧化作用的措施，而且是用衰老组织 进行的研究，这就有可能是多酚氧化酶已经脱离了其原处的位置；其次，用叶绿素作 为唯一的质体标记，而白色体和表皮细胞的质体中虽然含有多酚氧化酶，但它们却并 不含叶绿素，可能被误认为是其它细胞器，从而导致多酚氧化酶的错误定位。多酚氧 化酶的细胞化学研究结果表明：多酚氧化酶反应产物要么出现在叶绿体的类囊体，要 么出现在其它质体类型的膜结构，到目前为止，还没有研究表明多酚氧化酶反应产物 出现在质体以外的细胞器上。对细胞质体进行一定的修饰，即使不影响其它细胞器， 也能导致多酚氧化酶活性的彻底丧失口＾”】。Ｔｅｎｔｏｘｉｎ是一种专一影响质体从而导致黄 化病的环状四肽毒素，生长在含Ｔｅｎｔｏｘｉｎ溶液中的敏感植株，所有质体均缺乏多酚氧 化酶［７ｓ，７６］。可以想像，如果有活性的多酚氧化酶出现在质体以外的细胞的任何部位， 那些只有质体受影响的组织细胞的多酚氧化酶活性彻底丧失的情况就不会发生，这种 化学因素影响质体而导致多酚氧化酶活性彻底丧失的现象进一步说明植物中的多酚氧化酶是一种严格的质体酣６０］。 ３多酚氧化酶生理生化功能的研究植物多酚氧化酶是由核编码在细胞质中合成的，这一点已从众多研究中得到证实 怕Ｌ“’”，”】有关多酚氧化酶的生理功能的研究却未能获得令人满意的结果，可以说，植 物多酚氧化酶的生理功能仍然还不清楚。由于位于质体的类囊体膜上，作为氧化还 原酶，被认为与呼吸链末端的电子传递有关，能消除氧自由基的伤害。ＰＰＯ参与植物色素的生成；此外，ＰＰＯ还与植物抗逆、生长发育有关，可能促进己烯的代谢［６ｌ＇７７，７８］。 随着研究的深入，人们还逐步发现了多酚氧化酶的其它生理功能。如在光合作用中， 多酚氧化酶可能在叶绿体内起着能量转换作用，传递光还原产生的分子氧【７７】；与植物 的抗病虫等方面相关【７ ９，”Ｊ，但缺乏直接的证据；可能在植物的生长发育过程ｆ如根的 形成）中起某些作用，以及与乙烯的产生有关系【８ｌ】等等。目前，人们对多酚氧化酶在 植物体内的功能仍了解不多，还有待进一步的研究。 多酚氧化酶在有氧的条件下催化酚形成醌，从而引起褐变。但是，植物体内大多 数多酚氧化酶的活性都是潜在的。这是因为正常组织内细胞中的酚类物质和多酚氧化 酶呈区域性分布。鞠志国［８２，８３１等用酶法分离分别测定了莱阳梨原生质体和液泡中的酚 类物质含量以及多酚氧化酶的活性，发现液泡是贮存酚类物质的场所且其中不含多酚 氧化酶，这为Ｍａｙｅｒ和Ｈａｒｅｌｌ【２即关于酚类和多酚氧化酶区域性分布的论点提供了证据。 因此，它在酚类物质代谢中的作用主要体现在含有质体和液泡混合液的环境中，具体 来说就是衰老和受伤的情况。多酚氧化酶在解释由于受伤而出现醌类物质的快速产 生，从而进一步引起褐变死亡具有很明显的生理意义。据报道，具高水平的酚类物质 的组织细胞常含多酚氧化酶，而具低水平的酚类物质的组织细胞却不含多酚氧化酶， 而且多酚氧化酶能在体外将单酚转化成双酚，因而有人曾设想多酚氧化酶参与植物体 内酚类物质的合成尽管有些研究者发现了细胞或组织酚类化台物含量与能从其中分 离的多酚氧化酶活性之间的关系，但是体内大多数多酚氧化酶活性是潜在的，要确定 其在体内的实际活性几乎不可能。使用细胞化学和体外酶学方法，Ｖａｕｇｈｎ等人发现 多酚氧化酶活性的彻底丧失对大豆幼苗的酚类物质代谢没有影响。用Ｔｅｎｔｏｘｉｎ处理组 织导致多酚氧化酶的完全失去并不影响酚类物质在这些组织中的积累。过氧化物酶或 其它酶的作用就足以满足产生那些组织中的酚类物质水平【６１，６２，７５，８４，８５］。多酚氧化酶作 为一种酚氧化酶在叶绿体中是不活泼的，它仅仅是一种潜在或者缺乏底物的酚氧化 酶。这种酶的潜在形式可被各种各样的处理所激活，包括去污剂、脂肪酸和胰蛋白酶 ｍ】。光也能激活潜在的多酚氧化酶，因为在缺乏其它激活因子的情况下，多酚可被叶 绿体膜上的光化学作用所氧化，这种依赖于光的氧化作用是由于酚类化合物替代水作为ＮＡＤＰ．光还原的电子供体【８６１。但也有研究表明，单酚依赖于光的氧化作用是由于光合成的氧化，而不是多酚氧化酶的作用【６２，”ｊ。在衰老方面，常用多酚氧化酶来解释 暗褐色、黑色等褐变。因为揭变是由已存在的底物与酶的接触引起，所以在能分离的 多酚氧化酶活性与衰老之间有时不相关联。在衰老过程中能分离的多酚氧化酶括性的 增加是由于原已合成的酶的激活所致。可见，多酚氧化酶在此过程中的生理意义不大。 然而，由于受伤而出现醌类物质的快速产生却具有明显的生理意义，无论是机械损伤 还是病虫害引起的细胞破裂，通过多酚氧化酶与酚类物质相互作用而产生的醌类物质性质很活泼，质体的破坏导致多酚氧化酶的激活与从液泡中释放出来的酚类物质起反 应（酶和底物的区域分布界限被打破），产生醌类物质，参与保护植物免受进一步伤害。 多酚氧化酶是一种相对较稳定的酶，尽管其反应产物对酶有一定的抑制作用，多酚氧 化酶的活性仍可维持较长时间，导致醌类物质的不断产生。在研究光合作用的过程中，Ｖａｕｇｈｎ等ｍ蟪出多酚氧化酶中的铜离子可在不同价态间氧化还原传递电子，对于光合和呼吸作用的电子传递有…定的协同作用。多酚氧 化酶可能通过植物光合系统参与介导了分子氧的光还原过程，其理由有５条：①在植 物健康组织内，还没有证据说明这种蛋白质作为多酚氧化酶在羟基化的酚或醌的产生 中起作用；②多酚氧化酶只存在于那些产生高水平氧的叶绿体，它很可能需要默勒反 应的调节；③醌类物质能介入默勒反应；④ＫｃＮ（一种多酚氧化酶的强抑制剂）可大大 提高光合作用中氧的释放，而且，在分离的菠菜叶绿体中发现其氧的释放与潜在的多酚氧化酶活性的诱导有极大关系；⑤已发现多酚氧化酶与具有高比率叶绿素ａ／ｂ的叶绿体片段相关，虽然这些片段并没有高的光合系统Ｉ活性。但要确认其参与了分子 氧光还原过程中的默勒反应尚需进一步深入研究。所以ＰＰＯ可能作为一种金属氧化还 原酶，调节胞质中的氧化还原水平，与氧结合并传递分子氧，以调节叶绿体中有害的 光氧化反应速度，参与其中电子传递，起能量转换作用。 路兴波等【８８１在小麦抗感纹枯病品种酶活性比较研究中指出，多酚氧化酶参与了木 质素前体的聚合作用，与植物抗病性密切相关。病原菌侵染能诱导植物体内多酚氧化 酶活性升高，促进酚类化合物的大量积累并形成醌，醌的次生反应所产生黑色素的痂 可阻止感染的扩散；而酚类化合物是细胞形成木质素的前提，可促进细胞壁和组织的 木质化，以抵抗病原菌侵染；还有实验证明０．醌类物质具有抑制细菌繁殖的作用【２ ８１。 目前有许多实验表明ＰＰＯ活性与植物抗病有关。（１）真菌感染后的植株ＰＰＯ活性明显增 加，且从感染部位到未感染区域的边缘，ＰＰＯ活性有一个明显的梯度【８堋；（２）抗性品系 的总酚量和ＰＰＯ活性都相对敏感品系要高，感染后抗性品系的ＰＰＯ活性增高的速率要 比敏感性品系快；（３）食草昆虫肠胃内的消化酶能激活ＰＰＯ【９０】；（４）转入反义ＰＰＯ基因或 亲缘关系较近的植物的ＰＰＯ基因时，转基因植物中的ＰＰＯ的含量下降４０％，且不能被 诱导，从而使植株产生ＨＲ（ｈｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）［９１１；转入强启动子上调ＰＰＯ表达的植 株，有更强的抗病虫害的能力。 此外，ＰＰＯ还具有其他生理功能。多酚氧化酶能进行去甲基化反应，这对于木质 素降解是相当重要的。在层孔属的真菌中，ＰＰＯ不仅能够降解木质，而且能够聚合木 质的氧化产物［５４１，在马齿苋属植物和红色甜菜植物中，酪氨酸酶参与Ｂ．花青素的生 物合成；ＰＰＯＪ丕与植物的生长发育过程（如根的形成）以及乙烯的形成有一定联系［６０】； ＰＰＯ还可促进伤口的愈合一“。４多酚氧化酶的遗传及分子生物学研究４．１ＰＰＯ分子特征及分子量 ＰＰＯ通常先以无活性的前体形式存在。前体一般由Ｎ一端导肽（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）、中间高度保守的Ｃｕ结合区和Ｃ一端疏水区３部分组成。导肽的作用是将成熟的蛋白质输送 到类囊体腔，也称为转运肽，包括８０一９０个氨基酸，其Ｎ一端有大量的亲水氨基酸残基， Ｃ端氨基酸残基中大约５０％为疏水残基。ＰＰＯ的Ｃｕ结合区是该酶的主要功能区，电是 ＰＰＯ的活性中心。其他部分则对酶的构象、高级结构的形成和维持起作用。从发表的 十几种植物多酚氧化酶基因的氨基酸序列来看，多酚氧化酶在氨基酸水平上，至少具 有２个富含组氨酸的铜结合区（ＣｕＡ和ＣｕＢ），Ｈｕｎｔ等【６６】认为还存在第三个富含组氨酸的 铜结合区ＣｕＣ。除此之外，许多植物，如桃、草莓、菠菜、马铃薯、苹果等ＰＰＯ分子 中含有糖成分，不过不同植物的ＰＰＯ的含糖量有所不同。简单来说，ＰＰＯ的分予结构 可用图１来表示，多酚氧化酶活性形式常被报道是大约４５ｋＤ的分子［７７】，但其它大小形 式如５９ｋＤ和６５～６８ｋＤ也有报道【７３】。不同种植物、同一植物体的不同部位及同一部位 的ＰＰＯ多基因家族的不同成员的分子量不同。ＰＰＯ前体约６０～７ｌｋＤ，成熟ＰＰＯ约４０～ ６８ｋＤ。ＰＰＯ通常是一种由４个亚基组成的寡聚蛋白质，如薯蓣皂小球茎ｐｐｏ年Ｎ莴苣的 ＰＰＯ；但大白菜、香草中ＰＰＯ．贝ＩＪ是由３个亚基聚合形成；蘑菇的儿茶酚氧化酶则是一 种多聚酶，分重链（４３ｋＤ）和轻链（１３．４ｋＤｌ；甜菜根和香蕉果肉中的ＰＰＯ却是单体酶， 多酚氧化酶所处位置的明显可变性以及大小的不均一性可能起因于它的转运方式及 各种基因产物的可能修饰的不同。虽然某些多酚氧化酶的多重性具有同一个遗传基 础，但它们也受额外因子的影响。多酚氧化酶反应产物的次级反应可产生变性的、修 饰的和交联的酶蛋白，这可能有利于蛋白分解作用，因此，报道的多酚氧化酶明显的 大小和位置的不同很可能是由于酚类底物氧化产物的反应或酶蛋白本身的分解所致。４．２ＰＰＯ是多基因家族 ＰＰＯ由多个基因编码，表现出多基因家族性，少则２或３个，多则６或７个基因。但有的植物，如葡萄只有１个ＰＰＯ基因。现在发现ＰＰＯ活性不同的小麦品种中的ＰＰＯ基因 数目也不相同，但其活性与基因数目之间的关系还有待研究［９３１。从马铃薯的块茎和叶 中至少可分离出６个ＰＰＯ等位基因：ＰＯＴ３２、ＰＯＴ３３、ＰＯＴ４１、ＰＯＴ７２、Ｐ１、Ｐ２和ＮＯＲ３３３， 其中ＮＯＲ３３３与Ｐ２是相同的。其中，ＰＯＴ３２、ＰＯＴ３３和ＰＯＴ７２只在非光合组织块茎中 表达，ＰＯＴ３２是块茎中ＰＰＯ的主要表现形式，在块茎的各个部分及块茎发育的各个阶 段均可发现。ＰＯＴ３３主要在块茎靠近表皮的组织中表达，ＰＯＴ７２在根中有发现，在块 茎中的表达水平比较ｊ［氐１５４］。马铃薯的Ｐ１和Ｐ２两个ＰＰＯ基因已被定位在８号染色体分子４墓蚍辫瞢蠡蜘耐岱ｔ蚪拍ｉ棚 Ｎ．ｔｅｒｍ；蚶Ｊ皖Ｚ冱＝＝＝＝ｊ―■＝＝＝＝＝＝］―■Ｅ＝：＝＝ｊ譬叠蚤蕊忑忑ＳＳ：登ｃ．”一ｍｌ 卜瑞 胤６我肚∞，５ＫＤ Ｃ－端 ｌ采２Ｋ扛‘ ＣＵＡ ｃｌｌ８慧淼酬。茗鬻等“。删岖ｏｆ ＰｒＯＥｉ＃哪ｅ１ Ｍ０１ｅｃｕｌ锄?ｓｔｒｕｎ＂ｅ团Ｉ ＰＰＯ的分早结构标记ＣＤ６０与ＴＧ２１６２＿问【６“。番茄ＰＰＯ多基因家族的特征是目前研究得最清楚的，番茄ＰＰＯ基因家族群集在１个１６５ｋｂ的染色体上，但是几个ＰＰＯ基因的５恻链分歧相当大。这可能是因为它们表达的调节因素不同，或是因为它们有不同的生理作用。番茄有７ 个编码ＰＰＯ的核基］Ｎ（ＰＰＯ Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ），串连分布于８号染色体２．２ｃＭ（约 １６５０ｋｂ）的区域内，每个ＰＰＯ转录本约２ｋｂ，其中ＰＰＯＥ、Ｆ，ＰＰＯＢ、Ｄ、集中分布在１２．４ｋｂ的区域［７３１。对一组小麦四倍体杂交系的研究发现，四倍体小麦中与ＰＰＯ高活性 相关的基因也已定位在２Ａ染色体的长臂上，并且这个基因与ＲＦＬＰ图中的分子标 Ｘｕｔｖｌ４２７．２Ａ高度相连【”１。香蕉中已获得了ＰＰＯ基因有：ＢＰ０１、ＢＰ０１１、ＢＰ０３４和ＢＰ０３５，其中ＢＰ０１几乎在所有的部位表达（包括花、茎、叶轴、根、果皮以及果肉），ＢＰ０１１可在花和根中表达，ＢＰ０３４和ＢＰ０３５在花中有表达，其余的部位仅有极少量的 表达，其中在花和叶轴中ＰＰＯ表达最强烈【９５１蚕豆和苹果至少有４个ＰＰＯ基因，杏的ＰＰＯ 基因（ＰＡ―ＰＰＯ）也属于多基因家族；但葡萄的ＰＰＯ只由１个核基因编码［６”。ＰＰＯ基因基 本没有内含子，Ｓｈａｒａ等［６９１首先将番茄的Ｐ２基因进行ＲＦＬＰ定位并与基因组的核苷酸序 列比较，结果表明Ｐ２基因与玉米贮存蛋白基因一样，不含有内含子。之后这一结论在 马铃薯、美洲商陆、葡萄、苹果、杏等植物的ＰＰＯ基因上也得到证实。唯一例外的是 Ｇｏｏｄｉｎｇ［”］从香蕉中提取的ＰＰＯｃＤＮＡ克隆，进行分析发现其含有８５ｂｐ的内含子，内含子３哪５’含有切割的共有序列，这是到目前为止在植物材料中第一个报导有内含子的ｃＤＮＡ。 ４．３ＰＰＯ基因的克隆 上世纪９０年代来，随着基因克隆技术的兴起和完善，对植物多酚氧化酶的研究已有了可喜的进展。主要体现在已对马铃薯‘６６１、豆型９６１、番茄【６９１、苹果【９７１等多种植物来源的多酚氧化酶基因进行了分离克隆及全序列结构分析。首次被克隆的ＰＰＯ基因是ＹｕＨ等［９８１提取番茄叶片腺状毛状体和表皮中的ｍＲＮＡ构建ｃＤＮＡ文库，用已知ＰＰＯ的多克隆抗体对文库进行筛选而得到的，首次分离出腺型毛状体ＰＰＯ ｃＤＮＡ（ｐ５９ＰＰＯ） 和质体ＰＰＯ ｃＤＮＡ（ｐ４５ＰＰＯ）全长。以后Ｓｈａｌｌａｒ等、ｃａｆｙ等、Ｈｕｎｔ等［６ ６，”，９６］也用同样的 方法，分别克隆出２个编码番茄花分生组织６６．３ＫＤ ＰＰＯ的Ｐ２基因（ｃＰ２／Ａ７、ｇＰ２／Ｂ）、２ 个编码蚕豆叶片６８ＫＤ ＰＰＯ前体的ｃＤＮＡ全长（ｐＰＰＯ．Ａ１和ｐＰＰＯ―Ｂ５）和一个部分的 ｃＤＮＡ克隆（ＣｌｏｎｅＱｌ）、２个编码马铃薯叶片６７ＫＤ ＰＰＯ前体的ｃＤＮＡ全长（ＰＰＯ―Ｐ１、ＰＰＯ。Ｐ２）。此后用这种方法，在蚕豆、马铃薯等植物中克隆了部分ｃＤＮＡ片段和ｃＤＮＡ 全长。随着ＰＣＲ技术特别是ＲＴ。ＰＣＲ的应用，加速了对植物ＰＰＯ基因的克隆。研究者 们利用ＲＴ．ＰＣＲ的方法相继克隆了一些植物如菠萝、甘薯、茶等的ＰＰＯｃＤＮＡ片段。也 有学者根据报道的ＰＰＯ铜结合区的保守序列设计２个寡核苷酸引物，以基因组ＤＮＡ为 模板进行ＰＣＲ扩增，得至ＵＰＰＯ基因。壶ＮＨａｒｕｔａ等［９９１根据已报道的苹果ＰＰＯ基因保守区 设计引物，以基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，直接从苹果、日本梨、中国梨、日本 枇杷、桃、中国木瓜等的果实和叶片中分离出２个ＰＰＯ基因全长。有了已克隆的ＰＰＯ 基因后，若要克隆还未克隆过的植物ＰＰＯ基因，通常情况下是根据已发表的ＰＰＯ基因 铜结合区的保守序列或从组织纯化的ＰＰＯ的Ｎ．末端的氨基酸序列设计２个寡核苷酸引 物，进行ＰＣＲ扩增，就可以得到ＰＰ０ ｃＤＮＡ片段或全长，若得到是ＰＰＯ ｅＤＮＡ片段， 还必需再进行３’一ＲＡＣＥ，ｎ５’．ＲＡＣＥ，获得ＰＰＯ ｅＤＮＡ全长。若把ＰＣＲ扩增与基因文库筛 选结合起来，可以高效准确地分离基因ＰＰＯ ｃＤＮＡ或基因全长。４．４ＰＰＯ基因的诱导和表达 许多生物和非生物因素都可诱导ＰＰＯ的表达或增力１１ｍＲＮＡ的稳定性，如机械损伤、生理胁迫、细菌真菌感染和信号分子（如茉莉酸甲酯、水杨酸、乙烯和ｃＡＭＰ）处 理等。但是这种诱导也是依据植物种类、部位、细胞类型、发育生长阶段的不同有种 类、时空、诱导程度的差异性。Ｔｈｉｐｙａｐｏｎｇｆｌ００】发现ＰＰＯＦ对广泛的诱导信号都有反应， 而且对不同的信号有不同的反应，茉莉酸甲酯和机械伤害使ＰＰＯＦ在１～３节幼叶中有 明显表达，乙烯促进ＰＰＯＦ在成熟（第七节）叶中的表达，水杨酸则使茎及叶的整个生长 发育时期ＰＰＯＦ的表达都增加。用分离到的多酚氧化酶基因标记后做探针，与植物组 织的ｍＲＮＡ进行原位杂交，即可获得多酚氧化酶在不同组织器官的表达信息。结果表 明：①不同植物、同一植物的不同组织器官、同一组织器官的不同发育时期ＰＰＯ基因 具有不同的时空表达模式。如从马铃薯叶片分离的ＰＰＯ．Ｐ１、ＰＰＯ．Ｐ２基因只在叶、叶 柄、根、花中表达，而在块茎中不表达；从番茄花分生组织中分离的Ｐ２基［］（ｃＰ２／Ａ７、ｇＰ２／Ｂ）Ｒ在花原基中高度表达，在其它发育阶段不表达；美洲商陆悬浮细胞培养物ＰＡＰｌ，和ＰＡＰ２在不同发育阶段的根、叶、花柄、绿色果实中不表达，但在变红的果实 中却高度表达；葡萄的ＧＰ０１和杏ＰＡ―ＰＰＯ的表达与美洲商陆相反，在幼果中表达，而 在成熟果实中不表达。苹果ｐＡＰ０５的表达具有很高的阶段特异性，只在盛花期后１周 的幼果中表达，在果实的其它阶段不表达。②植物组织受伤后多酚氧化酶ｍＲＮＡ的表 达量增加，受伤后６～１８ｈ的苹果多酚氧化酶ｍＲＮＡ的表达量稳定地增加，受伤的叶中 也可检测到多酚氧化酶ｍＲＮＡ表达量的增加。③冷害可导致植物组织多酚氧化酶 ｍＲＮＡ表达量的增加。这些结果表明，在多酚氧化酶系统中存在着ｍＲＮＡ水平上的转 录或转录后调控。４．５小麦ＰＰＯ遗传及分子生物学研究 ＰＰＯ是基因表达的产物，不同来源的ＰＰＯ分子结构差异很大，彼此间同源性不高。 但他们都有一个相似之处，即ＰＰｏ蛋白都含有两个非常保守的Ｃｕ结合域，在该区域， 氨基酸序列和对应的碱基序列同源性很高，该区域是ＰＰＯ催化功能所在。Ｄｅｍｅｋｅ等【Ｉ“］ 采用３个杂交组合，将小麦中与ＰＰＯ活性有关的基因定位到２Ｄ上，因为硬粒小麦缺少 Ｄ组染色体，ＰＰＯ活性较低，同时在２Ａ、２Ｂ、３Ｂ、３Ｄ、６Ｄ染色体上也可能有ＱＴＬ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ等【１。２１研究也有相似的结果。Ｄｅｍｅｋｅ和Ｍｏｒｒｉｓ等【１０１，１０３，１１ ５１人利用功能区域的 同源性设计引物扩增Ｈ４４４４ｂｐ的小麦ＰＰＯ基因片段，序列分析表明该片段含有保守区 氨基酸的编码序列，表明其是小麦ＰＰＯ基因的一部分，用该片段作探针，筛选基因组和 ｃＤＮＡ文库，未能获得ＰＰＯ基因，基于该片断长度的ｍＲＮＡＲａｃｅ―ＰＣＲ技术路线，并由 此片段向两端延伸（ｇＡＣＥ）获得大小为１５０９ｂｐ的小麦ＰＰＯ基因序列。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析 表明，小麦ＰＰＯ基因不多，只有２．３个。根据小麦ＰＰＯ基因１５０９ｂｐ的核苷酸序列推断的 ５０３个氨基酸序列，与其他植物ＰＰＯ蛋白质氨基酸序列的同源性不高，相似性在４９～ ５８％，但在保守的ｃｕ结合区，相似性非常高‘１０３】。Ｊｕｋａｎｔｉ等‘１０４１利用电子克隆等技术研 究了小麦ＰＰＯ基因的特征，结果表明，小麦中至少有６种不同的基因，根据其序列的 相似性可分为两类，但不能排除针对不同底物而存在多个基因位点的可能性。 利用多种分子标记分析表明，控带ＩＪＰＰＯ活性的主效基因位于染色体的第二同源群 上（２Ａ、２Ｂ、２Ｄ），但是不同的研究材料其主效基因也有差异：其他染色体（立Ｈ３Ｂ，３Ｄ， ６Ｂ）ｎ司ｆ能存在一些微效基因【ｌｏｌ】。ＪｉｍｅｎｅＺ【１０５】和Ａｎｄｅｒｓｏｎ等【１０２］通过对代换系ＰＰＯ活性 的测定，推测出控制小麦ＰＰＯ活性的主基因为１．２对，同时还认为针对ＰＰＯ底物的转化 性存在多个等位基因。葛秀秀等【ｌ０６］运用植物数量性状主基因＋多基因混合遗传模型对 冬小麦ＰＰＯ活性的遗传分析研究发现，ＰＰＯ活性受两对主基因控制。５影响多酚氧化酶活性的因素ＰＰＯ作为一种酚类氧化酶，他具有酶类物质的许多共同特征，如严格的底物专一 性和催化反应的高效性。虽然ＰＰＯ的多重性具同一遗传基础，但也受额外因子的影响； 不同来源的多酚氧化酶由于其理化性质存在很大差异，所以在不同植物体内表现不同 的活性特征，且其表现最适活性的环境因子要求不一致，对同一种物理或化学处理的 敏感性反应也不相同。同样ＰＰＯ也属于一种蛋白质，其活性受到外界环境因素的影响。 女ｌｌｐＨ值、反应温度、不饱和脂肪酸、各种蛋白去污剂（如ｓＤｓ）和激活剂等理化条件都 可影响其活性【２５’１０７】。ｐＨ是影响ＰＰＯ活性的重要因素，不同植物或同属不同种植物体 ＰＰ０活性的最适ｐＨ均不相同，其变化幅度范围很大。不同物种的ＰＰＯ的最适ｐＨ范围 比较宽，在３＿８之间，王清［４０］在马铃薯ＰＰＯ活性影响因子的研究中认为，ｐＨ对马铃薯 ＰＰＯ活性具明湿影响，块茎芽以及愈伤组织ＰＰＯ活性均在５．０―５．５之间最高，而试管苗在培养基ｐＨ为８时ＰＰＯ活性最高。韩富根等［４７］在烟草叶片多酚氧化酶的提取及其特征 研究中指出，ｐＨ为６时，多酚氧化酶活性最高；在偏碱条件下，酶的活性下降快。乌贼中为ｐＨ７．２，龙虾中为ｐＨ６．３，莲藕则出现ｐＨ５．０和ｐＨ８．０两个活性峰盼”１”…，Ｆｒａｎｃｅｓｏ等对小麦ＰＰＯ进行了部分纯化，发现ＴｐＨ为６．９和５．３两个活性峰；而Ｍｏｊｔａｂａ等［１０９］则 认为小麦ＰＰＯ的最适ｐＨ６．４。此外，不同物种的ＰＰＯ活性的最适反应温度是不同的， 小麦ＰＰＯ的最适催化温度为３５℃、葡萄为２５℃、龙虾为３７。Ｃ、苹果梨为４０。Ｃ、苹果在 １６。２４。Ｃ之间、而莲藕为３０℃。在一些蔬菜、水果、水产品的加工和储藏时，其所含 ＰＰＯ也是发生褐变的主要原因。为了防止褐变、延长货架期和储存期，人们常加入Ｖｃ 来保鲜水果和蔬菜等，其原理就是为了抑制体内的ＰＰＯ活性。对于小麦制品来说，加 入ｖｃ也可抑青ｌＪｐｐｏ活性，Ｂａｉｋ等ｆ１４】认为在面团中加入一定量的ｖｃ可延缓其褐变，其 原因也就是抑制了其中的ＰＰＯ活性。多酚氧化酶属于植物体内的末端氧化酶系统，光 照明显促进了此酶的活性。一定的光照强度变化幅度内，ＰＰＯ活性随光强增加而上升。 此外，抑制剂对多酚氧化酶活性有明显影响。抑制剂对多酚氧化酶的作用机理是作用 于产物的还原或抑制酶的活性。ＰＰＯ的辅基为铜离子，从理论上说，应该有２种类型 的抑制剂：（１）与铜离子作用从而抑制酶活性的物质；（２）影响底物与酶作用部位结合 的物质。 许多品质参数如小麦的籽粒性状（千粒重、籽粒颜色等）、面粉的蛋白和灰分含量 以及出粉率都与籽粒和面粉的多酚氧化酶活性显著相关【１４，２啪明。同一品种，大籽粒比 小籽粒多酚氧化酶活性高，同一品种不同籽粒大小的多酚氧化酶活性差异小于籽粒大 小相当不同品种间差异，而且，多酚氧化酶活性隧籽粒成熟度的增加而降低，其间差 异似乎和成熟过程中酶的合成及小麦发芽有关。多酚氧化酶活性也受小麦类型的影 响，硬粒小麦多酚氧化酶活性最低，普通白粒小麦多酚氧化酶活性低于硬红冬、硬红 春及软红冬小麦，但是硬红冬和软红冬、硬红冬和硬红春间多酚氧化酶活性差异较小 １３０１，杨朝柱研究表明红皮小麦品种平均多酚氧化酶活性显著大于白皮小麦品种，而且 多酚氧化酶活性与角质率有关，角质品种大于粉质品种【３“。面粉多酚氧化酶含量随出粉率的提高而提高【１１０】，随磨粉时麸皮污染程度的增强丽增强【ｌｌｌ￣１１４】。６小麦多酚氧化酶的提取及活性测定根据对试验材料的处理不同，小麦籽粒的ＰＰＯ提取可分为全籽粒浸取、全麦粉提 取、面粉提取和从麸皮中提取。在浸提条件一致时，从麸皮中提取的ＰＰＯ活性最高， 全麦粉次之，面粉中ＰＰＯ活性最低，平均来说面粉的多酚氧化酶仅占总多酚氧化酶的３％左右【１４】。全籽粒浸提法的优点是不破坏籽粒，浸提后的种子可再用于播种，对于育种的早代材料的筛选有利，对遗传育种研究很有价值。但是浸提的时间较长，不能 排除品种间籽粒大小差异的影响，也不能排除浸提时间过长使浸提液中含有其他褐变物质的可能性。杨朝柱等【３２】研究表明全籽粒浸提２５．３０ｈ较好。一般面粉和全麦粉提取 时间较短，人致为３０ｍｉｎ－２ｈ。 准确测定ＰＰＯ活性，主要取决于两个因素：①合适的底物；②适当的测定方法。 测定ＰＰＯ活性的方法较多，有：减压法，耗氧电极法，分光光度法，精密记时测定法， 高效液相色谱法（ＨＬＰＣ）等。目前测定小麦中的ＰＰＯ活性主要有两种方法，分光光度法 和耗氧电极法。耗氧电极法主要原理是ＰＰＯ在催化反应中要０２的参与，可通过测定单 位时间内的耗氧量来表示，ＰＰＯ的活性，使用的电极大多为Ｃｌａｒｋ氧电极；分光光度法主 要是测定单位时间内ＰＰＯ催化酚类反应产物吸光度的变化来反映ＰＰＯ的活性。耗氧电 极法是测定ＰＰＯ活性的标准方法，耗氧电极法早期被广泛应用，现在主要采用分光光 度法，由于分光光度法操作简便、快速、方便、准确等特点而被广泛使用［２０，３０】。酚酶 作用的底物有绿原素、花色素、咖啡酸、儿茶酚、黄酮醇等，测定ＰＰＯ活性的底物有： 邻苯二酚、邻苯三酚、酪氨酸、绿原酸、多巴和多巴氨，其中以邻苯二酚测定较为灵敏、费用低、操作简便、适合于大规模检测‘３０ｊ”。Ｍｏｒｒｉｓ［１１”、Ｌｅｅ［１１６】和Ａｎｄｅｒｓｏｎ【１ ０２］等将整粒种子测定方法做了进一步改进：３―５个整籽粒或０．４９被钳碎的种子放入离心管 中，加入用５０ｍＭ ＭＯＰＳ缓冲液配制的Ｌ．ＤＯＰＡ，室温振荡反应３０ｍｉｎ或３７。Ｃ振摇５ｍｉｎ 后过滤，然后在分光光度计下测定４７５ｎｍ吸收值．这种方法与研磨种子氧电极法比较， 相关系数为０．８６。然而，利用已报道的分光光度法测定ＰＰＯ活性时，其精确度还有待 于进一步提高。７研究多酚氧化酶的目的和意义多酚氧化酶活性主要受基因型的影响，不同品种间ＰＰＯ活性差异较大，因此通过 遗传途径降低多酚氧化酶活性是可行的，美、加、澳等国已将其列为育种目标，有可 能培育多酚氧化酶接近零的品种。许多育种单位（例如华盛顿州立大学、悉尼大学等） 在亲本选配及Ｆ２代便开始对多酚氧化酶进行选择。本研究的目的是：首先，对小麦ＰＰＯ 活性检测方法进一步加以了改进，确定合适的活性测定方法，使该方法更加适合品种 资源的筛选：其次，对杂交组合（扬麦１５８Ｘ淮麦１８）的Ｆ２和Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性进行测定并分析；此外，运用单个分离世代群体遗传模型分析方法对扬麦１５８×淮麦１８组合的Ｆ２群体、Ｆ２：３家系群体ＰＰＯ活性进行遗传分析。从而了解ＰＰＯ活性的遗传背景， 旨在鉴定出控制该组合ＰＰＯ活性基因的遗传情况，为低ＰＰＯｄ、麦选育提供依据。以期 为小麦ＰＰＯ的遗传改良提供依据。三种小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较１试验材料和方法１．１试验材料 ２００３―２００４年度：不同来源的２０个小麦样品，包括ＰＨ６９１１（紫芦湖良种场）、丰收６０（紫芦湖良种场）、阜阳９３６（挪Ｈ）、西农９５７（涡阳）、豫麦１８（涡阳）、豫麦３４（涡阳）、秦农１４２（紫芦湖良种场）、宿０４２（紫芦湖良种场）、皖９９４９（紫芦湖良种场）、周麦 １７（紫芦湖良种场）、豫麦１８（新马桥）、豫麦１８（紫芦湖良种场）、豫麦４９（紫芦湖良种场）、 豫麦４９（新马桥）、豫麦４９（涡阳）、早抗１号（涡阳）、早抗１号（紫芦湖良种场）、早抗１ 号（新马桥）、周麦１７（涡阳）、周麦１７（新马桥）。 １．２试验方法 １．２．１仪器设备和药品 １．２．１．１仪器设备 ＵＶ７５５Ｂ紫外可见分光光度计（上海精密仪器厂生产）、恒温水浴振荡器、瑞典进 口旋风磨（Ｏ．５ｍｍ筛）、１０ｍＬ移液管、１５ｍＬ移液管、烧杯（若干）、中速定量滤纸、高 速冷冻离心机（ＳｉｇｍａＬａｂｏｒｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｓ．ＳｉｇｍａＣｏ．Ｇｅｒｍａｎ）、１５ｍＬ离心管、制冰机、冰箱、漏斗（若干）。 １．２．１．２试剂药品 试剂（现用现ｆｌＰ）５０ｍＭ ｐＨ＝６．５的ＭＯＰＳ（３一［Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）缓 冲液（１．０４６５９＋１００ｍＬ双蒸水）、１０ｍＭ Ｌ－ＤＯＰＡ（Ｌ－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ） ｒＯ．１９７２９＋１００ｍＬＭＯＰＳ）。１．２．２ＰＰＯ活性测定方法１．２．２．１全籽粒浸提法 籽粒中ＰＰＯ活性的测定根据Ａｄｅｒｓｏｎ等‘１０２１人方法作了部分修改。种子预处理， 选取２０粒完整的小麦种子（称重），大小基本一致，去掉病虫瘪粒，用双蒸水清洗２ 次（清洗十分必要，可除去种子表面的灰尘等杂质，以避免分光光度计读数的不稳定）， 置于滤纸上风干。将风干的２０粒种子放入５０ｍＬ的烧杯中，加入１５ｍＬ反应试剂ｆ５０ｍＭ ｐＨ＝６．５的ＭＯＰＳ缓冲液和１０ｍＭ Ｌ－ＤＯＰＡ），恒温水浴振荡器振荡３０ｍｉｎ后，振荡器速度设为ｌＯＯｒ／ｍｉｎ，温度设为３７。Ｃ。然后，迅速放到冰块上终止反应。将反应 后的溶液倒入比色皿中，以反应试剂（空白Ｌ．ＤＯＰＡ／ＭＯＰＳ）为对照，在４７５ｎｍ波长’卜．， 用Ｉ－ｃｍ光程比色ｍｔＮ定３０ｍｉｎ内吸光度的变化值△Ａ（△Ａ为３０ｍｉｎ内吸光值的变１４化１，ＰＰＯ的活性可表示为ＵＡ４７５＝ＡＡ＊１０３ＡＵ／（ｇ＊ｍｉｎ）。共６０粒种子，３次重复。 １．２．２．２全麦粉离心检测法 用瑞典进口旋风磨（Ｏ．５ｎｍａ筛）将小麦制成全麦粉，称取Ｏ．５０００９全麦粉样品放入 烧杯中，加入７．５ｍＬ反应试Ｎ（５０ ｍＭ ｐＨ＝６．５的ＭＯＰＳ缓冲液和１０ｍＭ Ｌ．ＤＯＰＡ）， 放在混旋器上混匀，使样品粉末充分湿润。把烧杯迅速放在恒温水浴振荡器上振荡 ５ｍｉｎ（使样品充分暴露在空气中）。振荡器速度设为ｌＯＯｒ／ｍｉｎ，温度设为３７＂Ｃ。再放在 混旋器上迅速混匀，使样品颜色一致，并马上将样品放在冰块上终止反应，随后将上 部液体倒入１５ｍＬ离心管内，在４０００ｒ／ｍｉｎ的离心机上４＂Ｃ离心１０ｍｉｎ至液体清亮为 止。以反应试剂（空白Ｌ．ＤＯＰＡＪＭＯＰＳ）为对照，在４７５ｎｍ波长下，用分光光度计测定 离心后上清夜的吸光度△Ａ（△Ａ为５ｍｉｎ内吸光值的变化）。计算结果：ＰＰＯ的活性可 表示为ＵＡ４７５＝Ａ Ａ＋１０３ＡＵ／（ｍｉｎ＊ｇ）＝Ａ Ａ＊１０３ＡＵ／（５ｍｉｎ＋０．５曲，试验进行３次重复。 １．２．２．３全麦粉过滤检测法 检测方法按照Ａｎｄｅｒｓｏｎ和Ｍｏｒｒｉｓ［１０２，１１５］方法，并作了部分修改。用瑞典产旋风磨 制备全麦粉（过０．５ｍｍ筛）。称取Ｏ．３０００９全麦粉放入约５０ｍＬ的小烧杯中，加入７．５ｍＬ 反应试Ｎ（５０ ｍＭ ｐＨ＝６．５的ＭＯＰＳ缓冲液和１ ０ｍＭ Ｌ－ＤＯＰＡ），在恒温水浴振荡器上振 荡５ｒａｉｎ（使样品充分暴露在空气中）。振荡器速度设为１００ｒ／ｍｉｎ，温度设为３７。Ｃ。迅 速将反应后的样品放在冰块上终止反应（约ｈｎｉｎ）。迅速混匀样品，用中速定量滤纸进 行过滤。以反应试剂（空白Ｌ－ＤＯＰＡ／ＭＯＰＳ）为对照，在４７５ｎｍ下测定滤液的吸光度△ Ａ（△Ａ为５ｒａｉｎ内吸光值的变化）。ＰＰＯ活性可表示为：ＵＡ４７５＝ＡＡ４１０３ＡＵ／（ｍｉｎ＊ｇ）， 试验进行３次重复。２结果分析２．１不同方法测定的ＰＰＯ活性比较分析 本研究运月３种不同的方法分别测定了来源不同的２０个小麦样品的ＰＰＯ活性， 结果表明全麦粉过滤法（方法３）和全麦粉离心法（方法２）测定的ＰＰＯ活性比全籽粒浸 提法（方法１）高。全麦粉过滤法（方法３）Ｎ定的ＰＰＯ活性是全籽粒浸提法（方法１）的 ８．８９．１８．７ｌ倍，全麦粉离心法（方法２）Ｎ定的ＰＰＯ活性是全籽粒浸提法（方法１）的 ５．２０．１１．５４倍。从表２可以看出相同重量的全麦粉ＰＰＯ活性要显著高于完整的小麦籽 粒。 从表１可看出，全籽粒浸提法（方法１）三个重复问的变异系数最大，高达１５，１９％， 全麦粉离心法（方法２）次之，全麦粉过滤法（方法３）Ｚ个重复间的变异系数最小，只有 ２．７４％。这３种方法测定的２０个来源不同的小麦样品ＰＰＯ活性差异均达到极显著水平。由图２可知，不同方法测定的ＰＰＯ活性变化曲线差异较大。对于全麦粉过滤法（方３５０３００ 嚣 ＝兽 ２５０。ａ等。 山 山２００蛆１５０ 忧２ 山１００５００Ｉ２３４５６Ｆｉｇ－２?Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ ｏｆＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｌＩｒｅｃ釜、｝竺手麦黧离心法（方法２）来说，测定的２０个样品间ＰＰｏ活性差异较大，而全籽“粒浸提法（方法１）测定的２０个样品问ＰＰＯ活性差异较小。表Ｉ：ｉ―――＝Ｔａｂｌｅｌ．Ｃ…ｏｍｐａｒｉ，ｓｉｏｎ方法Ｉ２１ ０７罢＿―堕―塑塑塑翌――塑１５．１９ ９．６９ｏｆＰＯａｃｔｉｖ ｅｓｍ～ａｓｕｒｅｄｗｉｔｈ ｒｅｄｉｆｔｂａ－ｅｎｔｍ ｈｏｄｓ９ ｌＯ １２ １３７８１１１４１５１６１７１８１９２０ｄｉ茄猢ｔ ｍｅｔｈｏｄｓ三种方法测定的ＰＰＯ活性比较分析９．５０－３２ ７０型坠―型生――上堡～．堕！：塑！方法２１８６ ９５１５，１。ｔ。――！三二９０肿．２９８２７２１．０“３。！型：１２．２三种不同方法测定的ＰＰＯ活性相关分析。，耸粤３，４，５可以看出，全麦粉过滤法和全麦粉离心法测定的ＰＰｏ活性相关系数最高，达０．９５３，全麦粉过滤法和全籽粒浸提法测定的ＰＰＯ活性相关系数次之，为Ｏ．８５８， 而全籽粒浸提法和全麦粉离心法测定的ＰＰＯ活性相关系数最小，仅为Ｏ．７９８。３讨论。．．：：ｏ活性测定常用的方法有比色法、耗氧电极法。耗氧电极法基于氧气的消耗量来估算酶活，试验条件难以控制，因此～般采用比色法，该方法操作快捷。ＰＰＯ活性表２三种方法测定的ＰＰＯ活性比较分析！！§！ｉ；：量２熙粤！！婴２ｉ￡￡２兰蚴垡置巴删趔旦！塑鳖！虫！塑！巴望！！生品种编号 品种名称 品种来源 活性 方法一Ｍ３／ＭＩ Ｍ２／Ｍ１方法二 活性Ｍ３／Ｍ２方法三 活性注：活性指ＰＰＯ活性。单位是ＡＵ／ｇ＊ｍｉｎ。Ｍ３／ＭＩ指方洼３和方法１的比值－Ｍ３／Ｍ２指方法３和方法２的比值，Ｍ２／ＭＩ指方法２和方法１的比 值。Ｎｏｔｅ：ＡｃｔｉｖｉｔｙｉｓＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＵｎｉｔｉｓＡｔ７／ｇ’ｍｉｎ Ｍ３／Ｍ１ａｎｄｍｅｔｈｏｄ ２，Ｍ２／ＭＩｒｅｐｒｅｎｔｓｔｈｅ ｒｏｐｒｅｎｔｓｔｈｅ ｒａｔｉｏｏｆｍｅｔｈｏｄ３ａｎｄｍｅｔｈｏｄｌ，Ｍ３／Ｍ２ｒｅｐｒｅｎｔｓｌｈｅｒａｔｉｏｏｆｍｅｔｈｏｄ ３ｒａｔｉｏｏｆｍｅｔｈｏｄ２ ａｎｄｍｅｔｈｏｄｌ１７３５。３。。２５。乜Ｄ暑２００｛啪ｕ ｌ。。 ５０鼍ｕｇ＿。Ｉｏ口；％ｑ口目∞ ｏｑ￥｛、１，窿杂悄州０ ０ ５０ １００１５０２００２５０３００３５０全麦粉过滤法ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｏｆｗｈｏｌｅ－ｍｅａｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ图３全麦粉过滤法和全麦粉离心法测定的ＰＰＯ活性相关分析Ｆｉｇ．３．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｌｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆｗｈｏｌｅ－ｍｅａｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｗｈｏｌｅ―ｍｅａｌ ｃｅｎｔｒｉｆ＿１１９ｉｎｇ３５３０巧者口篇ｏ∞芍８ 一趸Ｊ０ 加“ｍ；ｐｏ鲁。目∞ｑｌ军｝掣璐彝婪剞Ｏ ０ ５０ １５０ ２００ ２５０ ３００ ３５０全麦粉过滤法ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆｗｈｏｌｅ?ｍｅａｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ圈４全麦粉过滤法和全籽粒浸提法测定的ＰＰＯ活性相关分析Ｆｉｇ．４．Ｔｈｅ ｃｏｒｃｅｌｍｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｈｏｌｅ－ｍｅａｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇｏｆｆｕｌｌｓｅｅｄｓ ｓｏａｋｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ的测定可以采用邻苯二酚、多巴、酪氨酸，绿原酸、没食子酸等作为底物。在底物选 择上，多巴被认为是ＰＰＯ作用的直接底物，但价格昂贵。邻苯二酚是被广泛使用的底１８物，价格低廉，但是测定结果不稳定，且邻苯二酚本身具有毒性，在试验操作中存在 一定危险性。最近，国外很多关于小麦ＰＰＯ活性研究都是以多巴（Ｌ－ＤＯＰＡ／ＭＯＰＳ）为底 物测定ＰＰ０活性的，大家都认为以多巴为底物测定结果要比邻苯二酚稳定。 分别用３种不同的方法测定了来源不同的２０个小麦样品的ＰＰ０活性，结果表明 全麦粉过滤法（方法３）和全麦粉离心法（方法２）测定的ＰＰ０活性比全籽粒浸提法（方法 １）高。这可能证实了以前的报道，ＰＰ０主要分布在小麦的糊粉层，全麦粉破碎了种挪姗瑚司。目也。１ ｝Ｊｏ瑚啪眦目壮已Ｈ扫Ｈｇｏ㈣蚰ｑ善目。ｄ军｝０忸弈州。全籽粒浸提法ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｆｕｌｌｓｅｅｄｓｓｏａｋｉｎｇ图５全籽粒浸提法和全爱粉离心法删定的ＰＰＯ活性相关分析Ｆｉｇ ５．Ｔｈｅ ｃｏ．ｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＰＯ ａｅｔｉｖｉｔｉｅｓｍｅⅢｅｄ ｂｙ ｔｌｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ如ｌｌ ｓ。ｅｄｓｓｏａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｈｅ ｍｅｌｈｏｄ ｏｆｗｈｏｌｅ＿ｍｅａｌ㈣研ｆｕｇｊｎｇ 子结构，使种子糊粉层中的ＰＰＯ充分与底物接触，而使测定的全麦粉ＰＰＯ活性普遍 要比全籽粒浸提法测定的ＰＰＯ活性高。全籽粒浸提法，提取时间较长，提取半个小 时的活性仍旧很低，这与杨朝柱［３２】等研究结果相似。其原因可能是种皮致密的结构妨 碍了ＰＰＯ的浸提，浸提时间过短。如果适当延长浸提时间，全籽粒浸提法（方法１）测 定的ＰＰＯ活性可能会高些，但是浸提时间过长，也可能会浸提出其他能导致褐变的 物质，从而使最终ＰＰＯ活性测定不够精确。 由于全麦粉过滤法（方法３）测定的ＰＰＯ活性３个重复间变异系数最小，应用此方 法进行ＰＰＯ活性测定的重复性会更好。全麦粉过滤法所需样品量最少，可用于早代 选择；所需反应试剂量也很少，比较经济实惠（多巴（Ｌ―ＤＯＰＡ）价格比较昂贵）；整个反 应及试验操作时间较短，测定效率高，还可以适当减小ＰＰＯ测定过程中的误差。全 麦粉离心法（方法２）和全籽粒浸提法（方法１）测定ＰＰＯ活性，反应和试验操作时间较长，测定效率不高，另外，所需样品量较多。全籽粒浸提法测定ＰＰＯ活性还受籽粒 大小不均匀的影响。但是，全籽粒浸提法也存在其优点，Ａｎｄｅｒｓｏｎ等［１０２１用３．（Ｎ．吗啉 代）丙磺酸（ＭＯＰＳ）作为提取缓冲液，以３，４．羟基苯丙氨酸（Ｌ－ＤＯＰＡ）为反应底物测定 完整籽粒ＰＰＯ活性时，这样可以不破坏籽粒和发芽能力。 由于用全麦粉测定ＰＰＯ活性时，所需样品量少，且反应时间短，可用于早代筛 选ＰＰＯ活性，这与常成ｉ５Ｊ的研究结果基本一致。综合上述各个因素，全麦粉过滤法是 一种高效、经济、快速、稳定测定早代ＰＰＯ活性的好方法。但是，用全麦粉过滤法（以 Ｌ―ＤＯＰＡｆＭＯＰＳ为底物）测定小麦ＰＰＯ活性，受测定环境条件的影响较大，尤其是测 定环境的温度和反应的时间，所以测定过程中要尽量使环境温度恒定，严格控制反应 时问，本试验都是用此方法来测定ＰＰＯ活性的。由于多巴价格比较昂贵，限制了其 在大规模材料筛选中的应用，因此，使用的试剂量微量化显得十分必要，测定ＰＰＯ 活性的微量方法还有待于深入探索。ＰＰＯ作为一种酶蛋白在活性测定时易受很多因素 的影响，如：温度、湿度、周围大气的成分等的变化都会影响酶的活性，这些因素都 有待于进一步研究和探索。因此，我们在对材料的浸泡时间，测定温度、反应时问、 缓冲液成分、ｐＨ等因素进行进一步深入研究，以期优化活性测定条件，建立高效、 稳定测定ＰＰＯ活性的良好方法，提高ＰＰＯ活性测定准确性。现在还有人采用酶标仪单籽粒测定的方法来测定ＰＰＯ活性，此方法可降低测定误差，提高测定效率，经济实惠，被认为更适合小麦育种材料的快速筛选。此外，部分ＰＰＯ是以潜伏状态存在 于某些植物组织的质体膜上的，酸、碱、去污剂及尿素等均可使之激活【１２”。Ｊｕｋａｎｔｉ［１０４］ 等认为成熟的小麦籽粒中存在部分潜伏状态的ＰＰＯ，ＳＤＳ（－［－‘二烷基硫酸钠）可有效提 高和激活此状态的ＰＰＯ活性。ＰＰＯ是目前已知的唯一能被变性剂ＳＤＳ激活的蛋白酶 分子，可能是增加了ＰＰＯ的溶解性或部分变性改变了分子的构象【ｌ”＇ｌ”Ｊ。在面团形成过程中，这些酶会慢慢转化成活性状态并长期影响面团及其制品的色泽【ｌ“，ｌ”】。ＰＰＯ是一种金属酶蛋白，可以被抗坏血酸、二乙基二硫代氨基甲酸盐、氰化物、高浓度的 卤化物以及一些含有羧基的物质，如柠檬酸所抑制。因此研究潜伏状态的ＰＰＯ特性 和抑制剂对ＰＰＯ的抑制效应显得比较重要，这些研究都有待于进一步深入。７．０扬麦１５８×淮麦１８组合早代ＰＰＯ活性变异及其遗传分析Ｄｅｍｅｋｅ等（２００１）认为ＰＰＯ是多基因控制的遗传性状，在很大程度上受环境因素 的影响，小麦中与ＰＰＯ活性有关的基因可能在２Ｄ、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ、３Ｄ、６Ｄ染色体上［１０１］。Ｂａｉｋ等㈣也发现种植在澳大利亚和美国的同一品种籽粒ＰＰＯ活性之间存在显著差异，但对同一地点的不同品种进行比较，发现基因型是影响ＰＰＯ活性的主要因素。 葛秀秀等（２００４）运用植物数量性状主基因＋多基因混合遗传模型对冬小麦ＰＰＯ活性的 遗传分析表明，中优９５０７×ＣＡ９６３２的ＰＰＯ活性受２对独立主基因控制【ｌ”］。由于 不同组合的ＰＰＯ活性的遗传情况可能不同，控制不同组合的ＰＰＯ活性的主基因数目 可能不同，因此，对不同组合的ＰＰＯ活性的遗传情况进行鉴定显得十分必要。 本研究用全麦粉过滤法测定了杂交组合（扬麦１５８×淮麦１８）分离世代（Ｆ２群体和 Ｆ２：３家系群体）的ＰＰＯ活性，并用单个分离世代群体遗传模型分析方法对Ｆ２群体、Ｆ２：３ 家系群体ＰＰＯ活性进行遗传分析，旨在鉴定出控制该组合ＰＰＯ活性基因的遗传情况， 为低ＰＰＯ小麦选育提供依据。ｌ材料和方法１．１试验材料杨朝柱㈣用籽粒浸提法测定了扬麦１５８和淮麦１８的ＰＰＯ活性，分别为１２０．２８、３５．７９ＡＵ／（ｍｉｎ＊曲，差异较大。２００２年４月用这两个品种进行杂交，２００３年ｌＯ月，将扬麦１５８×淮麦１８的Ｆ１种子种植于安徽农业大学试验农场，单粒点播，插入扬麦 １５８和淮麦１８亲本作为对照，２００４年６月成熟时随机收获３７６个单株，分株脱粒。２００４年ｌｏ月，将收获的Ｆ２单株种子种植于安徽农业大学试验农场，每株行长２ｍ，每行１００粒种子。２００５年６月分行收获和脱粒，构建Ｆ２：３家系。 １．２试验仪器及药品 ＵＶ７５５Ｂ紫外可见分光光度计（上海精密仪器厂生产），恒温水浴振荡器、瑞典进 口旋风磨（Ｏ．５ｒａｍ筛）、１０ｍＬ移液管、烧杯（若干）、中速定量滤纸、制冰机、冰箱、漏 斗（若干）。试剂（现用现配）５０ｍＭ ｐＨ＝６．５的ＭＯＰＳ（３一［Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）缓冲液（１．０４６５９＋１００ｍＬ双蒸水）、１０ｍＭ Ｌ－ＤＯＰＡ（Ｌ－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ） （ｏ．１９７２９＋ｌＯＯｍＬＭＯＰＳ）。１．３ＰＰＯ检测方法 检测方法按照Ａｎｄｅｒｓｏｎ和Ｍｏｒｒｉｓ［１１５，１０２１方法，并作了部分修改。用瑞典产旋风磨制备全麦粉（过Ｏ．５ｍｍ筛）。称取Ｏ．３０００９全麦粉放入约５０ｍＬ小烧杯中，）Ｊｎｘ７．５ｍＬ反应试剂（５０ ｍＭ ｐＨ＝６．５的ＭＯＰＳ缓冲液和１０ｍＭ Ｌ．ＤＯＰＡ），在恒温水浴振荡器上振荡５ｒａｉｎ（使样品充分暴露在空气中）。振荡器速度设为１００ｒ／ｍｉｎ，温度设为３７ ０Ｃ。迅 速将反应后的样品放在冰块上终止反应（１ｍｈＯ。迅速混匀样品，用中速定量滤纸进行过滤。以反应试剂（空白Ｌ―ＤＯＰＡ／ＭＯＰＳ）为对照，在４７５ｎｍ下测定滤液的吸光度△州△Ａ为５ｍｉｎ内吸光值的变化）。ＰＰＯ活性可表示为ｕＡ４７５＝ＡＡ＊１０３ＡＵ／（ｍｉｎ＊ｇ）。２结果分析２．１Ｆ２单株和Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性变异及相关分析 ＰＰＯ活性分析结果表明，亲本品种扬麦１５８和淮麦１ ８的ＰＰＯ活性平均值分别为２３３．５５ ＡＵ／（ｍｉｎ＋曲和１２６．６７ ＡＵ／（ｍｉｎ＋曲。Ｆ２单株ＰＰＯ活性变幅范围在６５．３３～ ３６７．７８ＡＵ／（ｍｉｎ＋曲之间，３７６个单株的平均活性为１４８．１２ＡＵ／（ｍｉｎ＊ｇ），介于双亲之间，１２０ ３。１００２５蚕ｓｏ萤６０葵４０加０ ” Ｎ ― ” 卜 ｎＩｎ２０蓍，ｓ童 －ｏ萎５陋Ｏ ”ｔ－－－。。ＩｎＮ 心Ｎ” 卜－ｎＩｎＮ卜” Ｎ” 卜” Ｎ” 卜” Ｎ．ｎ卜” Ｎ＝譬２篓蜀霜焉罱罱罱罱ＡＵ／（ｎｉｎ＊勘图６ Ｆ２单株的ＰＰＯ活性分布Ｆ２ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＦｉｇ．６．Ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆＰＰＯ ａｃｔｉｖｌｔｙ ｉｎ但明显偏向于低值亲本，共有３２９个单株（占总株数的８７．５％）集中在８７．５～２１２．５ ＡＵ／（ｍｉｎ＊ｇ）之间，而高于２１２．５ ＡＵ／（ｍｉｎ＊ｇ）和低于８７．５ＡＵ／（ｍｉｎ＋曲的仅有４７株，占总 株数的１２．５％（图６，表３）。Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性变幅范围在７７．３３～４４８．００ ＡＵ／（ｍｉｎ＋曲之间，平均值为２３８．８７ ＡＵ／（ｍｉｎ＊ｇ）（图７，表３），呈明显的偏态分布，共有３１４个株行（占总数的８３．５呦集中在１２５～３２５ＡＵ／（ｍｉｎ＊ｇ）之间。而高于３２５ＡＵ／（ｍｉｎ４９）和低于１２５ＡＵ／（ｍｉｎ＋曲的仅有６２个株行，占总数的１６．５％（图７，表３）。 Ｆ２群体和Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性变异系数分别为２８．６６％和２８．３３％。相关分析结果 （图８）表明，Ｆ２群体和Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性的相关性较好，运用ＳＡＳ统计软件 进行相关分析可得，Ｆ２群体和Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性极显著相关，ｒ＝０．７２７。１２０３０１００２５醢喜８０２０罟８重６０蒸４０２０ Ｏ ２５ ７５ １２５ １７５ ２２５ ２７５ ３２５ ３７５ ４２５ ４７５１５童羞１０女妞５０ＡｌＹ（ｍｉｎ＋曲图７Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性分布Ｆｉｇ．７．Ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＰＰＯａｃｔｉｖｉｔｙｉｎ Ｆ２：３ｆａｍｉｌｙ ｇｒｏｕｐｓ表３Ｆ２单株与Ｆ２ ３家系群体ＰＰＯ活性的变异！垫１２ｊ：２壅里§竺堑鳃照竺！生娅！ｉ！！呈￡Ｑ！坐垫＆￡苎要型ｉ！！登ｇ￡；。ｊ！ｊ型！Ｚ罂！！Ｅ兰ＰＰＯ均值 数量 世代Ｔｏｔａｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｎｕｍｂｅｒｓ ＰＰＯ Ａｖｅｒａｇｅ最小ＰＰＯ活性Ｍｉｎｉｍｕｍ ａｃｆｉｖｉｔｙ ｏｆａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆＰＰ０最大ＰＰ０活性Ｍａｘｉｍｕｍａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆＰＰＯ标准差Ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ变异系数Ｃｏｅｆｎｃｉｅｎｔ ｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ２．２ＰＰＯ活性的遗传分析 利用盖钧镒等【１１７１提出的植物数量性状单个分离世代群体遗传模型分析方法分别对该组合的Ｆ２群体、Ｆ２ ３家系群体ＰＰＯ活性进行遗传分析。通过极大似然法和 ＩＥＣＭ（Ｉｔｅｒｔａｔｅｄｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ）算法对混合分布中的有关成分分布参数做出估计，通过ＡＩＣ（Ａｋａｉｋｅ’ｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）值的判别和适合性检 验，选择一个最佳最适模型，通过该模型估计出主基因效应值、方差和主基因遗传率 等遗传参数。６。。一５００Ｕ７、４００君‰电茸占ｕ日。山杖蜒ｏｄ孰 ｉ＝２００《１００ ５０ １００ １５０ ２００ ２５０ ３００ ３５０ ４００惹嚼￡０Ｆ２归ＰＯ活性ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｙ图８ｏｆＦ２（ＡＬＹ（ｍｉｎ憎）Ｆ２单株和Ｆ２：３家系群体ＰＰＯ活性的相关分析ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｙＦｉｇ．８．Ｔｈｅ ｃｏｒｍｌａｔｌａｎ表４ｂｃ慨Ｆ２ ａｎｄＦ２：３ ｆａｍｉｌｙ ｇｒｏｕｐｓＦ２世代、Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性不同遗传模型的极大对数似然函数值和ＡＩＣ值ａｎｄＭａｘ－ｌｏｇ－ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｖａｌｕｅｏｆＦ２９ｒｏｕｐｓ ａｎｄ Ｆ２：３ｆａｍｉｌｙｕｎｄｅｒＴａｂｌｅ４．ＴｈｅＡｋａｉｋｅ’ｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｃｒｉｔｅｒｉｏｎｖａｌｕｅｓ：鲤！罂ｇ竺璺！！竺鲤！！！模型Ｍｏｄｅｌ 极大对数似然函数值Ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｖａｌｕｅＦ２ Ｆ２：３ＡＩＣ值ＡＩＣ ｖａｌｕｅＦ２Ｆ２３从表４可以看出，对于Ｆ２群体来说，Ａ―ｌ和Ａ一４模型的ＡＩＣ值最低，为可能最 佳模型，与之相近的还有Ａ一０、Ｂ一１、Ｂ?２等（见表４）。以Ａ－１、Ａ一４、Ａ一０、Ｂ一１、Ｂ一２ 模型对Ｆ２群体进行适合性测验表明（见表５），Ａ－０、Ａ．１和Ａ．４模型的５个参数中均 有一项差异显著。Ｂ．１和Ｂ．２模型各项参数均差异不显著。但是，Ｂ．１模型的各项测验概率均很小，而Ｂ．２模型的各项测验概率均较大，且无显著偏离。因此，Ｂ．２模型 不仅为最佳模型，而且为最适模型。对于Ｆ２ ３群体来说，Ｂ．２模型的ＡＩＣ值最小，从 适合性检验结果来看，Ｂ．２模型的各项测验参数差异均不显著，无显著偏离，且各项 测验的概率相对较大。所以Ｂ一２模型是最佳最适模型。因此，该组合ＰＰＯ活性遗传 符合两对主基因的加性一显性模型。 通过ＡＩＣ准则、模型适合性检验和群体的表现等方面，确定了控制该组台ＰＰＯ 活性的最佳最适遗传模型后，然后在最佳最适遗传模型下进行遗传参数的估计。遗传表５ Ｆ２群体、Ｆ２ ３家系群体遗传模型的适合性测验结果！ｉｂ！！ｊ：！罂量些量１２血置：！！墅畦基竺！！！！翌！璺！！！！翌１２罂！竺Ｅｉ翌ｉ １２ｉｊ！翌ｉ！Ｚ翌！登！模型ＭｏｄｅｌＵ１２Ｕ２２Ｕ３２ｎＷ２Ｄｒｔ参数包括一阶遗传参数和二阶遗传参数，一阶遗传参数可通过一阶分布参数ｆ成分分 布平均数）与一阶遗传参数的关系由最小二乘法进行估计，二阶遗传参数是通过分离 群体的表型方差由主基因方差组分、多基因方差组分和误差方差组分三种构成以进行 相应的估计。 最佳、最适模型Ｂ．２模型相应的全部分布参数估计值（见表６）。由分布参数通过 最小二乘法进一步估计得到遗传参数（见表７）。Ｆ２群体中，第一对主基因的加性效应（ｄ。）、显性效应（１ｌａ）、显性度（Ｖｄ。）分别为２３．２３ ＡＵ／（ｍｉｎ＋曲、一２３．２３ ＡＵ／（ｍｉｎ４９）、－１。第二对主基因分别为２２．７２ ＡＵ／（ｍｉｎ＊曲、一２２．７２ ＡＵ／（ｍｉｎ＊曲、一ｌ。可以看出，Ｆ２群体 控制ＰＰＯ活性的两对主基因均表现负向显性效应，且显性度均为．１，杂种优势均为 负优势。Ｆ２群体控制ＰＰＯ活性的主基因遗传率为７３．９２％，两对主基因的显性效应均 为负向效应。在Ｆ２：３家系群体中，第一对主基因的加性效应为５９．９８ ＡＵ／（ｍｉｎ＊ｇ），显 性效应为正向３．１７ＡＵ／（ｍｉｎ＊曲，显性度仅为Ｏ．０５３。但第二对主基因的加性效应只有３．４８ＡＵ／（ｍｉｎ＊曲，仅为第一对主基因加性效应的５．８０％左右，显性效应为负向２．０８ＡＵ／（ｍｉｎ＊ｇ），显性度为．０．５９８。Ｆ２ ３家系群体中两对主基因显性效应为一正一负，但 是正向效应不明显，总体表现为负向效应，杂种优势为负优势。Ｆ２ ３家系群体中两对主基因遗传率为８８．４４％。表６ Ｂ．２模型参数的极大似然估计值Ｔａｂｌｅ ６．Ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆＢ．２ ｍｏｄｅｌｍ№ № №№ｉｎ踮３们 ２％ ２蚪斛 ∞ 艘№ 即 № № ％２豫∞ 记”；笛 蚰饥 卯 巧 粥竹 ８凹坶Ｉ 盼 ＂６ Ｍ１７４．９４ ２０４１．４２１７１ ３７ １２５．９３２４５．０４ ２３９．４８１２５．９３ １０２５．１７表７扬麦１５８×淮麦１８组合ＰＰＯ活性的遗传参数估计Ｔａｂｌｅ７ Ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆｇｅｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＹａｎｇｍａｉｌ５８×Ｈｕａｉｍａｉｌ８１阶参数Ｉ Ｓｔｏｒｄｅｒｐａｒａｍｅｔｅｒ估计值Ｅｓｔｉｍａｔｅ Ｆ２Ｆ２：３２阶参数 ２＇％ｒｄｅｒｐａｒａｍｅｔｅｒ估计值ＥｓｔｉｍａｔｅＦ２ Ｆ２３注：ｄｍｈｍｌＩ―ｄ．分别为第一肘三Ｅ基凼田加性簸压、显性教应、显性厦ｔ“ｈｔｈｈ蝻分别为第二肘主基凼的棚性效厩、显性效厦、显性度。ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆｄｏｍｉｎａｎｔＮｏｔｅ：ｄｄ。ｌｌａ。ｈ枷ｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅａｄｄｉｔｉｖｅ ｅｆｌｈｅｔ，ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔｏｆｔｈｅｆｉｒｓｔｍａｊｏｒｇｅｎｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｄｈ ｈｂ。ｈ『ｂ／ｄｂｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ，ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄｔｈｃｄｅ．ｗｅ ｏｆｄｏｍｉｎａｍｏｆｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄｍ硒ｏｒｇｅｎｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．３讨论用全麦粉过滤法（以Ｌ．ＤＯＰＡ／ＭＯＰＳ为底物）测定小麦ＰＰＯ活性，受测定环境条 件的影响较大，尤其是测定环境的温度和反应的时间，所以测定过程中要尽量使环境 温度恒定，严格控制反应时间。Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性均值明显高于Ｆ２单株的均 值，这可能是由于测定环境温度的差异造成，如果环境温度相同的话，两代ＰＰＯ活 性均值差异可能会减小。Ｆ２单株和Ｆ２：３家系群体的ＰＰＯ活性相关系数可能会更大。 ＰＰＯ活性是一一个数量性状，同时受环境和基因型的影响。本研究用（扬麦１５８×淮麦 １８）分离早代（Ｆ２单株群体和Ｆ２：３家系群体）材料的分析表明，Ｆ２单株和Ｆ２ ３家系群体的 ＰＰＯ活性不仅在分布上十分相似，而且呈高度的相关，显示了较高的遗传效应，这 与葛秀秀等…８】的研究结果基本一致。因此，在品质遗传改良中，对ＰＰＯ活性实施早 代选择能够取得明显的效果。同时也可证实用全麦粉过滤法（以Ｌ．ＤＯＰＡ／ＭＯＰＳ为底物）可作为一种稳定测定小麦早代ＰＰＯ活性的可靠方法，以此法筛选利用低ＰＰＯ活性 的品种资源，将有利于改善小麦及面粉基食品的品质性状。 应用单个分离世代群体遗传模型分析方法对扬麦１５８×淮麦１８组合的Ｆ２群体、 Ｆ２：３家系群体ＰＰＯ活性遗传分析，结果初步表明该组合ＰＰＯ活性主要受两对主基因控制，并表现为加性一显性效应。由于Ｆ２群体和Ｆ２：３家系群体的主基因遗传率较高，可为重组育种提供遗传基础。在育种的早期阶段可进行严格的选择，淘汰ＰＰＯ活性 高的单株或家系，对于选育出ＰＰＯ活性低的小麦品种是非常有利的。由于试验材料 不同，分析使用的模型方法不同，以及环境误差的存在，与葛秀秀［ｉ０６］等研究所得的 遗传效应有一定差异，但研究结果基本相似。Ｆ２：３家系群体中，两对主基因间的基因效应差异较大。Ｊｉｍｅｎｅｚｆｌ”］等的分子标记研究结果也表明，两个标记位点分别决定ＰＰＯ活性总变异的６０．７％和１６．８％，两个基因位点控制表达的ＰＰＯ活性是不相等的。 由于单个分离世代群体遗传模型分析无误差估计，不能明确是否存在多基因效应 “１。”，况且一个基因位点是否表现为主基因还与受环境的影响［１１９１。因此，如能同时 考虑亲本和Ｆｌ世代，或采用多个世代的联合分析方法，不仅可对主基因之外的变异 作进一步的分解，进而对多基因的存在进行鉴定。此外，多基因的存在对一些作物的 抗性方面具有重要的意义。利用多个世代的联合分析还可以使估计的各种遗传参数更 为准确。一个基因位点是主效基因还是微效多基因是相对于它的表现型大小而言的， 主基因可产生大的表型效应，但是一个基因位点是否表现为主基因效应还与环境的互 作有关。 随着分子标记技术的发展，科学家们已将众多的数量性状基因定位在遗传连锁图 上。从而研究数量性状的遗传规律，找到主效基因及与之紧密连锁的分子标记是我们 研究的主要目标，如果我们能够找到同ＰＰＯ活性有关的主效基因的分子标记，对于 降低ＰＰＯ活性将是很有帮助的。目前主要利用生化方法测定籽粒ＰＰＯ活性，对育种 材料和后代进行选择，仅是对表型的选择，可靠性较差。利用与小麦籽粒ＰＰＯ活性 紧密连锁的分子标记对其进行基因型选择，可以提高选择的可靠性和选择效率。国内外目前已开展针对小麦多酚氧化酶基因及其分子标记的研究。多酚氧化酶基因已经在包括甘蔗在内的许多种植物中被克隆和测序［１２３］。迄今为止还没有得到小麦的多酚氧 化酶基因序列，但是根据已报道的同工酶数可以肯定地推测：大多数六倍体小麦中控 制多酚氧化酶活性的基因在两个以上。Ｕｄａｌｌ［１２４Ｊ报道了一个多酚氧化酶的ＱＴＬ标记 Ｘｃｄ０３７３位于第二组染色体上，它可以解释多酚氧化酶变异的大部分。Ｊｉｍｅｎｚ［ｍ５】等 也认为多酚氧化酶基因主要位于第二组染色体上，Ａｎｄｅｒｓｏｎ［１０２１等进一步证实了小麦种子的多酚氧化酶活性基因位于２Ｄ染色体上。Ｊｉｍｅｎｚ［加５埽口灿ｄｅｒｓｏｎ［１０２１等通过对代换系ＰＰＯ活性的测定，推测控Ｎ４，麦ＰＰＯ的主效基因为ｌ～２个，同时指出针对ＰＰＯ的底物专化性存在多个等位基因。Ｕｄａｌｔ［１２５１和Ｄｅｍｅｋｅ［１０１］等利用ＲＦＬＰ标记分别研究 了４个重组近交系群体，Ｍａｒｅｓ【１２６】等利用ＡＦＬＰ标记分析了一个ＤＨ群体，发现控制 ＰＰＯ活性的主效基因位于第二同源群染色体上，但其他染色体如３Ｂ、３Ｄ、６Ｂ上亦 存在一些微效基因。葛秀秀［１０６】等应用主基因＋多基因混合遗传模型分析方法对中优 ９５０７×ＣＡ９６３２组合的ＤＨ群体ＰＰＯ活性遗传分析结果表明，ＰＰＯ活性主要是由２ 对独立主基因控制遗传的。２对主基因间的基因效应差异较大，第２对主基因的加性 效应值只相当于第１对主基因加性效应值的４４．６０％。现已开发出多种基于ＰＣＲ的 ＰＰＯ分子标记，但是综合利用这些标记开展低ＰＰＯ分子标记辅助选择育种研究的还 比较少。因此，了解现有的分子标记与多酚氧化酶活性的关系，明确使用分子标记开 展多酚氧化酶活性分子标记辅助育种的可能性，研究数量性状的多标记综合辅助效 果，这些研究都将有待于进一步开展。最终筛选稳定可靠的低多酚氧化酶活性的小麦 品种资源，对我国小麦的品质改良具有极其重要的理论意义和应用价值。结论本文通过对三种小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较研究、扬麦１５８×淮麦１８ 组合早代ＰＰＯ活性变异及其遗传分析，主要可得出以下几点结论：１．全麦粉过滤法是一种高效、经济、快速、稳定测定ＰＰＯ活性的好方法。２．ＰＰＯ活性是一个数量性状，同时受环境和基因型的影响。本研究对ｆ扬麦１５８×淮 麦１ ８）分离早代（Ｆ２群体和Ｆ２：３家系群体）材料的ＰＰＯ活性分析表明，Ｆ２单株和Ｆ２：３家 系群体的ＰＰＯ活性不仅在分布上十分相似，而且呈高度的相关，显示了较高的遗传 效应，因此，在品质遗传改良中，对ＰＰＯ活性实施早代选择能够取得明显的效果。３．应用单个分离世代群体遗传模型分析方法对杂交组合扬麦１５８×淮麦１８的Ｆ２群 体、Ｆ２：３家系群体ＰＰＯ活性进行遗传分析，结果初步表明该组合ＰＰＯ活性主要受两 对主基因控制，并表现为加性．显性效应。４．扬麦１５８×淮麦１８组合ＰＰＯ活性的遗传参数估计表明，Ｆ２群体控制ＰＰＯ活性的 主基因遗传率为７３．９２％，两对主基因的显性效应均为负向效应。Ｆ２ ３家系群体中两对 主基因显性效应为一正一负，但是正向效应不明显，Ｆ２：３家系群体中两对主基因遗传 率为８８．４４％。参考文献［１］徐兆飞，张惠叶，张定一．小麦品质及其改良［Ｍ］．北京：气象出版社，１９９９． ［２］金善宝．中国小麦学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９６ ［３］Ｂｕｓｈｋ ｗ Ｗｈｅａｔｂｒｅｅｄｉｎｇ ｆｏｒ ｅｎｄ－ｐｒｏｄｕｃｔｕｓｅ【Ａ】．Ｗｈｅａｔ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓｏｆ ＧｌｏｂａｌＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ［Ｍ］．ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，