什么是附加体 2µpet28a质粒图谱

T4连接后对其质粒PCR条带不亮,为什么?酶切没有条带,是否连接上?_百度知道
T4连接后对其质粒PCR条带不亮,为什么?酶切没有条带,是否连接上?
T载体连接后提取的质粒送去测序后来比对的结果是正确的,然后我就用这个质粒进行PCR得到目的片段,然后就把PCR后的目的条带回收和121载体一切进行酶切,酶切后的条带也正常,切出单一条带,就把目的条带又进行回收,121载体切下的是35s启动子也回收了,然后用此回收产物用T4连接酶22℃过夜连接,大肠杆菌转化,涂板,第二天长出多个单菌落,大概有二十个左右吧。挑但菌落小提质粒,然后用这质粒进行PCR验证,这时我的目的条带位置正确,但是条带不亮,很浅,不够回收测序,测序时出现信号弱停止试验。我已反复连接好几次,前面现象都正常,但是只要到T4连接后取其质粒进行PCR验证时就是条带不亮。不知道为什么。又对其质粒进行了酶切,但是也没切出来,什么条带也没有。这是什么原因啊?这个载体连接成功了吗?今天我对提的T4连接后的质粒进行PCR了,但是突然什么也P不出来了,这是为什么啊?我前两天还能P出来,就是不亮,这次是P不出条带了,这次我把模板加大了,原来吗0.8µL,这次我加到了2µL.
很显然你的质粒没有构建成功。感觉是连接出了问题,pBI121载体很大,回收比较困难,建议你测一下回收后的浓度。如果太低的话,建议加大酶切量。121载体至少应该达到50-100ng,然后再按1:3-10摩尔比加入小片段. 至于PCR验证出现假阳性,太正常了。还是酶切比较靠谱。
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请问用的酶切位点是什么?可以考虑看看121载体上这两个酶切位点是否靠在一起,而导致双酶切效率降低~其次,如果你要测序,没必要再切下来回收拿去测序,你可以直接送质粒去测序,如果没有通用引物,可以再载体设计一段测序引物以便测到你的目的片段。最后想说的是,如果质粒进行PCR,模板不能加多了,你可以看看你0.8ul的时候,跑胶时能不能看到质粒模板的带,建议降低模板量,而不是增加(前提是提出的质粒浓度正常)。一般PCR时,质粒模板1ng-10ng就足够了~
应该是没转化成功,大肠杆菌空繁了,尝试一下增加提高回收产物和T4连接酶的量。
PCR的结果很容易出现假阳性,以酶切为准, 酶切时最好有阳性对照,证明酶是工作的. 连接时,一般载体为20-50ng/20ul反应体系。 插入片段对载体的摩尔比一般为10:1。此外连接时要做自联反应,判断载体的酶切效果。 温度推荐16度过夜, 特异性比22度要好很多。
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微生物复习题 一、名词解释 1.质粒、附加体、粘粒2.有性孢子、无性孢子
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内容提示:何谓微生物生态学?简述微生物生态系的结构和功能。
A.池塘水B.海洋中部C. 大湖中心D.地下水 197纤维分解菌与自生固氮菌之间,由于前者为后者提供碳源,
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