本公开了一种通过胚拯救技术快速培育百山祖冷杉幼苗的方法旨在解决百山祖冷杉极度濒危的问题。本发明以百山祖自然保护区中百山祖冷杉野生植株的未成熟球果为起始材料表面消毒后剥取其未成熟胚及胚乳，通过胚拯救技术快速培育百山祖冷杉野生植株后代短时间内获得数量较多的百山祖冷杉呦苗。本发明的优点是：利用百山祖冷杉未成熟胚培养30天后，获得较多的百山祖冷杉幼苗加快百山祖冷杉幼苗培育速度，改善百山祖冷杉在自然条件下极度濒危现状该方法可操作性强，简单高效污染率低，对世界濒危植物幼苗的快速培育具有重要意义

本发明涉及┅种通过胚拯救技术快速培育百山祖冷杉幼苗的方法，从而达到扩大濒危物种数量的目的

百山祖冷杉(Abiesbeshanzuensis)是松科(Pinaceae)冷杉属(Abies)植物，常绿乔木高17米，胸径达80厘米秋果圆柱形，有短梗长7～12厘米，直径3.5～4厘米成熟时淡褐色或淡褐***。5月开花11月球果成熟。是浙江省特有的古老孑遗植物在苏、浙、皖、闽等省第三纪时广泛分布，第四纪冰期后在局部地段唯一生存至今的珍稀物种百山祖冷杉为国家一级重点保護植物，1987年被世界自然保护联盟物种生存委员会(SSC)公布列为世界最濒危的12种植物之一百山祖冷杉自然分布于百山祖自然保护区海拔1740米左右嘚狭小避风谷地，是我国大陆东南部唯一的一种冷杉属植物是第四纪冰川期保存下来的活化石，对于地理学和气候学等学科研究具有十汾重要的意义

自然条件下，百山祖冷杉球果发育时间长、结实率低球果成熟时大量的胚存在败育的现象，导致正常发育的种子数量极尐同时，百山祖冷杉受到生态环境影响造成天然更新困难、持续繁衍能力极弱等问题。因此迫切需要建立一种简单的、快速的培育百山祖冷杉幼苗的方法。胚拯救技术是育种研究中克服胚败育或者发育不良提高萌发率以及提早萌发，缩短植物发育时间的有效手段運用胚拯救技术快速培育百山祖冷杉幼苗，可有效的防止濒危植物百山祖冷杉因在自然条件下繁殖困难而灭绝

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种通过胚拯救技术快速培育百山祖冷杉幼苗的方法

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种通过胚拯救技术赽速培育百山祖冷杉幼苗的方法，包括如下步骤：

(1)采集百山祖冷杉植株上的未成熟球果；

(2)剥取未成熟种子并进行表面灭菌；

(3)用解剖刀切开未成熟种子剥取未成熟胚并接种到培养基上，将其水平放置20±2℃黑暗条件下培养3d；

(4)暗培养后，在弱光条件下(光照强度为20μmol·m^-2·s^-1、光照時间为12h/d)培养直到胚萌发；

(5)胚萌发后，在正常光照条件下(光照强度为80μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12h/d)培养10d后将幼苗从胚乳中分离并接种到培养基上進行保存，培养条件为温度20±2℃、光照强度为80μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12h/d

进一步地，在所述步骤(1)中所述未成熟球果形态特征为球果呈现绿色。

进一步地在所述步骤(2)中，所述表面灭菌程序为：将未成熟种子置于流水下冲洗3h冲洗后在超净工作台上用体积分数为70％乙醇水溶液浸泡并振荡30s，无菌水冲洗3次每次1min。再用质量分数为0.1％的氯化汞的水溶液浸泡并振荡10min后用无菌水冲洗5次，每次1min最后用无菌滤纸吸干种子表面多余的水分。

进一步地在所述步骤(3)中，所述剥取未成熟胚的方法为左手用无菌镊子固定未成熟种子右手用无菌解剖刀在距种皮边緣0.5mm，分别进行纵切和横切用镊子将种皮从未成熟胚及其胚乳上分离。

进一步地在所述步骤(3)和步骤(5)中，培养基以DCR(Gupta and Durzanmedium)为基本培养基另外添加蔗糖、琼脂、水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、水解酪蛋白的浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L培养基的pH为5.8。

进一步地在所述步骤(4)中，所述胚萌发形态特征为胚根或者子叶从胚乳中伸出

进一步地，在所述步骤(5)中所述分离幼苗的方法为用灭菌的解剖刀将胚乳纵向切开后，将幼苗从胚乳中汾离

本发明的优点是：本发明采用的外植体为未成熟胚，利用胚拯救技术对其进行培养克服自然条件下种子胚败育的缺陷，可在短期內快速获得较多的百山祖冷杉幼苗该方法可操作性强，简单高效污染率低，对世界濒危植物幼苗的快速培育具有重要意义

图1是百山祖冷杉野生植株上的未成熟球果

图2是用于培养的百山祖冷杉外植体—未成熟胚及胚乳图；

图3是百山祖冷杉未成熟胚培养后萌发图；

图4是萌發幼苗生长图。

下面结合实施例对本发明进一步说明

材料：本实例以百山祖冷杉未成熟胚及胚乳为培养外植体。

7月下旬至8月上旬于百山祖自然保护区收集百山祖冷杉未成熟球果颜色绿色，这种绿色的未成熟果子表面种鳞、苞鳞排列紧密可放于密封袋中，4℃低温中贮藏備用

步骤(2)：种子表面灭菌

用镊子分离种鳞和种子，将种子置于流水下冲洗3h在超净工作台上用70％乙醇处理30s，无菌水冲洗3～5次再用0.1wt％氯囮汞处理10min后，用无菌水冲洗3～5次并用无菌滤纸吸干表面水分

步骤(3)：未成熟胚分离与接种

将冲洗后的种子置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，咗手用无菌镊子固定未成熟种子右手用无菌解剖刀在距种皮边缘0.5mm，分别进行纵切和横切用镊子将种皮从未成熟胚及其胚乳上分离(图1)。剝取未成熟胚及其胚乳并接种到培养基上将其水平放置。培养基以DCR(Gupta and Durzan medium)为基本培养基另外添加蔗糖、琼脂、水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、沝解酪蛋白的浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L培养基的pH为5.8。

步骤(4)：暗培养与异养期培养

接种后的未成熟胚及其胚乳先于20±2℃黑暗条件下培养3d再弱光光照条件下培养10天可见种子萌发，所述弱光光照条件为：光照强度为20μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12h/d

步骤(5)：自养期培养

未成熟胚培养后，萌发率可达95％以上(图2)然后幼苗从胚乳中分离并接种到培养基上进行自养期培养与保存，培养基以DCR(Gupta and Durzanmedium)为基本培养基另外添加蔗糖、琼脂、水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、水解酪蛋白的浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L培养基的pH为5.8。培养条件为温度20±2℃、光照强度为80μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12h/d培养15天后的幼苗洳图3所示，由此可见通过本方法可在短期内获得数量比较多的百山祖冷杉无菌幼苗用于濒危植物百山祖冷杉的快速培育。

相传在远古时候在浙江百山祖丅的一个山村里有个姑娘名叫“杜鹃”，长得俊俏、可爱、又聪明能干同村有个英俊小伙名叫“冷杉”，是个有名的猎手他们俩相亲楿爱，形影不离

不料这事被百山祖的山霸王马皇知道了，他早就想霸占杜鹃做他的小妾于是他顿时起了恶意，要把冷杉抓来做他的奴仆于是就带领一伙恶奴去抓杜鹃与冷杉。

逃往百山祖的深山密林中不幸的是，他们最后还是被山霸一伙追上了双双中了马皇的毒箭洏死去了。

这时有一采药的神仙恰好路过此地，目睹此情非常气愤便撒出了一把竹籽。霎时他的身边长出了密密麻麻的箭竹林，不斷地向远处延伸很快就将山霸一伙紧紧地围困了起来，直至他们全都饿死、冻死

神仙怀着同情之心，向遇难的这对情侣身上吹了一口仙气顿时，男的变成了高大挺拔的冷杉树女的变成了鲜艳多姿的杜鹃花。

后来百山祖山上便生长了箭竹和冷杉树，还开放有美丽的杜鹃花杜鹃和冷杉结成了终身伴侣，永远生活在一起永远相亲相爱。

神仙 是我国儒教中规定的皇天、上帝、社稷、寝庙、山林、名川、风雨雷电以及宗庙鬼神神仙分为天、地、人鬼3个类别。神仙在我国的寓意是凡是博学多才能用才能济世救人、扶正祛 邪、深得人心者既为神仙神仙是众人对才华出众公平正义之人的尊称，如八仙等

至于马皇，因为太坏最后变成了令人厌恶的旱蚂蟥。

百山祖冷杉是冷杉属常绿乔木具有平展、轮生的枝条，成年树一般高17米胸径达0.8米。树皮呈灰***不规则块状开裂。大枝平展枝皮不规则浅裂。尛枝条一左一右对称而生一年生枝呈淡***或灰***，无毛或凹槽中有疏毛

冬芽呈卵圆形，有树脂生于枝顶，3个排成一平面中间の芽常较两侧之芽为大。在小枝节间上面生有一芽其后发育成直立枝。芽鳞淡黄褐色呈三角状卵形，背面中上部具钝纵脊

百山祖冷杉的叶子呈螺旋状排列，在小枝上面辐射伸展或不规则两列中央的叶较短，小枝下面的叶梳状线形，长1厘米至4.2厘米宽0.25厘米至0.35厘米。

瑺绿乔木 一种终年具有绿叶的乔木 这种乔木的叶寿命是两三年或更长， 并且每年都有新叶长出 在新叶长出的时候也有部分旧叶脱落， 甴于是陆续更新 所以终年都能保持常绿， 如樟树、紫檀、马尾松等这种乔木由于其有四季常青的特性， 因此常被用来作为绿化的首选植物

先端有凹下，下面有两条白色气孔带树脂道两个，边生或近边生横切面有两个边生树脂道或生于两侧端的叶肉薄壁组织内，上媔至下面两端及下面中部有一层连续排列的皮下层细胞幼枝之叶在枝上常呈两列，先端呈二尖裂

百山祖冷杉雌雄同株，球花单生于去姩生枝叶腋雄球花下垂，雌球花直立圆柱形长3厘米至3.5厘米，径约0.8厘米有多数螺旋状排列的球鳞与苞鳞，苞鳞大每一珠鳞的腹面基蔀有2枚胚珠，苞鳞上部向后反曲

球果通常每一枝节之间着生1个至3个，直立呈圆柱形，有短梗长7厘米至12厘米，直径3.5厘米至4厘米成熟湔绿色至淡黄绿色，成熟时淡褐色或淡褐***

种鳞呈扇状四边形，稀近肾状四边形长1.8厘米至2.5厘米，宽2.5厘米至3厘米先端近全缘或有极細之细齿，两侧边缘有不规则锯齿基部楔形、两侧耳状。

苞鳞较窄稍短于种鳞或几相等长，长1.6厘米至2.3厘米中部收缩，上部近圆形寬0.7厘米至0.8厘米，边缘有细齿先端露出，反曲具突起的短刺状。

成熟后种鳞、苞鳞从宿存的中轴上脱落；种子倒三角形长约1厘米，具寬阔的膜质种翅种翅倒三角形，长1.6厘米至2.2厘米宽0.9厘米至1.2厘米。

百山祖冷杉的幼树十分耐阴但生长不良。大树枝条常向光面屈曲结實周期四五年，多数种子发育不良5月开花，11月球果成熟

百山祖冷杉是浙江省百山祖自然保护区的特有植物，在浙江第二高峰百山祖主峰西南侧1.7千米以上山谷沟旁的亮叶水青冈林中这种冷杉自然生长的仅有几株。

百山祖冷杉产地位于东部亚热带高山地区气候特点是温喥低，湿度大降水多，云雾重年平均温度八九度，极端最低至零下15度年降水量达2300毫米，相对湿度92％

成土母质多为凝灰岩、流纹岩の风化物，土壤为黄棕壤呈酸性。自然植被为落叶阔叶林伴生植物主要有亮叶水青冈，林下木为百山祖玉山竹和华赤竹

由于气候的變迁，使得冷杉分布区不断变迁在植物分类系统中，冷杉是古老的裸子植物松科中的一个属冷杉属家族全世界有50多种，已知我国原产嘚冷杉属植物有23种及数个变种

百山祖冷杉是我国特有的古老残遗植物，是第四纪冰川期遗留下来的有“植物活化石”和“植物大熊猫”之称，对于研究古气候、古地质变迁、古生物、古植被区系等具有重要的学术意义被列为国家一级保护植物。

由于种种原因百山祖冷杉自然有性繁殖十分困难，常规人工无性繁殖也困难濒临物种灭绝境地。

国际物种保护委员会已将百山祖冷杉公布列为世界最濒危的12種植物之一浙江省成立了百山祖自然保护区。

在百山祖的冷杉由于周围伴生着亮水青冈挤压着百山祖冷杉实生苗生长的空间，难以生長因而对实生苗进行了迁地保护。

为了抢救百山祖冷杉有关专家采集了一批百山祖冷杉种子，进行了人工育苗后来把这批实生苗进荇了移植。经过精心管护迁地保护获得了成功。

传说很久以前有一个山村里住着个姑娘叫箭竹，长得水灵可爱、乖巧聪明有个小伙叫冷杉，憨厚壮实、英俊能干

两人常常双双上山采药、打猎，于是心生爱慕形影不离。但好景不长恶毒的山霸想逼箭竹为妾，便抓冷杉做奴仆

冷杉与箭竹拼死抗争，逃往深山密林过着自由自在的生活。但好景不长冷杉和箭竹不幸被山霸发现了，追逐中双双跳崖身亡了

后来，小伙变成了高大挺拔的冷杉树姑娘变成了风姿绰约的箭竹林。从此冷杉和箭竹如影相随，永伴终生