在高通量基因编辑平台、sgRNA库 (CRISPR Screen) 日益兴起的今天，基因编辑的应用越来越广泛，基因功能的研究也更加精准快捷。而如何做到快速检测大量编辑样本靶标位点，则成为基因编辑研究的重点难点。常规的靶标位点检测使用 Sanger 测序，通过计算峰图来获取编辑位点，费时费力且成本高。那有没有什么办法能更简便的获得编辑位点情况呢？当当当当，Hi-TOM 新技术闪亮登场！ 尤其适合多倍体物种的编辑检测，老板再也不用担心我的编辑靶位点检测啦！

Hi-TOM新技术简介

Hi-TOM 新技术是一款基因编辑位点检测试剂盒，结合 PCR 和二代测序技术，快速直接的让研究者获得编辑位点的数据情况，不需要再依次比对峰图，可一次性获得所有样本的编辑位点情况。

试剂盒的主要组成成分有以下三种：

客户根据自身的实验设计，按照 Hi-TOM 要求设计引物，进行两轮 PCR 反应，将所有扩增产物混合进行高通量测序，之后在网站上输入得到的数据即可方便快捷地获得分析结果。一个试剂盒96 Kit，可完成96个 PCR，即使用一个试剂盒一次性可获得96个样本的编辑位点信息 (相当于送96次 PCR 产物测序)，是大样本编辑位点检测的上上之选。

Hi-TOM 引物设计不同于普通 PCR 引物，需要在正向特异引物 Primer F 5’端加正向搭桥序列 5’-gg……gc-3’；在反向特异引物 Primer R 5’ 端加反向搭桥序列 5’-ga……gg-3’ (搭桥序列详细信息可见于试剂盒说明书)。

2. 第一轮 PCR 反应扩增目的片段

客户获得引物后，进行第一轮 PCR，所使用的试剂为 Hi-TOM 试剂盒中自带 2x Taq MasterMix，扩增目的片段。

3. 使用 Hi-TOM Mix 进行第二轮 PCR 反应

将第一轮扩增产物作为模板，加入含有 Hi-TOM Mix 的96孔板中，进行第二轮 PCR，添加接头序列和 barcode，获得 PCR 产物文库；PCR 结束后取 5L 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。第二轮 PCR 产物理论值比第一轮 PCR 产物长100 bp左右。将扩增完毕的第二轮 PCR 产物混合后切胶纯化，送高通量测序。不同靶位点样品可以混在一起送样。每次实验结束及时记录 Hi-TOM 样品信息单，以免遗忘。

图1 Hi-TOM基因编辑位点检测试剂盒原理示意图

获得测序结果后，将数据直接上传 Hi-TOM 在线软件，即可自动给出测序结果，可清晰明了地展示出编辑位点突变情况，省去了 Sanger 测序每个样本计算峰面积的时间和精力，让研究更为高效。

图2 测序数据上传网站示意图

Hi - TOM 结果展示

表2 高通量测序结果分析展示图

输出的结果能自动对两端的 read 进行识别，当只有一端有突变差异时，则只输出有差异这一端的信息，当在两端 read 上都存在突变差异时，则结果输出左右两端的突变信息。建议 ratio≥10%，Reads≥100 的数据可信。对于二倍体生物，如果有多于 2 条的可信数据，可能是嵌合体。

Variation_type 栏中，数字代表突变碱基个数，字母代表突变类型，例如 1D 表示 1 个碱基缺失，1I 表示 1 个碱基插入。1S 表示 1 个 SNP 替换，Variation 栏中展示 Variation_type 栏中缺失或插入的碱基序列。Reads_seq 栏中用小写字母标识的后一个字母即为突变位置的开始位置。

相比于一代测序，结果是不是加清晰明了呢？不再为上百个 Sanger 峰图查看而烦恼，轻轻松松获取每个样本的基因编辑信息！心动的你一定已经在盘算要试一试了吧，赶快联系我们吧~ (诺禾致源Novogene当地销售）

分子基因编辑业务线 赵 桐丨文案