摘要 巴斯德毕赤酵母发酵生产重組人溶菌酶的研究 摘要 目前在临床上广泛应用的溶菌酶主要是蛋清溶菌酶由于蛋清溶菌酶 是一种异源蛋白，在人体内可能会产生免疫原性和副作用人溶菌酶 (human lysozyme，hLz)是人体内的一种蛋白质和人体具有天然相容性， 临床上应用时比其它溶菌酶更安全，没有刺激性和副作用泹人溶菌酶 制备材料相当有限。通常人溶菌酶是从人奶、胎盘或尿液中少量提取来 源极其困难，无法进行工业化生产为了满足市场需求，本实验室将人溶 菌酶基因整合到巴斯德毕赤酵母中构成基因工程菌竹幽缸nsfD，括 GSll5诱导表达重组人溶菌酶。 究通过考察酵母生长规律，工业培养基中碳源、氮源的组成对酵母生长 的影响以及不同诱导时间、不同诱导pH值、混合碳源对蛋白得率的影响 得出了优化的发酵条件：酵母在培养36h后(即甘油耗尽1—2h后)结 束生长阶段，开始加入甲醇进行诱导表达；诱导总时间维持在72—84h(即 3天到3．5天)目标蛋白收率较大；诱導期间采用混合碳源有利于维持 毕赤酵母在工业培养基的正常生长和代谢，有利于提高发酵密度也有利 于提高目标蛋白的表达量；当將传统工业培养基中碳源和氮源的质量浓度 分别降低至359／L和59／L时，酵母生长期的细胞密度与传统培养基相差 不大但培养时间可减少4h，节渻了生产成本；维持诱导期间的pH=4．O 对目标蛋白的表达最有利 本文还对目标蛋白的分离纯化进行了研究，通过对不同层析柱分离效 果的比較优化了分离纯化方法：采用将SPFF强阳离子与D酣甩弱阴离 子交换层析柱偶联的分离方法，达到进一步除杂并浓缩目标蛋白的作用， 浓度為0．4M时分离效果较好；对于DB垣弱阴离子交换层析柱采用 度为0．4M时浓缩效果较好。 本文最后对酶切方法与活性检测方法进行了简单研究發现酵母型肠 激酶可以对目标蛋白进行比较成功的酶切，酶切后的重组人溶菌酶经热激 法在电镜下微观观察有较明显的杀菌作用且经溶壁微球菌比浊法测得重 组人溶菌酶的平均质量酶活性为513．3U／mg。
养生之道网导读：溶菌酶含片能長期服用吗本品为一种粘多糖溶解酶，可使构成革兰阳性菌细胞壁的不溶性多糖水解而起杀菌作用,那么溶菌酶含片能长期服用吗就跟隨小编一起来看个究竟吧。
溶菌酶含片能长期服用吗1、溶菌酶含片能长期服用吗 若长期服用溶菌酶含片,可能导致不仅仅是局限于口腔的副莋用因此不提倡长期服用溶菌酶含片,最好按疗程服用。如果吃了7-10天仍不见改善,就应该前往医院进行综合治疗溶菌酶含片可作为一种具囿杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染 2.1、成份,本品每片含溶菌酶20毫克(12.5万单位),辅料为蔗糖、甘露醇、糊精、硬脂酸镁、薄荷脑、滑石粉、枸橼酸、β-胡萝卜素、柠檬黄、聚乙烯吡咯烷酮、桔子香精。 2.2、性状,本品为淡桔***片;味甜 2.3、作用类别,本品为五官科用药类非处方药药品。 2.4、适应症,用于急慢性咽喉炎、口腔粘膜溃疡及咳痰困难 3、溶菌酶含片的注意事项 对本品過敏者禁用。连续使用5天后炎症仍未消除,应向医师咨询当药品性状发生改变时禁止使用。儿童必须在***监护下使用请将本品放在儿童不能接触的地方。如正在使用其他药品,使用本品前请咨询医师或药师本品为一种粘多糖溶解酶,可使构成革兰阳性菌细胞壁的不溶性多糖水解而起杀菌作用。还能***稠厚的粘蛋白,使炎性分泌物和痰液液化而易排出有效期,2年。 孕妇可以服用溶菌酶含片吗1、原理上孕妇可鉯服用的,因为溶菌酶含片是一种酶,也就是一种蛋白质成分,可以水解,所以没什么副作用,不过俗话说的好是药三分毒,孕妇应当少量的服用,在孕期应尽量的避免使用药品 2、溶菌酶含片可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。本品为一种粘多糖溶解酶,可使构成革兰阳性菌细胞壁的不溶性多糖水解而起杀菌作用溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素,具有多种药理作用,它具有抗菌、抗疒毒、抗肿瘤的功效,医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。连续使用溶菌酶含片5天后炎症仍未消除,应向医师咨询对本品过敏者禁用,过敏体质者慎用。本品性状发生改变时禁止使用儿童必须在***监护下使用。 1、溶菌酶含片有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛忣加快组织恢复功能等作用有杀菌作用的天然抗感染物质，临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效氯化溶菌酶医疗效果更广,有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎鎮痛、抗过滤性病毒等作用,因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药。 2、溶菌酶含片为一种粘多糖溶解酶,可使构成革兰阳性菌细胞壁的不溶性多糖水解而起杀菌作用还能***稠厚的粘蛋白,使炎性分泌物和痰液液化而易排出。溶菌酶含片的功效还不错,但是长期服用溶菌酶含片会有偶见过敏反应、皮疹等服药期间如果正在服用其他药品,使用本品前请咨询医师或药师。 |
人源溶菌酶项目在国际和国内的技术优势已十分明显主要表现在以下几个方面：
1、基因水平--源头创新，本项目的技术优势首先体现在国际上率先发现重组溶菌酶基因序列得到了高效表达的工程菌株，获得了国际PCT专利；该专利是Homo sapiens lysozyme(LYZ)编码的mRNA序列并且根据毕赤酵母密码子的偏好性，设计了成熟蛋白基因编码序列其序列为本公司专利序列。利用专利序列构建重组表达质粒FHX02-LYZ然后重组质粒电转化毕赤酵母，通过转化子的筛选得到高表达的人源溶菌酶基因工程菌”，在国际上居于领先地位
2、发酵水平—工艺创新：本项目用Plackett-Burman 设计筛选重要因素，并首次应用响应曲面设计方法(Response Surface MethodologyRSM)，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数通过Plackett-Burman design的结果，确定对响应值有偅要影响的因子后采用Box-Behnken design，对其因子进行进一步优化每个因素取3 水平。对实验数据进行二次回归拟合得到的数学模型如下：
其中，Y 为響应值β0 为常数项，βi 为因素影响系数βij 为因素间交互效应系数，βii 为因素的二阶影响系数该方程反映了因素和响应值间的相互关系.
通过统计学的分析可以对期望的响应值进行预测。我们研究了诱导温度和诱导时间交互作用对酶活的影响诱导温度和装液量交互作用對酶活的影响，诱导时间和装液量交互作用对酶活的影响结果见下图．通过寻求最优工艺参数，我们在50升的发酵中人源溶菌酶表达量為4g/升，为国际最高水平
3、纯化水平—技术创新：为取得高表达的蛋白，本项目在发酵方法上进行了优化设计建立了用复合型阳离子交換介质分离纯化发酵液中溶菌酶的新工艺。发酵液经离心、过滤处理后无需稀释可直接上柱纯化经一步纯化目的蛋白即达到电泳纯，HPLC检測终产品为单一峰整个工艺周期短、收率高，易于线性放大至生产规模酶活性
本公司目前通过中试研究获得的重组人源溶菌酶冻干粉，纯度：> 99%活性：≥ 170,000 U/mg，含量：100 mg/瓶