请结合实际谈一谈为什么说PCR技术是一项伟大的科学发明?

北京诺禾致源科技股份有限公司

Novogene Co., Ltd.(北京市昌平区回龙观镇生命园路29号创新大厦B258室)首次公开发行股票并在科创板上市

广东省深圳市福田区中心三路8号卓越时代广场(二期)北座

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1、PCR技术详解,一,二,三,四,五,PCR简史,定义,基本原理,反应要素,PCR的类型,六,PCR反应流程,目录,八,常见问题分析,九,PCR技术应用领域,七,PCR产物检测,一、PCR简史,1971年,Khorana提出:经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难,以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能,所以,Khorana的设想被人们遗忘了,1985年,美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(PCR) 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,

2、费力,且易出错,未能推广 1988年,Saiki等人从嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提出TaqDNA聚合酶,使得PCR技术得以广泛应用 1993年,Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,二、定义 PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外高温(95左右)时变性成单链,低温退火(经常是60左右)时引物与单链按碱基互补配对原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(53)的方向延伸合成互补链,三、基本原理 PCR技术模拟DNA 的天然复制过程, 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物, 该原理主要包括3个基本反应过程:模板变性引

3、物退火新链延伸,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,理想拷贝数=2n n:循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X:平均效率,约为0.85 n:循环次数,四、反应要素,热稳定DNA聚合酶 引物 模板 dNTP 二价阳离子 维持pH的缓冲液,热稳定DNA聚合酶,目前有两种Taq DNA 聚合酶供应: 天然酶:从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶:大肠杆菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100l时); 浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。,2. 引

4、物 引物是PCR特异性反应的关键, PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度;引物浓度一般为0.1-0.5 mol/L,浓度过低影响产量,偏高引起错配和非特异性产物增加,且可增加引物二聚体的产生几率,引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右; 引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb; 引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列;,引物设计原则:,避免引物内部出现二级结构:避免两条引物间互补,特别是3端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非

5、特异的扩增条带; 引物3端的碱基应严格要求配对:特别是最末及倒数第二个碱基,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败; 引物的熔解温度(Tm值),指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。DNA中GC含量越高,Tm值越高,引物对之间的Tm值相差不超过23,经验公式Tm=2(A+T)+4(G+C),引物的退火温度通常低于Tm值510; 引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性; 引物量:每条引物的浓度0.1 0.5M,以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会,3. 模板,模板即DNA片段

6、, 其量的多少及其纯度的高低, 是PCR成败与否的关键环节之一 单、双链DNA均可 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类 对于哺乳动物基因组DNA开说,每个反应需要的模板量是1g,对于酵母染色体、细菌染色体和质粒等模板的通常用量分别是10ng、1ng、1pg,4. dNTP,dNTP在温度较高时容易失活, 因此需要-20下冰冻保存,以保证dNTP的质量。 在PCR反应中, dNTP浓度应为200 250mol/L, 尤其重要的是4种dNTP的体积浓度要相等, 否则就会引起错配 过低浓度降低PCR产量,过高浓度的dNTP(大于4mmol)可能会淬灭Mg2+,从而抑制PCR

Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度,6.维持pH的缓冲液,室温下pH调到8.38.8的Tris缓冲液常用于PCR反应,浓度在10mmol66mmol,当72时(延伸温度),反应缓冲液的pH会降到约7.2,缓冲液中加入KCl,可以促进引物的退火,五、PCR的类型,标准PCR 热启动PCR 反向PC

可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列;用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA;建立基因组文库。,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,2)不对称PCR 目的:扩增产生特异长度的单链DNA。 方法:采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限

9、制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途:制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,高浓度引物,低浓度引物,3)多重PCR:在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,4)实时定量PCR(real-time PCR): 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的,特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积荧光值,可以很好的推算模板的起始浓度,实时PCR技术原理,探针设计一般应符合以下条件: 探针长度应在204

10、0个碱基左右,保证结合特异性。 GC碱基含量在40%60%,避免单核苷酸序列的重复。 避免与引物发生杂交或重叠。 探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度,因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。 另外,探针的浓度、探针与模板序列的同源性,探针与引物的距离都对实验结果有影响。,6、PCR反应流程,1、温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法,双链DNA在9095变性,再迅速冷却至4060退火,然后快速升温至7075延伸, 对于较短靶基因(长度100300bp)可采用二温度点法, 将退火与延伸温度合二为一,一般采用94变性,65左右退火与延伸。,

11、 变性温度与时间:,一般9394,1min足以使模板变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。, 退火(复性)温度与时间:,退火温度是影响PCR特异性的重要因素 退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基因序列的长度 对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55作为选择最适退火温度的起点较为理想,在Tm值允许范围内,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性, 延伸温度与时间:,延伸温度:一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间:根据待扩增片段长度而定

12、 1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min(足够) 34kb的靶序列需34min 扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些,2、循环次数,循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数:选在30次左右 循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多,七、PCR产物检测,琼脂糖凝胶电泳最常用 聚丙烯酰胺凝胶电泳 层析技术 高效液相色谱(HPLC) 离子交换层析(IEC) 分子杂交 限制性内切酶酶切分析 PCR扩增产物的直接测序,八、常见问题分析,不出现扩增条带 分析原因:模板、酶失活或污染、引物对的质量和浓度、PCR产物电泳检测时间一般为48h内 2. 假阳性 分析原因:模板或扩增产物的交叉污染 3. 非特异性扩增带 分析原因:引物与靶序列未完全互补或引物聚合形成二聚体、镁离子浓度过高、退火温度过低、酶不合格或酶量过多 4. 出现片状拖尾或涂抹带 分析原因:模板降解、酶不合格或酶量过多、镁离子浓度过高、退火温度过低、dNTP浓度过高、循环数过多,九、PCR技术应用领域,研究 基因克隆,DNA测序,分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测,诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建,DNA测序,表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他,谢 谢 观 赏,

一、故事:关于PCR技术的那些事

PCR的发明人,一般公认是穆里斯(K. Mullis),他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。穆里斯的出身是生物化学家,1972在加州大学伯克利分校取得博士学位,专长有机合成。一早他就表现出桀骜不驯的性格,在那嬉皮的年代,吸食自制的迷幻药不算太稀奇,穆里斯也乐于此道。更让人难以想象的是,他在经历迷幻药之旅的过程中,居然想出了某个解释大爆炸宇宙学的理论,写了出来投稿到《自然》周刊,居然登了出来。

PCR点子的诞生,根据穆里斯自己的说法,那是在1983年春天的一个周五晚上,他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车,一段DNA反复复制的景像,在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法,应该有人提出过,但搜索文献后却发现没有[1]。这次“顿悟”后来也成就了穆里斯本人也成就了分子生物学。

穆里斯的文章两度遭退稿后,有人建议投给《酶学方法》(Methods of Enzymology),主要是因为有人与该刊主编吴瑞相熟,较好沟通,同时PCR的性质也适合该强调方法学的刊物。于是,穆里斯的文章终于得到发表,只不过整整晚了一年,到1987年初才问世。这篇文章只有穆里斯及另一位技术员两人挂名。

二、解释:PCR技术名词

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